Artigo de método

Desenvolvimento de um modelo eficiente de expansão de tecido murino para pesquisa em regeneração da pele

DOI:

10.3791/69865

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6 de março de 2026

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Tenth People's Hospital, Tongji University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa apresenta um protocolo prático e eficiente para estabelecer um modelo de expansão contínua de tecidos em ratos, facilitando assim a investigação dos mecanismos e o avanço técnico na regeneração da pele.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A regeneração da pele é essencial para a cicatrização de várias feridas superficiais e pode ser promovida por estimulação mecânica. A expansão do tecido é uma estratégia amplamente utilizada para acelerar a regeneração da pele por meio de estiramento mecânico controlado; no entanto, sua eficácia clínica é frequentemente limitada por uma incompatibilidade entre a carga mecânica e a capacidade regenerativa da pele. Para enfrentar essa limitação, é urgentemente necessário o desenvolvimento de um modelo animal padronizado de expansão tecidual. Neste estudo, estabelecemos um modelo de expansão de tecido em ratos Sprague-Dawley. Após a implantação dorsal de um expansor de tecido de 10 mL, 5 mL de soro fisiológico foram injetados imediatamente após a cirurgia. Após um período de recuperação de duas semanas, os animais passaram por um regime de injeções de soro salino duas vezes por semana (10 mL por sessão). A cinética de expansão apresentou uma tendência característica de crescimento rápido da pele seguida de uma desaceleração gradual. Nos estágios mais avançados, foram observadas complicações graves, como necrose cutânea, degradação dos tecidos e exposição a expansores. Este trabalho estabelece uma estrutura pré-clínica reprodutível que imita de perto os processos fisiológicos e patológicos da expansão do tecido humano, fornecendo um modelo fundamental para investigar mecanismos regenerativos e otimizar protocolos clínicos.

Introdução

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A pele serve como a primeira linha de defesa do corpo, fornecendo proteção mecânica e prevenindo a perda de água, além de desempenhar papéis cruciais na regulação da temperatura, resposta a estímulos externos e regulaçãoimunológica 1. Feridas na pele são comuns na prática clínica, resultantes de traumas, infecções microbianas, danos químicos e resseçãocirúrgica 2. Enquanto feridas pequenas podem cicatrizar com aparência normal, lesões grandes geralmente deixam cicatrizes fibróticas severas que prejudicam a função dos tecidos e podem até se tornarfatais. A enxerta autóloga de pele em espessura total é amplamente considerada o padrão ouro para o manejo de feridas grandes e prevenção decicatrizes 4. No entanto, adquirir pele enxertável suficiente continua sendo um desafio clínico crítico. Consequentemente, o desenvolvimento de tecnologias inovadoras de regeneração da pele emergiu como um foco central nos campos da medicina regenerativa ebiomateriais 5.

Desde que Neumann introduziu pela primeira vez o princípio da expansão do tecido em 1957, implantando um balão de polietileno na região mastoide pós-auricular para reconstruir uma deformidade auricular6, essa técnica evoluiu significativamente. Hoje, é um dos métodos mais amplamente adotados na cirurgia reconstrutiva e continua sendo uma abordagem vital para tratar defeitos extensos da pele. Especificamente, a expansão do tecido gera tecido autólogo adicional ao recrutar pele adjacente e estimular aregeneração 7. Impulsionada por estimulação mecânica, a pele recém-formada se assemelha muito à pele nativa tanto em aparência quanto em estrutura, tornando-a ideal para aplicaçãoclínica 8. No entanto, devido a um descompasso entre a magnitude da força de carga e a taxa de crescimento da pele no estágio tardio, a quantidade de pele colhida se mostra insuficiente para a cobertura de feridas emlarga escala 9. Além disso, o avanço da tecnologia de expansão tecidular é dificultado por eficácia de expansão subótima, complicações graves, métricas quantitativas de avaliação incompletas e mecanismos moleculares poucocaracterizados. Dada a complexidade das redes regulatórias in vivo, modelos animais adequados de expansão tecidular são essenciais para recapitular fielmente as respostas fisiológicas e patológicas dos tecidos cutâneos à estimulação mecânica.

Atualmente, modelos murinos (camundongo e rato) e suínos são a escolha predominante para estudos in vivo 11. Modelos de expansão dorsal ou cabeludo de camundongos são amplamente utilizados devido à facilidade de operação; no entanto, a pele é fina demais para tolerar expansão prolongadaou contínua 12. O modelo de expansão dorsal do rato é adequado para expansão contínua devido ao seu extenso espaço subcutâneo, mas a falta de um protocolo definitivo para terminar a expansão limita sua aplicabilidadeclínica 13,14. Embora a pele suína compartilhe o maior grau de homologia com a pele humana, sua menor elasticidade resulta em respostas retardadas ao estiramento mecânico, e a necessidade de sedação profunda durante o processo torna a manipulação experimental consideravelmente maisdesafiadora 15. Portanto, desenvolver um modelo adequado de expansão contínua que imite o processo clínico continua sendo um desafio científico.

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo de expansão contínua da pele em ratos. Brevemente, um expansor de silicone de 10 mL foi inserido na região dorsal de ratos Sprague-Dawley (SD), e 5 mL de soro fisiológico foram injetados imediatamente após a cirurgia. Após um período de recuperação de duas semanas, 10 mL de soro fisiológico foram administrados duas vezes por semana até atingir um volume acumulado de 155 mL, momento em que foi observado um declínio significativo na geração da pele, sugerindo o esgotamento da capacidade regenerativa. O esgotamento regenerativo indica um declínio crítico na capacidade regenerativa da pele, caracterizado em nível celular pela diminuição do potencial proliferativo e pela degradação da matrizextracelular 16. Macroscopicamente, isso se manifesta como uma deterioração marcante na textura da pele, apresentando-se como afinamento da pele, isquemia e estrias distensas, podendo evoluir para necrose e degradação dostecidos 17. Além de sua simplicidade técnica, esse modelo pré-clínico replica com sucesso a expansão contínua da pele, permitindo que pesquisadores investiguem diferentes estágios de expansão adaptados a objetivos específicos de pesquisa. Esse método de modelagem também pode ser aplicado a ratos geneticamente modificados, facilitando a elucidação das principais funções genéticas e, assim, revelando os mecanismos subjacentes. Além disso, a ampla área superficial da pele dorsal facilita um desenho de estudo autocontrolado, permitindo que tanto tratamentos experimentais quanto de controle sejam aplicados no mesmoanimal 18. Coletivamente, esse modelo fornece uma ferramenta útil para investigar mecanismos específicos envolvidos na expansão dos tecidos e contribui para superar as limitações tecnológicas atuais.

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Protocolo

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Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética do Nono Hospital Popular de Xangai (Nº SH9H-2025-A1673-1) e conduzida de acordo com o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Preparação

  1. Aclimate todos os ratos SD por 7 dias antes do estudo. Ratos de SD domésticos em uma instalação animal com ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão. Forneça uma dieta padrão à base de trigo/soja e água de forma espontânea durante todo o experimento.
  2. Projete expansores de tecido semicirculares de 10 mL para uso experimental (Figura 1A), que consistem em um balão expansível, uma porta de injeção e um cateter conjuntivo. Esterilize os expansores usando irradiação por feixe de elétrons (25 kGy). Antes da cirurgia, verifique a integridade de cada expansor para garantir a segurança. Injete 10 mL de soro fisiológico pela porta de injeção, depois observe a permeabilidade do cateter conectivo e a expansão para confirmar a ausência de vazamento de água.
    NOTA: Drene o soro fisiológico normal pré-injetado.

2. Cuidados pré-operatórios e intraoperatórios com animais

  1. Adquira ratos machos SD, de 6 a 8 semanas de idade, com peso de 240 a 260 g.
  2. Anestesiar os ratos SD por inalação de isoflurano. Coloque os ratos na câmara de indução e induza anestesia usando isoflurano a 5% a uma vazão de 3 L/min. Mantenha a anestesia durante a operação usando isoflurano a 2% com uma vazão de 1,5 L/min.
  3. Coloque os ratos SD anestesiados em um algodão para manter o calor durante a cirurgia e coloque-os em um almofado aquecido (aproximadamente 28 °C) por 20 minutos após a recuperação da anestesia para evitar hipotermia.
  4. Use o reflexo de retirada do beliscão do dedo para avaliar a profundidade da anestesia.
    NOTA: Monitore a frequência e o padrão respiratório, a temperatura corporal e a cor da pele dos dedos dos dedos dos ratos SD anestesiados.

3. Implantação de expansores de tecido

  1. Raspe a pele dorsal dos ratos SD com um aparador de pelo. Avalie a cor da pele, textura e presença de quaisquer lesões para determinar a adequação para expansão.
  2. Desenhe uma linha pontilhada horizontal na área central das costas para marcar a localização da incisão. Desinfete a área raspada com álcool 75% e cubra com uma cortina de abertura estéril.
  3. Administre soro fisiológico normal por via subcutânea ao longo da linha marcada usando uma seringa de 1 mL com uma agulha de 30 g (0,31 mm de diâmetro), e então realize uma incisão horizontal com bisturi. Realize uma dissecação extensa do tecido subcutâneo acima e abaixo da incisão ao longo da fáscia muscular dorsal. Crie um bolso grande o suficiente para acomodar o balão de expansão e a porta de injeção usando pinças mosquito. Posicione o polo inferior do balão de expansão a 3-5 cm da incisão, com o ápice voltado para a camada de pele e a placa base apoiada no músculo. Além disso, suture a fáscia de ambos os lados adjacentes à junção do cateter conjuntivo e da porta de injeção para estabilizar a porta. Ajuste as posições do balão e da porta de injeção para garantir que o tubo de conexão esteja livre de curvas ou dobras acentuadas (Figura 1B).
    NOTA: A injeção normal de soro fisiológico facilita a incisão cutânea e a identificação do plano anatômico. Oriente a porta de injeção com o lado macio voltado para a camada de pele para permitir as injeções de solução subsequentes.
  4. Feche as incisões usando pontos 4-0 interrompidos. Em seguida, injete 5 mL iniciais de soro fisiológico com uma agulha para couro cabeludo de 25 g (0,5 mm de diâmetro).
    NOTA: Suture cuidadosamente a incisão para evitar perfurar o expansor com a ponta da agulha. Insira a agulha do couro cabeludo verticalmente na porta de injeção e retire-a verticalmente.
  5. Deixe o rato SD se recuperar da anestesia e coloque-o em uma gaiola individual.

4. Processo de expansão contínua

  1. Permita que ratos SD portadores de expansores se recuperem por 2 semanas, garantindo a cicatrização completa da incisão. Marque uma caixa de linha tracejada de 2,5 × 2,5 cm na área de expansão para facilitar a visualização das alterações na pele (Figura 2A).
  2. Anestesie ratos SD usando o método descrito nos passos 2.2 a 2.4. Raspe a região de expansão para facilitar a observação. Interrompa o processo de expansão imediatamente se a expansão da pele for complicada por infecção, equimose ou necrose.
    NOTA: Raspe a área em expansão pelo menos uma vez por semana para acomodar o rápido crescimento de pelos.
  3. Raspe a região ao redor da porta de injeção e desinfete usando álcool 75%. Fixe o porto, depois injete 10 mL de soro fisiológico normal lentamente usando uma agulha de 25 g para o couro cabeludo. Pressione o ponto de injeção com gaze asséptica por 2 minutos para confirmar a hemostasia.
  4. Deixe ratos SD se recuperarem da anestesia, coloque-os em um tapete aquecido por 20 minutos e depois transfira-os para as gaiolas individuais.
  5. Injete soro fisiológico normal duas vezes por semana. Monitore complicações relacionadas à expansão durante o acompanhamento, incluindo vazamento do expansor, dobramento do tubo de conexão, exposição ao expansor, equimose cutânea, necrose, infecção e degradação (Figura 2E). Investigue possíveis dobras de cateter caso haja resistência durante a injeção de soro fisiológico. Suspeite de vazamento no expansor se o balão de expansão amolecer. Identifique equimose localizada como sinal de perfusão comprometida, e escurecimento da pele como necrose. Suspeita de infecção ao observar vermelhidão localizada marcada, inchaço e temperatura local elevada da pele. Classifique feridas que não cicatrizam como degradação da pele e examine possíveis exposições a expansores.
    NOTA: Examine a pele expandida antes e depois de cada injeção para facilitar a detecção precoce de eventos adversos. Interrompa imediatamente o procedimento de expansão se ocorrerem complicações graves, incluindo vazamento do expansor, degradação ou necrose da pele e exposição ao expansor, para maximizar o salvamento da pele viável.

5. Medição da área de expansão e coleta de peles regeneradas

  1. Meça a área de expansão usando um Scanner 3D de Alta Precisão. Ao escanear a pele acima do expansor, a área superficial da região escaneada é calculada automaticamente (Figura 2B).
    NOTA: Realize exames em ratos SD anestesiados antes de cada injeção.
  2. Fotografe a pele expandida usando uma câmera digital; medir e pesar a área demarcada pela caixa de linha tracejada, e registrar as mudanças na área da superfície (Figura 2C) e na massa (Figura 2D).
  3. Eutanasiar ratos SD por exposição ao excesso de dióxido de carbono no final do experimento.
    NOTA: Nesta pesquisa, defina o desfecho como um volume total de injeção de 155 mL para replicar todo o processo de expansão na prática clínica.
  4. No pós-mortem, marque áreas de amostragem tanto na pele expandida quanto na pele normal adjacente. Após aspirar metade do volume total do expansor, incise a pele sobre a porta de injeção horizontalmente usando uma tesoura. Disseca extensivamente o plano entre o expansor e a pele expandida usando pinças mosquito para permitir a remoção completa e intacta do expansor. Retire amostras de pele usando tesoura e corte o tecido ao meio. Fixe-as em solução de paraformaldeído a 4% e faça o processo para coloração histológica.
    NOTA: Demarque as áreas de interesse para amostragem antes da remoção do expansor para evitar identificação equivocada devido à retração da pele, garantindo a identificação precisa das regiões de tratamento localizadas (Figura 3A).
  5. Coloque os cadáveres coletados separadamente em sacos amarelos de resíduos médicos. Descarte expansores, seringas e gazes usadas em sacos amarelos de resíduos médicos. Descarte lâminas, agulhas e outros objetos cortantes em recipientes específicos para objetos afiados.
    NOTA: Todo o descarte de resíduos neste estudo está em conformidade com as regulamentações de manejo do Centro Experimental de Animais do Nono Hospital Popular de Xangai.

6. Coloração histológica da pele

  1. Infiltre amostras de pele em parafina, corte em seções de 5 μm e coloque sobre lâminas adesivas.
  2. Use coloração por hematoxilina e eosina (coloração HE) para avaliar a espessura da pele (Figuras 3B,C) e coloração tricromática de Masson para avaliar a deposição de colágeno (Figuras 3D,E). Escaneie as seções usando um scanner de slides inteiro e analise com o software ImageJ versão 1.54.
  3. Use coloração por imunofluorescência CD31 para avaliar a vascularização. Aplique anticorpos primários e incube durante a noite a 4 °C, utilize anticorpos secundários conjugados com FITC e examine sob microscópio de fluorescência (Figura 3F,G).
  4. Analise dados quantitativos usando o software GraphPad Prism versão 10.0 e apresente os resultados como média ± desvio padrão (SD). Realize comparações estatísticas usando o teste t de Student, definindo significância estatística como *p < 0,05.

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Resultados

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Neste estudo, estabelecemos um protocolo padrão para um modelo de expansão contínua de tecido. Após confirmar a segurança do expansor (Figura 1A), ele foi implantado cirurgicamente subcutâneo na região dorsal dos ratos SD. Sua superfície de inflação estava posicionada em direção à pele. Para evitar o deslocamento do expansor, o ponto de conexão entre o cateter e a porta de injeção foi fixado à fáscia muscular (Figura 1B). Após as injeções de soro fisiológico que...

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Discussão

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A expansão de tecidos surgiu como uma técnica amplamente utilizada para gerar pele adicional que se assemelha muito à pele saudável vizinha em termos de textura ecor 19. Ele tem sido aplicado em diversas condições clínicas, incluindo reparo de cicatrizes, reconstrução mamária e reconstrução após a resseção de tumores na superfície corporal20. No entanto, a expansão tecidular a longo prazo ainda é um desafio crítico, principalmente devido à ...

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Divulgações

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este estudo é patrocinado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Bolsa nº 82372536, 82572898, 82472543), Centro de Pesquisa em Cirurgia Plástica de Xangai do Centro Prioritário de Pesquisa de Xangai (2023ZZ02023), Programa de Desenvolvimento Juvenil "Estrelas em Ascensão dos Talentos Médicos" de Xangai (Programa de Especialistas em Talentos Médicos Juvenis), Programa Especial de Pesquisa Clínica da Indústria de Saúde da Comissão Municipal de Saúde de Xangai (Bolsa nº 20244Y0031).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo CD31Abcam Shanghai Trading Co., Ltdab182981Coloração IHC
Instrumento de irradiação por feixe de elétronsTongwei Xinda Technology (Jiangsu) Co,. LtdAcelerador de elétrons de alta energia (10 MeV, 24 kW)Esterilização
Anticorpo secundário conjugado com FITCProteintech Group, IncSA0003-2Coloração IHC
Graghpad Prism software GraphPad SoftwareVersão 10.0Análise estatística
Kit de Coloração de Hematoxilina e EosinaBeyotime Biotech IncC0105SColoração histológica
Scanner 3D de Alta Precisão3D BRILHANTEEinScan Pro 2X V2Medida de área  
Software Image JInstitutos Nacionais de SaúdeVersão 1.54Análise estatística
Kit de Tingimento Tricromo da MassonBeyotime Biotech IncC0189SColoração histológica
Expansores de tecidoShanghai Winner Plastic Surgery Products Co., Ltd.N/APersonalização especial

Referências

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