Identificação Computacional da Fosforilase de Nucleosídeos Purinas e do Receptor de Estrogênio 1 como biomarcadores de lesão hepática induzida por paracetamol

Resumo

Analisamos computacionalmente dados de toxicologia em rede e transcriptômicos para identificar biomarcadores de lesão hepática induzida por paracetamol, revelando o receptor de estrogênio 1 e a purina nucleosídeo fosforilase como alvos diagnósticos.

Resumo

A lesão hepática induzida pelo paracetamol é uma preocupação significativa de saúde pública, mas faltam biomarcadores confiáveis e precoces. Este estudo teve como objetivo identificar biomarcadores candidatos para hepatotoxicidade induzida por acetaminofeno usando uma abordagem computacional que integra toxicologia de rede, transcriptômica e aprendizado de máquina. Os possíveis alvos do paracetamol foram previstos usando plataformas online, resultando em 140 candidatos. Genes relacionados à hepatotoxicidade (n = 657) foram retirados dos GeneCards, e 38 genes sobrepostos foram identificados. Genes diferencialmente expressos do conjunto de dados GSE74000 (n = 1.978) foram analisados. O enriquecimento funcional foi realizado para identificar vias relevantes. Um modelo de floresta aleatória priorizou 20 genes de características, e o acoplamento molecular avaliou as afinidades de ligação com paracetamol. As DEGs estavam principalmente associadas à disfunção mitocondrial e à biogênese dos ribossomos. O enriquecimento funcional destacou o metabolismo xenobiótico e as vias de estresse oxidativo. O receptor de estrogênio 1 e a fosforilase de nucleosídeos purina foram genes de destaque de destaque, apresentando diferenças significativas de expressão e fortes interações de acoplamento com o paracetamol. Este protocolo computacional prevê sistematicamente biomarcadores candidatos para lesão hepática induzida por paracetamol, fornecendo insights moleculares e candidatos para validação experimental.

Introdução

O paracetamol (APAP) é um antipirético e analgésico amplamente administrado, mas a ingestão excessiva pode levar a hepatotoxicidade severa e potencialmente insuficiência hepática ^1,2. Espera-se que o dano ao fígado ocorra após o metabolismo do medicamento, e o metabólito tóxico subsequente é a N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI), que resulta em estresse oxidativo mitocondrial, alteração da respiração mitocondrial e a transição da permeabilidade mitocondrial, causando eventualmente a morte necrótica, em vez de apoptótica, dos^{hepatócitos 3,4}. A overdose de APAP continua sendo a principal causa de insuficiência hepática aguda (ALF) em muitos países. Dados epidemiológicos mostram que a toxicidade do APAP representa quase 50% dos casos de ALF nos Estados Unidos e é responsável por milhares de internações emergenciais anualmente. Tendências semelhantes foram relatadas globalmente, com a hepatotoxicidade associada à APAP constituindo uma grande proporção dos casos de lesão hepática induzida por medicamentos (DILI^{) 5,6}. A alta morbidade, o risco de transplante de fígado e a carga substancial de cuidados de saúde destacam a necessidade urgente de melhorar biomarcadores diagnósticos e de uma compreensão mecanicista dos danos hepáticos induzidos pelo APAP. Especificamente, a APAP é absorvida e principalmente metabolizada no fígado por meio de glucuronidação e sulfatação, formando conjugados solúveis em água que são excretados na urina. Uma fração menor (10-15%) passa por hidroxilação mediada pelo Citocromo P450 (CYP450) (por meio de enzimas como CYP1A2, CYP2E1 e CYP3A4) para produzir o intermediário reativo NAPQI, que se liga ao glutationa e é excretado via bile ^7,8. Devido à capacidade limitada das vias de glucuronidação e sulfatação, a dosagem excessiva leva ao aumento da formação de NAPQI, enquanto simultaneamente esgota as reservas hepáticas^{de glutationa 9}. Uma vez que a glutationa é esgotada a níveis críticos, a NAPQI começa a se ligar covalentemente às macromoléculas celulares, danificando os^{hepatócitos 10}. A toxicidade relacionada à overdose do APAP está aumentando, com uma estimativa de 50.000 a 80.000 visitas anuais ao pronto-socorro só nos^{Estados Unidos, 11}. Como o estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial são centrais para a hepatotoxicidade induzida pela APAP, a desregulação da ESR1 pode influenciar indiretamente a sobrevivência dos hepatócitos e as respostas inflamatórias durante a lesão da APAP. A toxicidade por APAP induz estresse metabólico e ativação inflamatória nos hepatócitos. Alterações na expressão da PNP podem refletir alterações no metabolismo dos nucleotídeos e respostas relacionadas ao sistema imunológico durante danos hepáticos induzidos pelo APAP.

Os primeiros relatórios sobre hepatotoxicidade induzida por APAP focaram principalmente em sintomas clínicos e alterações patológicas no fígado e rins, fornecendo a base para estudos posteriores sobre os mecanismos de morte celular e inflamação na toxicidade por^{APAP 12,13}. Um avanço chave foi a identificação de aminotransferases séricas (por exemplo, ALT e AST) como biomarcadores de lesão hepática. Com o advento de modelos de cultura celular e ferramentas de bioinformática, as pesquisas atuais sobre hepatotoxicidade APAP se expandiram para incluir biomarcadores diagnósticos, prognósticos e^mecanicistas 14,15,16. No entanto, obter amostras suficientes de soro ou plasma de pacientes com overdose APAP, especialmente não sobreviventes, continua sendo um^{desafio 17}. Como resultado, há uma necessidade urgente de explorar novos biomarcadores diagnósticos, prognósticos e mecanicistas usando abordagens inovadoras para melhor estudar a hepatotoxicidade induzida pela APAP.

A toxicologia de redes é um campo emergente que constrói modelos de redes para analisar dados toxicológicos a partir dos bancos de dados de^{compostos 18,19}. Ele ajuda a caracterizar a toxicidade de substâncias, identificar mecanismos e prever alvos importantes^20,21. Atualmente, a toxicologia em redes é amplamente reconhecida como uma ferramenta valiosa na pesquisa científica. Por exemplo, Tengjiao Qu et al. integraram toxicologia em redes com transcriptômica para identificar novos mecanismos neurotóxicos do éter 2,2',4,4'-tetrabromodifenil (um retardante comum de chama) e seus potenciais biomarcadores²². Estudos recentes também destacam a importância dessa abordagem na avaliação da toxicidade de produtos^{naturais 23}. No entanto, esse paradigma inovador de pesquisa ainda precisa ser aplicado para explorar os potenciais mecanismos da hepatotoxicidade induzida pela APAP e identificar novos biomarcadores associados à sua toxicidade.

O IntelliGenes foi desenvolvido como um pipeline de aprendizado de máquina para a descoberta de biomarcadores^{multigenômicos 24}. Ele integra métodos estatísticos com ML avançado para calcular escores do I-Gene e criar perfis individualizados de biomarcadores. Os resultados mostram maior precisão na previsão de características complexas e na obtenção de insights personalizados sobre doenças. As limitações incluem dependência da qualidade dos dados, validação limitada em populações diversas e a necessidade de testes clínicos mais amplos.

O destaque é que os biomarcadores atuais do adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) são insuficientes, e propor organoides derivados do paciente (PDOs) como plataformas funcionais para o desenvolvimento de^{biomarcadores 25}. Ele avalia fenotipagem de fármacos baseados em PDO, modelagem de quimiorresistência, sistemas de cocultura e perfil proteômico/metabolômico. Os achados mostram que as PDOs capturam melhor a biologia relevante para o tratamento, mas as limitações incluem variabilidade técnica, replicação limitada do microambiente, longos tempos de cultivo e desafios na integração clínica^{rotineira 26,27}.

O objetivo do estudo foi avaliar métodos proteômicos analíticos e a função da bioinformática na identificação de biomarcadores²⁸. Avaliou como ferramentas computacionais auxiliavam na interpretação de dados e examinava técnicas de análise proteica baseadas em EM. Os resultados demonstraram maior descoberta de biomarcadores e novos alvos de tratamento, mas também deixaram claro que identificar proteínas de muito baixa abundância continuava sendo desafiador, reduzindo assim a sensibilidade das técnicas proteômicas existentes. Embora vários biomarcadores diagnósticos, mecanicistas e prognósticos para hepatotoxicidade induzida por APAP estejam bem estabelecidos, esses marcadores refletem principalmente lesão hepatocelular ou disfunção mitocondrial após a toxicidade^{ocorrer 29,30}. Em contraste, o presente estudo teve como objetivo identificar reguladores transcriptômicos que possam modular a suscetibilidade ou a resposta do hospedeiro à exposição ao APAP. ESR1 e PNP foram, portanto, investigados como marcadores regulatórios exploratórios, e não como biomarcadores diagnósticos clássicos.

Para abordar as limitações inerentes às metodologias atuais — especificamente a variabilidade cultural dos PDOs e as questões de sensibilidade da proteômica — este estudo emprega uma estrutura computacional integrada que inclui toxicologia de rede, transcriptômica, aprendizado de máquina e acoplamento molecular. Essa estratégia multi-níveis contorna a necessidade de grandes coortes ou sistemas experimentais complexos ao aproveitar a previsão computacional e a validação cruzada multiômica. A justificativa para essa abordagem combinatória é que cada técnica reforça as outras para minimizar falsos positivos: a toxicologia de redes fornece primeiro uma previsão em nível de sistema de alvos relacionados à APAP e vias tóxicas; A análise transcriptômica posteriormente valida quais desses genes previstos estão genuinamente desregulados durante a hepatotoxicidade; algoritmos de aprendizado de máquina então priorizam os biomarcadores candidatos mais informativos desse pool de alta confiança; e, por fim, o acoplamento molecular oferece suporte mecanicista ao confirmar a viabilidade de interações diretas entre o APAP e os alvos proteicos identificados.

Juntos, esses passos criam um pipeline coerente e baseado em evidências para a previsão de biomarcadores. Essa combinação dessas quatro estratégias minimiza previsões falsos positivos e aumenta a confiança em encontrar ESR1 e PNP como alvos fortes na hepatotoxicidade induzida por APAP. Nesta pesquisa, seria necessário ter GSE74000 conjuntos de dados de expressão gênica que possuam um bom poder estatístico, pelo menos no mínimo três réplicas biológicas de qualquer condição com metadados completos. Os arquivos de expressão bruta teriam que ser processados de maneira padrão, que consiste em correção de fundo, normalização (normalização de quantis, etc.) e filtragem de genes com baixa expressão. R era usado para realizar todas as análises com pacotes como o limma e ferramentas externas como GeneCards e Cytoscape, que permitem a construção de uma rede. Embora o pipeline facilite a priorização de biomarcadores com base em análise sistemática, os resultados são limitados pela qualidade do conjunto de dados, pelos efeitos em lote e pela ausência de validação experimental e in vivo , o que pode afetar a generalizabilidade.

Protocolo

Este protocolo descreve um método computacional para definir os possíveis biomarcadores de danos hepáticos induzidos por paracetamol, que aproveita toxicologia de rede, transcriptômica, aprendizado de máquina e acoplamento molecular (Figura 1). O protocolo é direcionado a pesquisadores que têm acesso a ferramentas de bioinformática, conjuntos de dados transcriptômicos e softwares de acoplamento molecular.

Procedimento

Passo 1: Identificação dos alvos do paracetamol
Recupere a representação SMILES do paracetamol (APAP) no PubChem. Use plataformas online (ChEMBL, SwissTargetPrediction, STITCH, SEA) para prever potenciais alvos moleculares do APAP. Integre e desduplique os alvos previstos para gerar uma lista de 140 alvos APAP de alta confiança.

Passo 2: Identificação de Alvos de Hepatotoxicidade
Recupere genes relacionados à hepatotoxicidade do banco de dados GeneCards. Compile e desduplique a lista para gerar um conjunto não redundante de 657 genes relacionados à hepatotoxicidade. Identifique genes sobrepostos entre alvos APAP e genes relacionados à hepatotoxicidade usando um diagrama de Venn.

Passo 3: Pré-processamento de Dados Transcriptômicos
Baixe o conjunto de dados GSE74000 da GEO. Pré-processar dados brutos de expressão usando DESeq2: remover genes de baixa expressão, normalizar usando fatores de tamanho e aplicar transformação estabilizadora de variância (VST). Realize análise diferencial de expressão usando Limma e DESeq2, com limiares de p-valor ajustado < 0,05 e |_{log 2}FC| > 1.

Passo 4: Análise de Enriquecimento Funcional
Envie genes sobrepostos para o STRING para análises de Ontologia Gênica (GO), via KEGG, expressão de tecidos e correlação de doenças. Visualize resultados de enriquecimento funcional usando gráficos de bolhas e mapas de calor.

Passo 5: Aprendizado de Máquina para Seleção de Genes de Recursos
Aplique um classificador de Floresta Aleatória (n_estimators=500, max_depth=10) para priorizar genes de características dos genes sobrepostos APAP e de hepatotoxicidade. Avalie o desempenho do modelo usando erros Out-of-Bag (OOB) e pontuações de importância de características. Selecione os 20 principais genes de características para análise adicional.

Passo 6: Acoplamento Molecular
Recuperar a estrutura APAP (CID 1983) do PubChem e receptores de proteínas (ESR1: PDB ID 1SJ0, PNP: PDB ID 1V2H) a partir do PDB. Prepare arquivos de ligantes e receptores: converta para o formato PDB, adicione hidrogênios polares, atribua cargas e salve como arquivos PDBQT. Defina a grade de acoplamento no AutoDock Tools, cobrindo o local ativo da proteína. Realize acoplamento molecular usando AutoDock Vina, com exaustividade definida para 8, e analise afinidades e interações de ligação. Visualize os resultados do docking usando o PyMOL para analisar conformações de ligação e interações de chaves.

Passo 7: Análise Estatística
Determine a significância estatística usando testes t e ajuste os valores p para múltiplas comparações usando o método^{Benjamini-Hochberg 31}. Visualize associações estatisticamente significativas usando mapas de calor e gráficos de dispersão.

Materiais e Métodos

Identificação de alvos do paracetamol
Para identificar potenciais alvos moleculares do APAP, primeiro recuperamos sua representação SMILES do banco de dados PubChem. Em seguida, utilizamos várias plataformas online, incluindo o Laboratório Europeu de Biologia Molecular Química (ChemBL)³², Swiss Target^{Prediction 33}, Search Tool for the Interaction of Chemicals and Targets (STITCH⁾³⁴ e a abordagem de conjunto de similaridade (SEA⁾³⁵, para prever seus possíveis alvos. Após integrar os resultados dessas ferramentas, selecionamos um conjunto de metas de alta confiança para o APAP. A Tabela 1 define categorias-chave de genes utilizadas neste estudo, esclarecendo seus papéis na análise de dados e interpretação biológica. O uso consistente desses termos garante uma comunicação clara dos nossos resultados.

Identificação de alvos de hepatotoxicidade
Genes potenciais associados à hepatotoxicidade foram recuperados do banco de dados GeneCards. Todos os genes identificados foram compilados, duplicatas removidas e uma lista não redundante foi gerada para análises posteriores. O conjunto de dados GSE74000 foi baixado do repositório GEO em 15 de março de 2024. Os dados brutos de expressão foram processados e normalizados usando o pacote limma (normalização quantil). A análise diferencial de expressão foi realizada usando modelagem linear com retração empírica de Bayes. Genes que atendem ao valor p ajustado < 0,05 (Benjamini-Hochberg FDR) e |log₂FC| > 1 foram considerados significativos. A visualização dos DEGs foi realizada usando gráficos de vulcão e mapas de calor gerados com ggplot2.

Pré-processamento de dados
Os dados brutos de contagem foram pré-processados usando DESeq2. Genes de baixa expressão foram removidos usando um limiar de detecção de CPM >1 em pelo menos 70% das amostras. A normalização do tamanho da biblioteca foi realizada usando fatores de tamanho DESeq2, conforme definido na equação (1):

(1)

Onde o fator de razão mediana e tamanho é denotado por s_j. Para estabilizar as relações média-variância, uma transformação estabilizadora de variância (VST) foi usada na equação (2):

(2)

As DEGs foram identificadas usando o teste de Wald com correção de Benjamini-Hochberg, considerando genes significativos se usados na equação (3):

(3)

O conjunto DEG derivado do DESeq2 foi definido como a equação (4):

(4)

Esse conjunto (X) foi usado na estratégia de consenso junto com a Tendência Limma (Y) e a Limma Voom (Z).

Construção da rede PPI
Diagramas de Venn foram usados para identificar genes comuns entre os alvos APAP e de hepatotoxicidade. Os genes sobrepostos foram então carregados no banco de dados Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING) para construir redes PPI.

Análise de enriquecimento funcional multidimensional
Primeiro, realizamos a Ontologia Genética (GO), a Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), a expressão tecidual e análises funcionais relacionadas a doenças dos genes sobrepostos para APAP e hepatotoxicidade usando o site STRING. Em seguida, realizamos análises de enriquecimento GO, KEGG e Análise de Enriquecimento de Conjuntos Gênicos (GSEA) (REACTOME) dos genes diferenciais para hepatotoxicidade usando as Ferramentas Acadêmicas de Sendo.

Análise de floresta aleatória
Aplicamos aprendizado de máquina para identificar os 20 principais genes de características a partir da sobreposição de genes APAP e de hepatotoxicidade nos dados do transcriptoma de hepatotoxicidade induzida pela APAP. Foi implementado um classificador de Floresta Aleatória, com 500 árvores (n_estimators=500), profundidade máxima de árvore de 10 (max_depth=10), mínimo 2 amostras necessárias para dividir um nó (min_samples_split=2) e o critério de impureza de Gini (critério='gini')³⁶. O desempenho do modelo foi avaliado usando o erro Out-of-Bag (OOB), onde um valor próximo de 0 indica maior precisão preditiva. As pontuações de importância das características foram calculadas e visualizadas com base na análise de Floresta Aleatória para classificar a contribuição de cada gene, conforme na equação (5).

(5)

N era o número total de amostras, y_i era o 1(·) era uma função indicadora, 1 se a condição fosse verdadeira e 0 caso contrário; foi o rótulo previsto da amostra iii usando apenas árvores onde o iii não foi incluído no treinamento.

Expressão diferencial de genes caracterizados
As diferenças de expressão dos genes de características nos dados transcriptômicos foram visualizadas usando gráficos de violino. Biomarcadores que apresentavam diferenças estatisticamente significativas foram identificados como potenciais novos biomarcadores de hepatotoxicidade induzida por APAP para investigação adicional.

Acoplamento molecular
Compostos de pequenas moléculas (CID 1983) foram recuperados do banco de dados PubChem, e os receptores proteicos ESR1 e PNP (IDs PDB 1SJ0 e 1V2H) foram baixados do Banco de Dados de Proteínas. As estruturas de ligantes foram convertidas para o formato PDB usando OpenBabel e pré-processadas no AutoDock Tools, adicionando hidrogênios polares, atribuindo cargas de Gasteiger, definindo ligações rotativas e economizando no formato PDBQT. Receptores proteicos foram preparados usando PyMOL removendo moléculas de água e ligantes cocristalizados, seguidos pela adição de hidrogênios polares e atribuição de cargas de Kollman usando ferramentas AutoDock, e salvos como arquivos PDBQT.

No acoplamento molecular, o software AutoDock foi usado para definir a grade de acoplamento que cobre o sítio ativo da proteína³⁷. A caixa da grade estava centrada nas coordenadas (x = XX·XX, y = YY· YY,z = ZZ· ZZ) com dimensões de 40 × 40 × 40 Å e espaçamento da grade de 0,375 Å, garantindo cobertura completa do bolso de encadernação. O AutoDock Vina foi empregado para calcular modos de ligação ligante-proteína e afinidades de ligação, com o parâmetro de exaustividade definido em 8, e as nove melhores posições de ligação foram geradas para cada ligante.

A validação do protocolo de acoplamento foi realizada reacoplando o ligando co-cristalizado no local ativo, obtendo um valor RMSD de < 2,0 Å, confirmando a confiabilidade do procedimento de acoplamento. Os resultados do acoplamento foram visualizados usando PyMOL para analisar conformações de ligação e interações chave, incluindo ligações de hidrogênio.

Simulações de acoplamento previram que o Composto X se encaixa no local de ligação da proteína Y, formando potenciais ligações de hidrogênio e contatos hidrofóbicos, com uma energia de ligação prevista de -8,5 kcal/mol.

Solução de problemas e possíveis modificações
Para melhorar a robustez e reprodutibilidade do fluxo de trabalho proposto, várias considerações de solução de problemas e possíveis modificações devem ser consideradas. Se um número inesperadamente baixo de genes diferencialmente expressos (DEGs) for identificado, os usuários são aconselhados a verificar o procedimento de normalização, confirmar a rotulagem precisa dos grupos e considerar ajustar a mudança de dobra |log2| limiar mantendo o controle adequado da taxa de falsas descobertas (FDR). Por outro lado, se um número excessivo de DEGs for obtido, aplicar cortes de FDR mais rigorosos ou filtrar genes de baixa variância antes da análise de expressão diferencial pode melhorar a especificidade.

Os efeitos em lote podem influenciar padrões de agrupamento em análises exploratórias, como a análise de componentes principais (PCA). Se as amostras se agruparem predominantemente por condição em lote e não por condição biológica, métodos de correção por lote (por exemplo, abordagens bayesianas empíricas como ComBat) devem ser aplicados, e os metadados da amostra devem ser cuidadosamente reavaliados para maior consistência.

Para a seleção de características baseada em Floresta Aleatória, altas taxas de erro Out-of-Bag (OOB) ou classificações instáveis de características podem indicar configuração de modelos subótima. Nesses casos, aumentar o número de árvores, ajustar o parâmetro mtry ou realizar repetidas execuções de modelo com seleção de características por consenso pode aumentar a estabilidade do modelo e a confiabilidade preditiva. Além disso, estratégias de validação cruzada podem ser empregadas para avaliar ainda mais a robustez dos modelos.

Para fortalecer a confiabilidade, os usuários podem opcionalmente repetir a análise usando limiares alternativos de DEG ou configurações de parâmetros de aprendizado de máquina e comparar a consistência dos genes de características identificados. Essas análises de sensibilidade ajudam a garantir que os principais achados não sejam direcionados por escolhas específicas de parâmetros e apoiam a reprodutibilidade do fluxo de trabalho entre conjuntos de dados transcriptômicos semelhantes.

Análises estatísticas
A significância estatística foi determinada usando um teste t, com os valores p reportados para comparação. Correlações estatísticas entre os níveis de expressão gênica e fenótipos relacionados à hepatotoxicidade foram avaliadas usando coeficientes de correlação de Pearson e Spearman, dependendo da normalidade dos dados. Os valores p foram ajustados para múltiplas comparações usando o método de Benjamini-Hochberg. Associações significativas foram visualizadas com mapas de calor e gráficos de dispersão, proporcionando uma avaliação robusta das relações transcriptômicas.

Resultados

Identificação de genes sobrepostos para APAP e hepatotoxicidade e sua análise funcional
Para determinar potenciais alvos moleculares do APAP e investigar seus papéis biológicos, as previsões foram geradas usando quatro ferramentas computacionais: ChEMBL, SwissTargetPrediction, STITCH e SEA. Após a remoção de entradas duplicadas e a integração de resultados sobrepostos, foi compilada uma lista não redundante de 140 alvos candidatos. Além disso, 657 genes relacionados à hepatotoxicidade foram extraídos ...

Discussão

APAP é um agente analgésico e antipirético frequentemente prescrito; No entanto, a ingestão excessiva pode resultar em hepatotoxicidade significativa, às vezes culminando em insuficiência hepática^{aguda 38}. Apesar dos avanços na elucidação dos mecanismos fisiopatológicos da lesão hepática induzida pela APAP, ainda há escassez de biomarcadores confiáveis para diagnóstico preciso, prognóstico e investigação mecanicista. Portanto, há uma necessidade urgente de identif...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bancos de Dados & Servidores Web
STRING	https://cn.string-db.org/		construção de redes PPI; Enriquecimento funcional
Ferramentas Acadêmicas Sendo	https://www.xiantaozi.com/		Análise de enriquecimento GO, KEGG e GSEA
PubChem	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/		Recuperação de estruturas químicas (APAP)
GeneCards	https://www.genecards.org/		Recuperação de genes relacionados à hepatotoxicidade
Banco de Dados GEO	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/		Recuperação de conjunto de dados transcriptômico (GSE74000)
ChEMBL	https://www.ebi.ac.uk/chembl/		Previsão de alvo
SwissTargetPrediction	http://www.swisstargetprediction.ch/		Previsão de alvo
STITCH	http://stitch.embl.de/		Previsão de interação
SEA	http://sea.bkslab.org/		Abordagem de conjunto de similaridade para previsão de alvos
Banco de Dados de Proteínas (PDB)	https://www.rcsb.org/		Recuperação da estrutura proteica (ESR1, PNP)
Software
R (Versão 4.x.x)	https://www.r-project.org/		Análise estatística e processamento de dados
Ferramentas AutoDock / Vina	http://autodock.scripps.edu/		Preparação e simulação de acoplamento molecular
PyMOL	https://pymol.org/		Visualização de estruturas moleculares
Citoscape	https://cytoscape.org/		Visualização de rede