Artigo de investigação

Ensaios de Clonalidade por Sequenciamento de Nova Geração: Validação Clínica para Monitoramento de Doença Residual Mínima em Mieloma Múltiplo

DOI:

10.3791/69890

⸱

21 de agosto de 2026

 ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este estudo avaliou um novo ensaio de clonalidade de BCR/TCR baseado em NGS (OriMIRACLE LTM) para a detecção de doença residual mínima em neoplasias linfoides, incluindo mieloma múltiplo (MM). Utilizando linhagens celulares e esfregaços clínicos, demonstrou-se uma >Taxa de detecção de 90% e concordância de 81,36% com citometria de fluxo. O ensaio oferece alta sensibilidade, prediz recidiva e auxilia nas decisões terapêuticas.

Resumo

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A detecção de doença residual mínima (DRM) é crucial para o manejo de malignidades linfoides. Este estudo apresenta o OriMIRACLE LTM, um novo ensaio de clonalidade do receptor de células B (BCR) e do receptor de células T (TCR) baseado em sequenciamento de nova geração (NGS) para detecção de DRM. Validamos o ensaio utilizando linhagens celulares e amostras clínicas, incluindo esfregaços residuais, de pacientes com mieloma múltiplo (MM). O ensaio de clonalidade BCR/TCR demonstrou uma taxa de detecção positiva superior a 90% em malignidades linfoides. Estudos de validação em pacientes com MM demonstraram uma taxa de concordância de 81,36% (48/59) entre citometria de fluxo multicolorida (MFC) e avaliação de resposta clínica na detecção de células tumorais. Notavelmente, 61,11% (11/18) dos pacientes com MM positivos para DRM por NGS e MFC apresentaram progressão da doença ou recidiva. Pacientes com DRM detectada exclusivamente por NGS exibiram taxas mais baixas de resposta clínica completa, e alguns pacientes com MM inicialmente responsivos recidivaram após a interrupção do tratamento. Esses achados indicam que este ensaio baseado em NGS oferece detecção altamente sensível e específica de DRM em malignidades linfoides, mesmo em amostras de esfregaços residuais obtidas de pacientes com MM. Ele demonstra vantagens em relação à MFC e mostra-se valioso para o rastreamento de DRM. Em conclusão, as evidências atuais apoiam o uso de NGS como ferramenta complementar à MFC, especialmente em pacientes MFC⁻/NGS⁺, pois o NGS oferece uma estratificação de risco mais profunda. No entanto, o limiar ideal de intervenção ainda precisa ser determinado por estudos prospectivos.

Introdução

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O mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia hematológica caracterizada pela proliferação de células plasmáticas clonais aberrantes na medula óssea1. Na China, em 2022, houve aproximadamente 22.450 novos diagnósticos de MM e 17.360 mortes relacionadas2. Apesar dos avanços significativos no tratamento do MM na última década, que aumentaram substancialmente a sobrevida mediana dos pacientes, a maioria dos pacientes acaba experimentando recidiva3,4. Esse aumento acentuado ressalta a necessidade crítica de um monitoramento preciso da remissão, predição precoce da recidiva e intervenções terapêuticas oportunas.

Evidências clínicas estabeleceram firmemente a importância prognóstica do estado da doença residual mínima (MRD) nas malignidades hematológicas5,6,7. Reconhecendo sua relevância, o Grupo Internacional de Trabalho sobre Mieloma (IMWG) incorporou a avaliação da MRD aos seus critérios de avaliação de resposta em 20168. Os métodos atuais para avaliação da MRD na medula óssea incluem reação em cadeia da polimerase com oligonucleotídeos específicos para alelos (ASO-PCR), PCR digital (dPCR), citometria de fluxo multiparamétrica (MFC) e ensaios de sequenciamento de nova geração (NGS)8. Embora a ASO-PCR ofereça detecção sensível, é um método demorado e difícil de padronizar devido à necessidade de primers específicos para cada paciente9,10. Da mesma forma, o dPCR é limitado pelo seu desenho específico para alelos10,11. A MFC tem sido fundamental na detecção da MRD12, fornecendo informações rápidas ao nível celular, mas enfrenta desafios quanto à padronização e reprodutibilidade.

O sequenciamento de nova geração (NGS) apresenta uma abordagem reprodutível e altamente sensível que elimina a necessidade de primers específicos para cada paciente. Ele permite a identificação e quantificação confiáveis de rearranjos únicos de imunoglobulina em neoplasias hematológicas13. A Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos (FDA) aprovou o ClonoSEQ, da Adaptive Biotechnologies, para testes de doença residual mínima (MRD) em pacientes com leucemia linfoblástica aguda (ALL), mieloma múltiplo (MM) e leucemia linfocítica crônica (CLL)14,15,16. Diversas diretrizes clínicas internacionais agora incluem o NGS como método recomendado para monitoramento de MRD. As Diretrizes Chinesas para o Diagnóstico e Tratamento do Mieloma Múltiplo (Revisadas em 2020) também recomendam a avaliação de MRD em pacientes com mieloma múltiplo utilizando métodos como citometria de fluxo de nova geração (NGF) e NGS17.

Até onde sabemos, a tecnologia de sequenciamento de nova geração (NGS) não é o método preferencial para detecção de doença residual mínima (MRD) em neoplasias linfoides na prática clínica, devido a restrições de custo e tempo. Quando os resultados da citometria de fluxo multiparamétrica (MFC) são negativos, frequentemente é necessária uma punção medular adicional para detectar MRD. Esse procedimento adicional pode impor significativas cargas físicas e psicológicas aos pacientes, potencialmente limitando sua ampla aplicação clínica.

Neste estudo, desenvolvemos, caracterizamos e validamos o desempenho de um ensaio de clonalidade de receptor de células B ou T (BCR/TCR) baseado em NGS (OriMIRACLE LTM). Os objetivos principais deste estudo foram validar a sensibilidade e especificidade deste ensaio para o rastreamento de doença residual mínima (MRD) em neoplasias linfoides, mesmo ao utilizar amostras de esfregaços residuais. Este método pode utilizar diretamente esfregaços residuais de medula óssea sobrando do diagnóstico de rotina, superando assim as limitações inerentes das amostras de esfregaço. Mesmo quando o DNA nos esfregaços está fragmentado devido à fixação, coloração e armazenamento prolongado, presente em quantidades extremamente baixas ou parcialmente degradado, perfis confiáveis do repertório imune podem ser obtidos por meio da extração otimizada de ácidos nucleicos e amplificação por PCR multiplex. Ele permite o rastreamento clonal com alta sensibilidade, de 10⁻5 a 10⁻6, superando o limite inferior de detecção da citometria de fluxo convencional baseada em MRD. Este trabalho destaca o potencial da avaliação baseada em NGS da clonalidade de BCR/TCR no aprimoramento do rastreamento de MRD e na orientação de decisões terapêuticas para pacientes com mieloma múltiplo (MM), podendo abordar as limitações atuais na prática clínica.

Protocolo

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Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Gannan (número de aprovação ética: 22SC-2023011201). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes antes de sua inclusão no estudo.

Seleção da amostra
Amostras clínicas foram obtidas de 40 pacientes diagnosticados com diversas malignidades hematológicas, incluindo LLA, MM, LLC e linfoma. Além disso, foram coletadas amostras pareadas das fases crônica e blástica de pacientes com leucemia mieloide crônica. As amostras foram obtidas do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Gannan, Jiangxi, China, entre dezembro de 2016 e agosto de 2022. Esses espécimes foram derivados de aspirados de medula óssea (AMO) ou sangue periférico. Quatro linhagens celulares de malignidades linfoides também foram utilizadas: linhagens de LLA-B REH e NALM6, linhagem de LLA-T Jurkat e linhagem de linfoma H9, todas adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA).

Para o estudo de validação analítica, foi incluído um subconjunto de esfregaços clínicos pareados de medula óssea residual coletados antes e após o tratamento de 30 pacientes recém-diagnosticados ou com mieloma múltiplo recidivado. Ensaios de MFC foram realizados em amostras de AMO nos pontos temporais correspondentes utilizando citometria de fluxo com 4 cores.

As amostras foram coradas com seis combinações diferentes de anticorpos de 4 cores (diluições conforme as instruções do fabricante): CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR e K/L/CD45/CD38. A coloração foi realizada durante 30 minutos a 4 °C no escuro, seguida por duas lavagens com PBS (centrifugação a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C). Nos laboratórios de imunohematologia, a positividade de MFC-MRD na medula óssea é atualmente definida utilizando um limiar de 10-4 (1 célula em 10.000). A qualidade da aquisição por citometria de fluxo foi verificada por meio da visualização do espalhamento para frente/lateral e da confirmação de pelo menos 10.000 eventos CD45+ por tubo.

Detecção de clonalidade e monitoramento de DRMin por ensaio de clonalidade baseado em NGS
O DNAg foi extraído de 200 µL de AMO, sangue periférico ou esfregaço residual inteiro (ressuspenso em 200 µL de PBS) utilizando o kit correspondente, conforme instruções do fabricante. Foram exigidas concentração mínima de DNAg de 20 ng/µL e rendimento total ≥ 1 µg. Foi verificado o índice A260/A280 entre 1,8 e 2,0. Este ensaio amplifica o DNAg por PCR multiplex locus-específica com iniciadores, seguida da adição de um código de barras de índice de especificidade da reação à sequência do receptor amplificada para identificação da amostra. O DNA amplificado com código de barras é então agrupado para preparação de bibliotecas de sequenciamento, as quais são submetidas à NGS utilizando a plataforma Illumina. Tamanho final da biblioteca entre 350–450 pb e concentração ≥ 5 nM foram verificados no Bioanalyzer. Os dados de sequenciamento são processados utilizando pipelines bioinformáticos personalizados e rigorosas medidas de controle de qualidade. As leituras são atribuídas aos BCRs ou TCRs rearranjados para cada amostra e agregadas em sequências de receptores clonais. Essas sequências são então avaliadas quanto ao seu potencial relacionado à doença e adequação para monitoramento subsequente. Para ser considerada adequada, uma sequência deve representar pelo menos 10% de todas as sequências de BCR no locus em questão e demonstrar unicidade suficiente. Ao avaliar uma sequência para monitoramento de DRMin, sua unicidade é determinada pela comparação com uma base de dados abrangente do repertório de células B ou T, como a base de dados ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org). A frequência da sequência nessa base de dados é utilizada para avaliar sua distinção. Uma vez identificadas as sequências relacionadas à doença apropriadas, elas são comparadas com amostras subsequentes para monitorar a DRMin. As amostras são classificadas como DRMin-positivas (+) se forem encontradas correspondências de sequência, ou DRMin-negativas (-) se nenhuma correspondência for detectada. A concentração de cada sequência monitorada é quantificada, permitindo o cálculo dos números consensuais de células malignas e de células nucleadas totais ao nível da amostra. A razão entre esses valores fornece uma estimativa da frequência de células tumorais em uma amostra, oferecendo informações valiosas sobre a progressão ou remissão da doença. Uma sequência clonal foi considerada válida para monitoramento se pelo menos 50 leituras suporte fossem detectadas e a sequência representasse ≥10% do repertório total de BCR/TCR no diagnóstico.

Todas as amostras derivadas de humanos foram manipuladas como materiais biologicamente perigosos em uma cabine de segurança biológica Classe II (CSB) com equipamento de proteção individual (EPI). Os consumíveis contaminados foram autoclavados (121 °C, 20 min) antes da eliminação; os resíduos líquidos foram tratados com hipoclorito a 10%.

Estudos de precisão e sensibilidade
O limite de detecção (LOD) foi determinado utilizando amostras clínicas e linhagens celulares em um fundo de DNA genômico (gDNA) de sangue periférico proveniente de doadores saudáveis. Para estabelecer a linearidade da detecção, o gDNA de linhagens celulares foi adicionado ao DNA normal, criando uma faixa de frequências clonais que abrange várias ordens de magnitude. Especificamente, células malignas foram adicionadas a partir de 10 células, seguido por diluições seriadas de 10 vezes: 10, 100, 1.000 e 10.000 células. O LOD foi calculado como o número esperado de células malignas de entrada no qual a curva de probito ajustada atingiu uma probabilidade de detecção de 95%. A concordância entre as frequências observadas e esperadas foi analisada por meio de regressão linear. Esses parâmetros fornecem uma base sólida para a estimativa de MRD em nível de amostra em estudos subsequentes de avaliação. Esta versão aprimorada mantém o tom acadêmico, ao mesmo tempo que melhora a clareza e a concisão, assegurando também o uso adequado da terminologia científica e aderindo às convenções da escrita acadêmica na área das ciências da vida e da medicina.

Análise estatística
Um valor de p bicaudal < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. A linearidade foi avaliada e calculada utilizando o coeficiente de correlação de Pearson (r) no GraphPad Prism. A análise estatística foi realizada com a linguagem R (versão 3.6.1). O cálculo da sobrevida livre de progressão (PFS) começa no momento em que o paciente alcança resposta completa (CR), resposta parcial (PR) ou resposta parcial muito boa (VGPR), e continua até a ocorrência de doença progressiva (PD) ou morte por qualquer causa. A curva de Kaplan-Meier foi utilizada para analisar a sobrevida, e o teste log-rank foi empregado para comparar as diferenças de sobrevida entre subgrupos. A análise de Cox foi conduzida utilizando tanto análises univariadas quanto multivariadas.

Resultados

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O processamento, linearidade e precisão da detecção de clonalidade
Os ensaios de clonalidade de BCR/TCR basearam-se em duas rodadas de PCR multiplex seguidas por NGS (Figura 1). Os ensaios de clonalidade de BCR podiam identificar rearranjos de IGH (VH-DH-JH ou DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde e intronRSS-Kde) e IGL (Vλ-Jλ), bem como translocações BCL1-IGH e BCL2-IGH, utilizando reações separadas ou uma única reação mista ajustada. Os ensaios de clonalidade de TCR podiam detectar rearranjos de TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) e TCRG (Vγ–Jγ). A clonalidade de BCR nas malignidades linfoides de células B apresentou uma taxa de detecção de 93,94%, e a clonalidade de TCR nas malignidades linfoides de células T apresentou uma taxa de detecção de 90,91% (Tabela 1).

A linearidade foi demonstrada em uma ampla faixa de quantidades de amostra (0,2 µg, 2 µg e 20 µg) com base nos resultados de testes em linhagens celulares, abrangendo várias ordens de magnitude. Para estabelecer a linearidade, células malignas foram adicionadas ao gDNA normal por meio de diluições seriadas de 10 vezes (10, 100, 1.000 e 10.000 células). A linearidade foi observada com inclinações estimadas entre 0,93 e 1,06 nas frequências clonais de 1 a 10-6 (Figura 2A). O limite de detecção (LOD) foi estimado entre 1 e 2 células malignas em ambos os ensaios de clonalidade de BCR e TCR (Figura 2B). Além disso, os ensaios de clonalidade de BCR/TCR foram capazes de detectar clonalidade em linfoma utilizando amostras de tecido (BMA) e sangue periférico pareado (Tabela Suplementar 1).

Pacientes e amostras utilizadas para validar a detecção de DRMe
A validação da detecção de DRMe incluiu um total de 29 pacientes com mieloma múltiplo, sendo que um paciente foi excluído devido a dano na amostra. A população do estudo era composta por 65,52% (19/29) de homens e 34,48% (10/29) de mulheres, com idade mediana de 65 anos (intervalo de 33–82) (Tabela 2). Dentre a coorte, 31,03% (9/29) dos pacientes foram classificados como alto risco, 24,14% (7/29) como risco padrão e 37,93% (11/29) como baixo risco, de acordo com os critérios do IMWG18. Os estágios I, II e III do sistema revisado de estadiamento internacional para mieloma múltiplo (R-ISS) representaram, respectivamente, 10,34% (3/29), 48,28% (14/29) e 20,69% (6/29) dos pacientes19.

Comparação dos ensaios NGS e MFC
Foi realizada uma comparação direta em pares para avaliar a precisão quantitativa dos ensaios OriMIRACLE LTM e MFC. Os resultados mostraram precisão quantitativa semelhante ao longo da faixa testada, especialmente em frequências de DR em níveis superiores a 10−4, com um valor de Pearson R de 0,73 (Figura 3). Células tumorais foram detectadas por ambos os ensaios, MFC e NGS, em 59 amostras de 29 pacientes com MM, e a consistência atingiu 81,36% (48/59). Essa consistência reflete a presença de células tumorais detectáveis em diferentes momentos, e não uma concordância verdadeira entre os métodos. Dentre as amostras, 62,07% (18/29) foram classificadas como DR+ por ambos os ensaios, NGS e MFC, um paciente foi classificado como DR− por ambos os métodos, e 11 pacientes foram classificados como DR+ por NGS, mas DR− por MFC. Entre os pacientes com resultados de detecção inconsistentes, três apresentaram frequência de detecção abaixo de 10-4, enquanto oito apresentaram frequência de detecção na faixa de 10-2–10-4 (Figura 3). A extração de DNA de amostras residuais de esfregaço de medula óssea é realizada para obter a maior quantidade possível de DNA. Para a detecção de clonalidade antes do tratamento, foi testada uma média de 91,95 ng (até 100,0 ng) de DNA como entrada. Uma média de 1623,39 ng (variando de 50,1 a 17400,0 ng) de DNA foi extraída para os testes subsequentes de DR (Tabela Suplementar 2). Os resultados revelaram que o NGS pode detectar DR mesmo quando a amostra residual é insuficiente, enquanto o MFC falhou em detectar DR em alguns casos.

Validade clínica da detecção de RMD por ensaio de NGS para o intervalo principal
As sequências clonais foram detectadas na linha de base em todos os pacientes com MM, seguidas pela avaliação da RMD (Figura 4). Dezoito pacientes foram confirmados como RMD+ por meio da detecção por NGS e MFC. Dentre os pacientes com RMD+ por ambos MFC e NGS, 61,11% (11/18) subsequentemente apresentaram progressão da doença ou recidiva. 38,89% (7/18) dos pacientes alcançaram doença estável (DE) ou resposta parcial (RP) durante o estudo. Entre os pacientes confirmados como RMD+ por NGS, mas RMD− por MFC, 36,36% (4/11) não conseguiram alcançar resposta clínica completa (RC) na avaliação clínica mais recente (Tabela Suplementar 2). Além disso, dentre todos os pacientes cuja resposta clínica foi RC, 37,50% (3/8) apresentaram recidiva após a descontinuação do tratamento. Também exploramos características clínicas primárias e resultados de MFC em relação ao desfecho de sobrevida livre de progressão (SLP) (Figura Suplementar 1). Análises univariada e multivariada da SLP revelaram que estas não estavam significativamente relacionadas. Neste estudo, não foi observada diferença significativa na SLP ao analisar apenas os resultados de RMD obtidos por MFC.

DISPONIBILIDADE DE DADOS
Devido a restrições de privacidade dos pacientes e políticas institucionais, os dados brutos não estão disponíveis publicamente. Um resumo dos dados coletados está fornecido no Arquivo Suplementar 1.

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Figura 1: O ensaio de clonalidade de BCR/TCR envolveu PCR multiplex seguido de NGS. A PCR da primeira rodada amplificou a região CDR3 de genes de receptores imunes rearranjados utilizando primers específicos para o locus e índices específicos para a amostra, e os adaptadores de NGS foram adicionados durante a PCR da segunda rodada. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 2: A linearidade da detecção de clonalidade foi avaliada pela adição de gDNA de linhagem celular ao gDNA normal em uma faixa de frequências clonais. (A) Linearidade dos ensaios de clonalidade de BCR e TCR. (B) Limite de detecção (LOD) estimado utilizando amostras clínicas e linhagens celulares adicionadas ao gDNA de sangue periférico de doadores saudáveis. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Comparação par a par das medições de frequência de DRM entre a citometria de fluxo multiparamétrica (MFC) e o ensaio de DRM por sequenciamento de nova geração (NGS). Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

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Figura 4: A dinâmica da DRM em pacientes com MM e os diferentes estados clínicos dos pacientes. Clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.

Tipos de amostraNºTipo de doençaClonótipo dominante
Linhas celularesREH1B-ALLIGH, IGK
NALM62B-ALLIGH, IGK
Jurkat3T-ALLTCRB, TCRG
H94LinfomaTCRB, TCRG
Malignidades linfoides clínicas de células B5B-ALLIGH
6B-ALLIGL
7B-ALLIGH
8B-ALLNão detectado
9LLCIGH, IGK
10LLCIGH, IGK
11CP-CMLIGH
12BP-CMLIGH
13MMIGK
14MMIGH, IGK
15MMIGK
16MMIGH
17MMIGH
18MMIGK
19MMIGH
20MMIGH, IGK
21MMIGH, IGK
22MMIGH
23LinfomaIGH, IGK
24LinfomaIGH, IGK, IGL
25LinfomaIGH, IGK, IGL
26LinfomaIGH, IGK, IGL
27LinfomaIGH
28LinfomaIGH
29LinfomaIGH, IGK, IGL
30LinfomaIGH, IGK 
31LinfomaIGH, IGK 
32LinfomaIGH, IGK, IGL
33LinfomaIGK
34LinfomaIGH
35LinfomaNão detectado
Malignidades linfoides clínicas de células T36LinfomaTCGR
37LinfomaTCRB, TCRG
38LinfomaTCRB, TCRG
39LinfomaTCRB, TCRG
40LinfomaTCRB, TCRG
41LinfomaTCRB, TCRG
42LinfomaTCRB, TCRG
43LinfomaTCRB, TCRG
44LinfomaNão detectado

Tabela 1: Detecção de clonalidade utilizando ensaios de clonalidade de BCR/TCR em 4 linhagens celulares e 40 amostras clínicas. B-ALL: leucemia linfoblástica aguda de células B; T-ALL: leucemia linfoblástica aguda de células T; CP-CML: leucemia mieloide crônica em fase crônica; BP-CML: leucemia mieloide crônica em fase blástica; CLL: leucemia linfocítica crônica; MM: mieloma múltiplo.

CaracterísticaTotal (N = 29)
Idade mediana, anos (intervalo)65 (33-82)
Gênero, n (%)
Masculino19 (65,52)
Feminino10 (34,48)
Tipo de cadeia pesada, n (%)
IgG14 (48,28)
IgA7 (24,14)
IgE1 (3,45)
Tipo de cadeia leve, n (%)
k19 (65,52)
λ8 (27,59)
Anormalidade citogenética, n (%)
del17p2 (6,90)
del13q149 (31,03)
ganho/amp de 1q2112 (41,38)
t (4;14)2 (6,90)
Sem anormalidades9 (31,03)
Estádio ISS, n (%)
I4 (13,79)
II13 (44,83)
III12 (41,38)
Estádio R-ISS, n (%)
I3 (10,34)
II14 (48,28)
III6 (20,69)
Perdido6 (20,69)
IMWG, n (%)
Alto risco9 (31,03)
Risco padrão7 (24,14)
Baixo risco11 (37,93)
Perdido2 (6,90)

Tabela 2: Características basais dos 29 pacientes com mieloma múltiplo incluídos neste estudo. k: kappa; λ: Lambda; DS: Durie-Salmon; ISS: Sistema de estadiamento internacional; R-ISS: sistema de estadiamento internacional revisado; IMWG: International Myeloma Working Group

Figura Suplementar 1: Análise de sobrevida com base em características clínicas e resultados de MFC. (A) Análises univariada e multivariada de PFS. (B) Curva de Kaplan-Meier com resultado de MFC. (C) Curva de Kaplan-Meier com resultado de NGS. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 1: Detecção de clonalidade de linfoma utilizando ensaios de clonalidade de BCR/TCR em amostras de tecido e sangue periférico pareado. NHL: linfoma não Hodgkin; HGBL: linfoma de células B de alto grau; FL: linfoma folicular; DLBCL: linfoma difuso de grandes células B; ITLPD-GI: distúrbios linfoproliferativos T indolentes do trato gastrointestinal. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar 2: Resultados da detecção de DRP com base nos ensaios MFC e NGS. ND: não detectado; Resposta parcial: RP; Resposta completa: RC; Doença estável: DE; Resposta parcial muito boa: RPMB. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1: Resumo dos dados brutos coletados neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

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Os últimos anos testemunharam melhorias significativas nos desfechos clínicos das neoplasias linfoides, impulsionando a busca por marcadores alternativos capazes de prever desfechos de sobrevida mais cedo e acelerar a avaliação de novas terapias20. Uma meta-análise abrangente envolvendo 8.098 pacientes reafirmou o forte valor prognóstico da negatividade para DRMin na melhoria da sobrevida a longo prazo em pacientes com mieloma múltiplo21. Além disso, os rearranjos clonais de BCR e TCR surgiram como marcadores cruciais para diagnóstico e monitoramento de DRMin, orientando decisões terapêuticas nas neoplasias do sistema linfático22.

Evidências crescentes apoiam a superioridade da avaliação de clonalidade de BCR/TCR baseada em NGS em comparação com ensaios baseados em MFC e PCR, especialmente quando amostras abundantes de DNA estão disponíveis. O NGS oferece maior sensibilidade e padronização mais simples10,23,24,25,26 e foi identificado como um forte fator prognóstico tanto para a sobrevida livre de progressão quanto para a sobrevida global no início da terapia de manutenção27.
Neste estudo, desenvolvemos um ensaio baseado em NGS, que demonstra uma taxa de detecção positiva superior a 90% tanto para clonalidade de BCR quanto de TCR em neoplasias linfoides. O LOD do ensaio é estimado entre 1 e 2 células malignas para os ensaios de clonalidade de BCR e TCR, comparável à alta sensibilidade do ensaio clonoSEQ, com um LOD de 1,903 células malignas16. Observamos linearidade com inclinações estimadas entre 0,93 e 1,06 ao longo de frequências clonais de 1 a 10-6, indicando forte proporcionalidade entre as frequências clonais observadas e esperadas. Após o estabelecimento de métodos padronizados de detecção e a conclusão da validação laboratorial, realizamos a validação clínica para garantir a adequação do ensaio para o monitoramento clínico de DRMin.

Este estudo revelou uma consistência de 81,36% (48/59) entre o ensaio baseado em NGS e o MFC. Ambos os métodos demonstraram sensibilidade de 100% na identificação de células tumorais em casos recém-diagnosticados ou recidivados. Para o monitoramento pós-tratamento, não foi encontrada correlação significativa entre o status de DRM avaliado pelo MFC e a SLP, provavelmente devido ao tamanho limitado da amostra. Consequentemente, realizamos uma análise abrangente de todos os casos.

Entre os 18 pacientes identificados como positivos para MRD por ambos os métodos, os resultados de MRD coincidiram com as avaliações de resposta clínica. Nove desses pacientes apresentaram PD ou recidiva, quatro alcançaram SD, quatro alcançaram PR e um faleceu. Isso sugere que, para pacientes com resultado positivo para MRD por ambos os métodos, a PD ou recidiva é quase invariavelmente observada. Esses dados indicam que a positividade para MRD nos ensaios de NGS e MFC reflete principalmente uma eficácia limitada ou um prognóstico desfavorável nesses pacientes. Dos 11 pacientes que apresentaram resultado positivo para MRD por NGS, mas negativo por MFC, 36,36% não conseguiram alcançar CR. Esses achados destacam a capacidade do NGS de detectar MRD em frequências que variam de 10-2 a 10-6, mesmo com amostras residuais limitadas, enquanto o MFC não detectou MRD em alguns casos. Isso reforça ainda mais a maior sensibilidade e especificidade do NGS na detecção de MRD em comparação com o MFC.

Pesquisas anteriores demonstraram que o status de doença residual mínima (MRD) avaliado por citometria de fluxo multiparamétrica (MFC) é um forte preditor de sobrevida livre de progressão (PFS) e sobrevida global em pacientes com mieloma múltiplo (MM), destacando a importância do monitoramento da MRD na orientação das decisões terapêuticas e na avaliação do prognóstico após transplante autólogo de células-tronco28. Os resultados aqui apresentados reforçam a relevância dos ensaios baseados em sequenciamento de nova geração (NGS), como ilustrado por dois casos (pacientes 11 e 14), nos quais os pacientes foram classificados como MRD-negativos pela MFC, mas MRD-positivos pelo NGS. É fundamental observar que a interrupção do tratamento nesses casos pode acarretar risco de recidiva, ressaltando a necessidade de uma avaliação cuidadosa da resposta ao tratamento quando forem observados resultados discordantes de MRD.

Este estudo rompe a dependência dos métodos atuais de NGS e MFC em relação a aspirados frescos de medula óssea ou células congeladas e, pela primeira vez, valida sistematicamente que esfregaços residuais de medula óssea, mesmo previamente corados, deixados após diagnóstico de rotina, podem servir como material inicial confiável para a detecção de MRD com alta sensibilidade. Isso aborda diretamente as seguintes lacunas clínicas e metodológicas: (1) evita a necessidade de extrair grandes volumes de líquido da medula óssea para o monitoramento de MRD, especialmente em pacientes idosos ou naqueles com dificuldade de coleta; (2) permite a análise retrospectiva de esfregaços arquivados, aproveitando assim os recursos patológicos existentes para estabelecer evidências prognósticas baseadas em MRD em coortes históricas; e (3) com uma sensibilidade de detecção de 10-5-10-6, é muito superior à MFC convencional (tipicamente 10-4-10-5) e contorna os falsos negativos causados por problemas de qualidade da amostra na MFC, fornecendo uma ferramenta de avaliação de MRD baseada em DNA e rastreável para a prática clínica.

Várias etapas críticas foram identificadas para garantir o sucesso e a confiabilidade do ensaio. A raspagem suave de resíduos de esfregaços seguida imediatamente pela aplicação do tampão foi essencial para obter um rendimento adequado de DNA genômico. Era necessário um quantidade precisa de DNA de entrada (100 ng por reação, dentro de ±10%) para evitar perda alélica ou amplificação enviesada. O agrupamento equimolar de produtos com códigos de barras (2 nM) contribuiu para uma profundidade de sequenciamento uniforme, e a aplicação consistente de limiares bioinformáticos (frequência clonal ≥10% no diagnóstico e ≤5% de incompatibilidades para rastreamento) ajudou a prevenir chamadas falsas positivas de DRMin. Além disso, várias modificações ao protocolo padrão foram introduzidas para resolver problemas experimentais comuns. Quando a concentração final da biblioteca caiu abaixo de 5 nM, uma segunda rodada de PCR com 2–4 ciclos adicionais foi cuidadosamente adicionada para evitar viés de superamplificação. Para amostras nas quais o rastreamento clonal falhou devido a incompatibilidades excessivas (>5%), a base de dados de referência IMGT foi atualizada e a tolerância a incompatibilidades foi temporariamente relaxada para 8% em análises exploratórias, embora 5% permaneça o valor de corte padrão para relatórios clínicos. Se a profundidade de sequenciamento caiu abaixo de 50.000 leituras por amostra, foi realizada nova combinação e novo sequenciamento sem repetir a etapa de PCR.

No geral, essa validação no mundo real demonstra que amostras residuais de esfregaço de medula óssea produzem resultados de teste consistentes e confiáveis em diversos contextos terapêuticos. Em regiões economicamente desfavorecidas onde a biópsia de medula óssea e a citometria de fluxo multiparamétrica (MFC) são rotineiramente realizadas em vez de sequenciamento de nova geração (NGS), os resultados sugerem que o NGS pode ser considerado para avaliação molecular adicional quando os resultados iniciais forem negativos. O uso de amostras residuais é apropriado nessas situações, pois elimina a necessidade de repetidas aspirações de medula óssea, reduzindo assim o ônus para o paciente.

Embora o nosso estudo contínuo no mundo real tenha como objetivo ampliar o tamanho da amostra para análises adicionais, reconhecemos várias limitações. Podem ocorrer falsos negativos, particularmente quando o conteúdo de DNA extraído é insuficiente, como observado na segunda detecção de DRMin para o paciente 10. Além disso, a proporção de clones detectados por NGS é afetada pela quantificação celular, o que pode levar à superestimação das proporções de células de DRMin. A validação concentra-se principalmente em amostras de medula óssea. No entanto, o significado de longo prazo da DRMin por NGS reside em múltiplos acompanhamentos após o tratamento, nos quais o sangue periférico pode ser mais adequado. A validação de amostras de sangue periférico ainda não foi realizada. Dado o número limitado de amostras para validação clínica, o recrutamento aleatório de pacientes e as diversas abordagens terapêuticas neste estudo no mundo real, a coleta de amostras consecutivas de DRMin mostrou-se desafiadora. Consequentemente, concentramo-nos na avaliação da significância das respostas precoces de DRMin em relação à progressão subsequente, e não foi possível demonstrar o impacto do status persistente de DRMin sobre desfechos de longo prazo. Além disso, a NGF não foi incluída na análise comparativa. Embora a NGS e a MFC convencional tenham sido comparadas sistematicamente, a NGF, sendo um dos dois métodos de DRMin recomendados pelo IMWG (o outro é a NGS), teria fornecido informações adicionais sobre o desempenho do ensaio. Além disso, o tamanho da amostra é relativamente pequeno (n = 40), e a coorte é heterogênea, incluindo várias neoplasias hematológicas. Estudos futuros multicêntricos e de grande escala, que incluam a NGF e se concentrem em uma única neoplasia, como o mieloma múltiplo, são necessários para confirmar e ampliar nossas conclusões.

Após caracterizar e validar minuciosamente o desempenho do ensaio de clonalidade de BCR/TCR baseado em NGS, demonstramos que ele possui potencial como um método altamente sensível, preciso e prático para quantificar e monitorar a doença residual mínima (MRD) em amostras de esfregaço de medula óssea residual de pacientes com mieloma múltiplo (MM).

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram que não possuem conflito de interesses.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão da Fundação de Ciências Naturais do Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Jiangxi (nº 20232BAB206059), Projeto de Pesquisa Científica e Tecnológica do Departamento de Educação da Província de Jiangxi (nº GJJ211518), Projeto do Plano de Ciência e Tecnologia da Comissão de Saúde da Província de Jiangxi (nº 202310782) e Projeto do Plano de Tecnologia Científica Orientadora da Agência de Ciência e Tecnologia de Ganzhou, Província de Jiangxi (nº GZ2020ZSF027). Projeto do Plano de Ciência e Tecnologia da Administração Provincial de Medicina Tradicional Chinesa de Jiangxi (nº 2024B0710)

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti-CD19AbcamAB134114Diluição conforme instruções do fabricante
Anti-CD20AbcamAB64088Diluição conforme instruções do fabricante
Anti-CD22AbcamAB32123Diluição conforme instruções do fabricante
Anti-CD33AbcamAB134115Diluição conforme instruções do fabricante
Anti-CD34AbcamAB81289Diluição conforme instruções do fabricante
Anti-CD38AbcamAB183326Diluição conforme instruções do fabricante
Anti-CD45AbcamAB40763Diluição conforme instruções do fabricante
Anti-CD56AbcamAB75813Diluição conforme instruções do fabricante
Anti-CD9AbcamAB2215Diluição conforme instruções do fabricante
Anti-HLA-DRAbcamAB20181Diluição conforme instruções do fabricante
GraphPad PrismGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000IlluminaNovaSeq 6000https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
Banco de dados ImMunoGeneTics (IMGT)ImMunoGeneTics (IMGT) databasehttp://www.imgt.org/
Linhas celulares de malignidades linfoidesATCChttps://www.atcc.org/Linhas de LLA-B REH e NALM6, linha de LLA-T Jurkat e linha de linfoma H9 (DSMZ)
Citometria de fluxo multiparamétricaBECKMAN COULTERCytoFLEX
Ensaio OriMIRACLE LTM Origimed Co., Ltd., Xangai, China
Linguagem RFoundation for Statistical Computing Rversão 3.6.1

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van de Donk N, Pawlyn C, Yong KL. Multiple myeloma. Lancet. 2021;397(10272):410-27.
  2. Xia C, et al. Cancer statistics in China and United States, 2022: Profiles, trends, and determinants. Chin Med J. 2022;135(5):584-90.
  3. Ricciuti G, Falcone A, Cascavilla N, Martinelli G, Cerchione C. Autologous stem cell transplantation in multiple myeloma. Panminerva Med. 2020;62(4):220-4.
  4. Feng D, Sun J. Overview of anti-BCMA CAR-T immunotherapy for multiple myeloma and relapsed/refractory multiple myeloma. Scand J Immunol. 2020;92(2):e12910.
  5. Ontario Health. Minimal residual disease evaluation in childhood acute lymphoblastic leukemia: A clinical evidence review. Ont Health Technol Assess Ser. 2016;16(7):1-52.
  6. Yanamandra U, Kumar SK. Minimal residual disease analysis in myeloma: When, why and where. Leuk Lymphoma. 2018;59(8):1772-84.
  7. Bassan R, Brüggemann M, Radcliffe HS, Hartfield E, Kreuzbauer G, et al. A systematic literature review and meta-analysis of minimal residual disease as a prognostic indicator in adult B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 2019;104(10):2028-39.
  8. Kumar S, et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. Lancet Oncol. 2016;17(8):e328-e346.
  9. Dogliotti I, Drandi D, Genuardi E, Ferrero S. New molecular technologies for minimal residual disease evaluation in B-cell lymphoid malignancies. J Clin Med. 2018;7(9).
  10. Drandi D, et al. Highly sensitive MYD88(L265P) mutation detection by droplet digital polymerase chain reaction in Waldenström macroglobulinemia. Haematologica. 2018;103(6):1029-37.
  11. Camus V, et al. Digital PCR for quantification of recurrent and potentially actionable somatic mutations in circulating free DNA from patients with diffuse large B-cell lymphoma. Leuk Lymphoma. 2016;57(9):2171-9.
  12. Riva G, et al. Multiparametric flow cytometry for MRD monitoring in hematologic malignancies: Clinical applications and new challenges. Cancers. 2021;13(18).
  13. Anderson KC, et al. Minimal residual disease in myeloma: Application for clinical care and new drug registration. Clin Cancer Res. 2021;27(19):5195-212.
  14. ClonoSEQ cleared for residual cancer testing. Cancer Discov. 2018;8(12):OF6.
  15. Walzer S, Krenberger S, Vollmer L, Hewitt T, Eckert B. A cost impact analysis of clonoSEQ® as a valid and CE-certified minimal residual disease (MRD) diagnostic compared to no MRD testing in multiple myeloma in Germany. Oncol Ther. 2021;9(2):607-19.
  16. Ching T, et al. Analytical evaluation of the clonoSEQ assay for establishing measurable (minimal) residual disease in acute lymphoblastic leukemia, chronic lymphocytic leukemia, and multiple myeloma. BMC Cancer. 2020;20(1):612.
  17. Chinese Society of Hematology. The guidelines for the diagnosis and management of multiple myeloma in China (2020 revision). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2020;59(5):341-6.
  18. Chng WJ, et al. IMWG consensus on risk stratification in multiple myeloma. Leukemia. 2014;28(2):269-77.
  19. Hagen P, Zhang J, Barton K. High-risk disease in newly diagnosed multiple myeloma: Beyond the R-ISS and IMWG definitions. Blood Cancer J. 2022;12(5):83.
  20. Rawstron AC, et al. Minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry in multiple myeloma: Impact on outcome in the Medical Research Council Myeloma IX Study. J Clin Oncol. 2013;31(20):2540-7.
  21. Munshi NC, et al. A large meta-analysis establishes the role of MRD negativity in long-term survival outcomes in patients with multiple myeloma. Blood Adv. 2020;4(23):5988-99.
  22. Brüggemann M, et al. Standardized next-generation sequencing of immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations for MRD marker identification in acute lymphoblastic leukaemia: A EuroClonality-NGS validation study. Leukemia. 2019;33(9):2241-53.
  23. Medina A, et al. Comparison of next-generation sequencing (NGS) and next-generation flow (NGF) for minimal residual disease (MRD) assessment in multiple myeloma. Blood Cancer J. 2020;10(10):108.
  24. Kruse A, Abdel-Azim N, Kim HN, Ruan Y, Phan V, et al. Minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia. Int J Mol Sci. 2020;21(3).
  25. Kriegsmann K, et al. Comparison of NGS and MFC methods: Key metrics in multiple myeloma MRD assessment. Cancers. 2020;12(8).
  26. Takamatsu H. Comparison of minimal residual disease detection by multiparameter flow cytometry, ASO-qPCR, droplet digital PCR, and deep sequencing in patients with multiple myeloma who underwent autologous stem cell transplantation. J Clin Med. 2017;6(10).
  27. Perrot A, et al. Minimal residual disease negativity using deep sequencing is a major prognostic factor in multiple myeloma. Blood. 2018;132(23):2456-64.
  28. de Tute RM, et al. Minimal residual disease after autologous stem-cell transplant for patients with myeloma: Prognostic significance and the impact of lenalidomide maintenance and molecular risk. J Clin Oncol. 2022;40(25):2889-900.

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Cancer ResearchAnalytical ValidationNext generation sequencingMinimal Residual DiseaseMultiple myeloma

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