Sequenciamento Transcriptomático Identificou Quimiocinas Patogênicas Hub em Placas Ateroscleróticas

Resumo

Este estudo tem como objetivo analisar os mecanismos subjacentes dos fatores inflamatórios associados às placas ateroscleróticas (AP) utilizando sequenciamento de RNA. Os resultados identificaram CCL3, CCL4 e CXCL1, principais genes centrais inflamatórios na AP. Essas quimiocinas podem impulsionar a aterosclerose ao promover o acúmulo de macrófagos M0 enquanto suprimem células imunes protetoras, revelando potenciais alvos terapêuticos.

Resumo

A placa aterosclerótica (AP) é um tipo de doença inflamatória proliferativa de tecido fibroso após a lesão das células endoteliais e das células musculares lisas na parede arterial, que pode levar a diferentes graus de obstrução do fluxo sanguíneo cardiovascular e cerebrovascular. No entanto, abordagens terapêuticas eficazes voltadas para a inflamação falharam em grande parte até o momento, sugerindo que ainda são necessários insights adicionais. Neste estudo, o objetivo é analisar alterações transcriptômicas relacionadas a fatores inflamatórios em AP utilizando sequenciamento de RNA (RNA-seq). RNA-seq foi realizado em amostras de pacientes com AP (n = 11) e indivíduos controle (n = 3). Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram identificados usando Metascape, seguidos pela análise de enriquecimento de vias KEGG usando o pacote clusterProfiler em software R, análise de infiltração imune usando CIBERSORT e rede de interação proteína-proteína (PPI) usando banco de dados STRING. Genes hub dentro da rede PPI foram identificados usando o plugin CytoHubba. Um total de 3713 DEGs foram identificados no grupo AP, incluindo 2097 genes regulados para cima e 1616 para baixo regulados. Os resultados mostraram que as DEGs foram principalmente enriquecidas em vias relacionadas ao sistema imunológico e inflamatório. Três fatores relacionados à inflamação, CCL3, CCL4 e CXCL1, foram considerados como principais genes centrais no processo patológico da AP. A análise de infiltração imune revelou um microambiente distinto na AP, caracterizado por um aumento significativo dos macrófagos M0 junto com reduções nas células T CD8⁺, células NK ativadas e mastócitos em repouso dentro da AP. Em conclusão, esses achados procedurais descrevem a expressão diferencial de CCL3, CCL4 e CXCL1 e sua associação com uma alteração na composição das células imunes em AP, destacando as três quimiocinas como potenciais candidatas para investigação mecanicista adicional.

Introdução

As doenças cardiovasculares (DCV) têm sido uma ameaça séria à saúde humana em^{todo o mundo 1}. À medida que a tendência global de envelhecimento da população se intensifica, a incidência de DCV também está em alta². Entre elas, a placa aterosclerótica (AP) é uma das principais causas da^{DCV 3}. A AP é uma doença inflamatória crônica, caracterizada pelo acúmulo gradual de lipídios na íntima das artérias e pela formação de^{placas 4}. A PA é a base comum para eventos cardiovasculares e cerebrovasculares, envolvendo principalmente artérias grandes e médias, levando a isquemia e lesões, sendo um fator importante que causa doenças cardiovasculares e cerebrovasculares e morte⁵. Devido à ausência de sintomas evidentes nos estágios iniciais, a AP geralmente está avançada no momento do diagnóstico, resultando em uma alta taxa de^{letalidade 6}. O tratamento da AP foca em seus fatores de risco, incluindo fatores modificáveis como baixa atividade física, comportamento sedentário, tabagismo, problemas de saúde mental⁷, obesidade e diabetes tipo 2 devido a uma dieta rica em gordura, além de fatores não modificáveis como genes, idade e^{sexo 8}. Estudos recentes descobriram que síndrome metabólica, homocistequinemia, hiperuricemia e resistência pancreática são fatores de risco importantes para a ocorrência e desenvolvimento da aterosclerose ^9,10.

Teorias relacionadas à patogênese da AP incluem principalmente as teorias de infiltração lipídica, inflamação, resposta ao estresse oxidativo, infecção e interação entre fatores genéticos e^{ambientais 11,12}. Entre elas, inflamação e estresse oxidativo são reconhecidas como a patogênese central da AP e participam de todos os processos, desde a ocorrência até o desenvolvimento e deterioração da AP¹³. Danos súbitos da placa estável da AP, ativação plaquetária e trombose são uma patogênese importante do infarto do miocárdio e do AVC^{hemorrágico 14}. Com pesquisas contínuas, foi constatado que a AP contém não apenas lipídios, mas também muitas células^{inflamatórias 15}. Tabagismo, hipertensão, distúrbios lipídicos, hiperinsulinemia, hiperglicemia, ácido úrico alto e outros estímulos nocivos induzem glóbulos brancos e células endoteliais a liberar continuamente moléculas de adesão solúveis e várias citocinas, além de promover a aderência dos monócitos às células endoteliais vasculares. As quimiocinas acumuladas levam ainda à migração dos monócitos para o espaço subendotelial e se diferenciam em macrófagos, que então fagocitam a lipoproteína oxidada de baixa densidade (LDL) rica em colesterol dentro do tecido, transformando-se assim em células de espuma e iniciando a formação de estrias^{lipídicas 16}. O dano patológico inicial da SA, ou seja, as faixas lipídicas, é composto principalmente por macrófagos e linfócitos T, que é uma lesão inflamatória^{típica 17}. Portanto, várias células inflamatórias e seus produtos estão envolvidos na iniciação e progressão da AP¹⁸. No entanto, o cenário inflamatório da AP é complexo e envolve múltiplos fatores conhecidos e potencialmente desconhecidos. Abordagens tradicionais de genes candidatos podem não capturar todo esse espectro de fatores inflamatórios.

Para enfrentar essa limitação, utilizamos o sequenciamento de RNA (RNA-seq), um método transcriptômico de alto rendimento e imparcial. Essa abordagem é particularmente adequada para estudos geradores de hipóteses onde os principais fatores moleculares não são pré-definidos. Ao contrário dos métodos baseados em genes candidatos ou microarrays, o RNA-seq oferece uma faixa dinâmica mais ampla, maior sensibilidade e a capacidade de detectar transcritos novos sem necessidade de um projeto prévio de^{sonda 19,20}. Essas características o tornam especialmente adequado para descobrir assinaturas relacionadas à inflamação em AP, onde a base molecular permanece incompletamente caracterizada.

Neste estudo, o RNA-seq foi realizado para analisar os mecanismos subjacentes dos fatores inflamatórios associados à AP. Ferramentas de bioinformática que empregam diferentes algoritmos foram usadas para rastrear uma série de DEGs. Posteriormente, foram realizadas análises de enriquecimento (WGCNA, via KEGG, mcode, GSEA, análise gênica central) e análise de interação proteína-proteína (PPI) em rede (PPI). Os resultados deste estudo contribuem para uma melhor compreensão do mecanismo patológico molecular subjacente à PA causada pela inflamação e desempenham um papel importante na busca por novos biomarcadores.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Popular de Liaocheng (Número de aprovação: 2023014) e seguiu os princípios da Declaração de Helsinque. O consentimento informado foi obtido de todos os participantes. Os formulários de consentimento informado foram assinados por todos os pacientes ou suas famílias.

Pacientes e amostras

Este estudo analisou retrospectivamente 11 pacientes com estenose grave da artéria carótida que passaram por endarterectomia carotídea no Departamento de Neurocirurgia Vascular do Hospital Popular de Liaocheng, Província de Shandong, China, de janeiro de 2023 a dezembro de 2023. Esses pacientes foram inscritos no grupo AP. O diagnóstico de estenose da artéria carótida foi baseado em dados de imagem, como ATC ou angiografia cerebral. Os critérios de inclusão para o grupo AP foram: (1) idade entre 50 e 80 anos; (2) tomografia computorizada Angiografia/Angiografia por subtração digital confirmou estenose da artéria carótida interna intracraniana ≥70%; (3) pontuação modificada da Escala de Rankin pré-início ≤ 1; (4) consentimento informado obtido do paciente ou de seu representante legal. Os critérios de exclusão foram: (1) doenças inflamatórias ou imunológicas; (2) presença de transtornos psiquiátricos; (3) presença de tumores malignos; (4) gravidez, lactação ou potencial fértil. Idade pareada Pacientes com lesão cerebral traumática grave que passaram por doação de órgãos no mesmo hospital durante o mesmo período foram selecionados como grupo controle (NA; Controle Normal, n = 3). Os participantes dos dois grupos foram pareados por idade, sexo e índice de massa corporal para eliminar fatores de confusão. Os critérios de inclusão para o grupo controle foram: (1) idade entre 50 e 80 anos; (2) não há histórico de doença das artérias coronárias, estenose da artéria carótida ou outras doenças vasculares sistêmicas; (3) consentimento informado obtido do representante legal do paciente. Amostras de íntima e placa da artéria carótida foram coletadas do grupo AP durante a endarterectomia carotídea, enquanto amostras íntima aórtida foram coletadas do grupo controle após a doação de órgãos. Os tecidos vasculares e de placa foram armazenados em tanques de nitrogênio líquido para testes subsequentes. As características de base dos pacientes com AP são apresentadas na Tabela 1.

Preparação de amostras

A extração total de RNA foi extraída usando reagente TRIzol de acordo com as instruções do fabricante. A concentração e pureza de RNA foram avaliadas usando um espectrofotômetro Nanodrop ND-2000 em 260 nm e 280 nm (razão A260/A280 entre 1,8 e 2,0). A integridade do RNA foi avaliada usando eletroforese em gel de agarose a 2% a 100 V por 30 minutos. Os valores de integridade do RNA (RINs) foram obtidos usando o bioanalisador Agilent 2100 (amostras com RIN ≥ 7,0 foram usadas para análise posterior). Todos os procedimentos de manuseio da amostra e extração de RNA foram realizados em temperatura ambiente, salvo especificação em contrário. O reagente de resíduos TRIzol foi descartado conforme as diretrizes institucionais de resíduos químicos perigosos.

Sequenciamento de RNA

Após o tratamento com DNase I do RNA total, o mRNA foi enriquecido usando esferas magnéticas Oligo D (T) e então fragmentado em pequenos pedaços a 94 °C por 5 minutos. Os fragmentos resultantes de mRNA serviram como modelo, com oligonucleotídeo aleatório como primer. O cDNA da primeira fita foi sintetizado via sistema de transcriptase reversa M-MuLV a 42 °C por 50 minutos, seguido pela degradação das fitas de RNA mediada por RNase H. A síntese de segunda fita foi realizada usando dNTPs dentro do sistema DNA polimerase I. O cDNA de fita dupla foi purificado, as extremidades reparadas e colocado com um saliência em "A" para facilitar a ligação do adaptador. Contas AMPure XP foram utilizadas para selecionar fragmentos de cDNA de 250-300 pb, que foram então amplificados via PCR. Depois disso, os produtos amplificados foram purificados para gerar a biblioteca final. O sequenciamento de bibliotecas era realizado na plataforma Illumina HiSeq com comprimento de leitura de 150 bp em extremidade pareada. Para controle de qualidade (QC) de dados, dados brutos contendo sequências adaptadoras ou bases de baixa qualidade foram filtrados usando scripts internos. Devido a erros de sequenciamento que podem surgir do instrumento, a qualidade dos dados foi avaliada analisando a distribuição das taxas de erro de sequenciamento (a taxa de erro < 1% foi considerada aceitável). Além disso, a distribuição do conteúdo do GC foi determinada. Todos os procedimentos de sequenciamento foram realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. Reagentes contendo produtos químicos perigosos (por exemplo, tampões de DNase I) foram descartados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança.

Limites de controle de qualidade e solução de problemas

Apenas amostras com RIN ≥ 7.0 e bibliotecas com tamanho de fragmento de 250–300 bp foram usadas. Um mínimo de 14 milhões de leituras brutas por amostra, com Q30 ≥ 98% foi necessário. O baixo rendimento da biblioteca foi resolvido aumentando os ciclos de PCR para 18, mas 15 ciclos foram preferidos para manter as taxas de duplicação abaixo de 15%.

Triagem dos DEGs

Avaliamos a distribuição dos níveis de expressão gênica entre diferentes amostras. Correlação entre amostras dos níveis de expressão gênica foi usada para verificar a confiabilidade experimental e a adequação da seleção da amostra. A análise de componentes principais (ACP) foi aplicada para avaliar diferenças entre grupos e reprodutibilidade intra-grupo. Os DEGs foram identificados usando o banco de dados online Metascape (http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1). DEGs foram definidos como aqueles com |log₂(fold change) | > 1 e um valor-p < 0,05, que foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises bioinformáticas foram realizadas usando parâmetros padrão, salvo especificação em contrário. Como um ponto de verificação de reprodutibilidade intermediária, gráficos PCA foram gerados para confirmar que as amostras agrupavam por grupo e não por lote.

Análise de enriquecimento da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG)

A análise KEGG (http://www.genome.jp/) é uma abordagem sistemática para avaliar a função gênica na descoberta de vias regulatórias biológicas. Este artigo obteve primeiro o ID oficial do gene de conversão de símbolos do gene diferencial a partir de org.Hs.eg (versão 3.12.0). A análise de caminho KEGG foi realizada usando o pacote clusterProfiler no software R (versão 4.2.0). Uma p. < 0,05 foi considerada estatisticamente significativa. Um desfecho intermediário foi a geração de uma lista ordenada de vias enriquecidas com contagens genéticas correspondentes e valores p ajustados.

Análise de redes PPI

Para construir a rede PPI e o gene da chave de triagem, foi utilizado o banco de dados STRING (versão 11.0, https://string-db.org/). Apenas as interações com escore composto acima de 0,9 foram mantidas como estatisticamente significativas. A rede foi visualizada e analisada usando o Cytoscape (versão 3.10.1), uma ferramenta de bioinformática de código aberto projetada para explorar redes de interação molecular. Genes hub dentro da rede PPI foram identificados usando o plugin CytoHubba (versão 0.1).

Gene Hub

Os 20 principais genes-chave foram selecionados pelo CytoHubba Plugin. Vermelho indica altos níveis do gene. A análise bioinformática dos genes hub pelo banco de dados online Metascape (versão 3.5, http://metascape.org/gp/index) para analisar 20 genes hub anteriormente. O enriquecimento gênico foi identificado nas seguintes aulas de ontologia: WGCNA, PCA, mcode, GSEA. Todos os genes do genoma servem como base de enriquecimento. Itens com p. < 0,05, contagem mínima 3 e fator de enriquecimento > 1,5 foram avaliados.

Método de análise estatística

O software estatístico SPSS 25.0 foi utilizado para analisar os dados. Os dados de contagem foram expressos em frequência ou porcentagem, e a comparação entre os grupos foi testada pelo teste de Qui-quadrado. Os dados de medição foram consistentes com a média ± desvio padrão da distribuição normal, e o teste T foi usado para comparação entre grupos. p. < 0,05 foi considerado uma diferença significativa.

Resultados

Análise de dados de RNA-seq de genes diferenciais em placas ateroscleróticas

Apenas amostras com RIN ≥ 7.0 foram usadas para preparação da biblioteca. Todas as 14 amostras (11 AP, 3 controle) ultrapassaram esse limite. Todas as amostras foram sequenciadas em um único lote; portanto, não foi necessário ajuste do efeito de lote. Uma média de 16,8 milhões de leituras brutas por amostra foram geradas; Após filtragem de qualidade, 16,5 milhões de leituras limpas (98%) foram retidas, com 91% mapeadas de forma única ao genoma de referência humano (HG38). A análise da DEG mostrou que havia 2097 genes regulados para cima e 1616 para baixo (|log2FC| >1, P <0,05) em pacientes com placas de aterosclerose em comparação com controles saudáveis (Figura 1A). O mapa de calor dos 20 genes diferencialmente expressos com alta e baixa foi mostrado na Figura 1B. O sequenciamento do RNAseq do transcriptoma revelou correlações de amostras (Figura 1C). A correlação entre módulos gênicos coexpressos e fenótipos foi analisada pelo WGCNA (Figura 1D). A análise PCA mostrou que havia uma diferença significativa entre o grupo NA e o grupo AP (P.< 0,05) (Figura 1E).

Análise de enriquecimento KEGG de genes diferenciais

A análise de enriquecimento de vias KEGG usando o pacote clusterProfiler no software R (versão 4.2.0) foi realizada separadamente nos genes diferencialmente expressos com regulação alta e abaixo no grupo da doença (Figuras 2A,B). Os resultados mostraram que esses genes foram significativamente enriquecidos em vias relacionadas à imunidade e inflamação, como linhagem celular hematopoiética, artrite reumatoide, adesão focal, sinalização de integrina e via de sinalização quimiocina.

Análise GSEA

A análise GSEA mostrou que os genes centrais do grupo experimental eram principalmente enriquecidos no topo, mostrando uma tendência de alta (Figura 3A). Os genes centrais do grupo controle foram principalmente enriquecidos na parte inferior, mostrando tendência de queda (Figura 3B). Em resumo, genes inflamatórios foram regulados para cima no grupo experimental (ASA) e para baixo no grupo controle (NA).

Análise das redes PPI

Na rede PPI analisada usando banco de dados STRING (versão 11.0), nós que compartilham o mesmo ID de cluster tendem a estar posicionados próximos uns dos outros. Como mostrado na Figura 4A, esse agrupamento revelou que os genes correspondentes estão principalmente envolvidos na regulação da ativação celular, resposta inflamatória e ativação celular. A Figura 4B apresentou a mesma rede colorida por valores p, onde agrupamentos contendo mais genes exibem valores p mais significativos.

Identificação de genes centrais e análise de infiltração de células imunes

Os DEGs foram selecionados para análise mcode e os resultados da análise apresentados estão principalmente relacionados aos receptores de acetilcolina (Figura 5 e Tabela 2). A análise de genes hub usando o plugin CytoHubba no Cytoscape identificou os 20 principais genes hub, a maioria dos quais estava associada à imunidade e inflamação (Figura 6A, painel à esquerda). Os 10 principais genes do hub consistiam em CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 e CCR5 (Figura 6A, painel direito). A interseção dos genes hub com os genes do painel inflamatório olink 92 revelou 5 genes comuns, incluindo CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 e CCL4 (Figura 6B). A análise do CIBERSORT revelou diferenças significativas na infiltração de células imunes entre o grupo da doença e os controles saudáveis. Comparado ao grupo controle, o grupo doente apresentou uma proporção significativamente maior de macrófagos M0 (p < 0,05) (Figura 6C). Por outro lado, as proporções de células T CD8, células NK ativadas e a maioria das células em repouso foram significativamente menores no grupo da doença (p. < 0,05 para todos) (Figura 6C).

Análise funcional dos genes hub

Analisamos ainda a função biológica do gene Hub usando o banco de dados Metascape, revelando que esses genes estão principalmente associados à via de sinalização mediada por citocinas e à sinalização mediada pelo cálcio (Figura 7A e Tabela 3). Assinaturas de Tipo Celular foram então usadas para enriquecer fatores regulatórios transcricionais do gene central, mostrando que os genes centrais estavam principalmente relacionados ao gáo do intestino grosso 24W C11 semelhante a células paneth, macrófagos C8 cardíacos que desenvolvem cui e neurotipos manno mesencéfalo hmgl (Figura 7B). A análise de enriquecimento de doenças no banco de dados DisGeNET demonstrou que os genes hub estavam associados a lesões cutâneas, infecções pelo vírus Epstein-Barr e encefalite do tick-bome (Figura 7C). A análise de enriquecimento das características tecidusuais do banco de dados PaGenBase mostrou que os genes hub eram principalmente enriquecidos no baço, sangue e pulmão (Figura 7D). Além disso, a análise do banco de dados TRRUST revelou que RELA e NFKB1 são os principais fatores de transcrição que regulam os genes hub (Figura 7E).

DISPONIBILIDADE DE DADOS:

A matriz de contagem processada é fornecida como arquivos suplementares (Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2). Todos os outros dados são totalmente apresentados no artigo. Dados brutos de sequenciamento estão disponíveis do autor correspondente mediante solicitação razoável.

Figura 1: Análise de DEGs. (A) Placas saudáveis e placas ateroscleróticas, mapa diferencial de vulcões genéticos, regulação para alta 2097, para baixo 1616 (|log2FC| > 1, P .< 0,05). (B) Mapa de calor dos 20 principais genes diferencialmente expressos com alta e baixa regulação. (C) Análise de correlação amostral. (D)A correlação entre módulos gênicos coexpressos e fenótipos foi analisada pela WGCNA. (E) Análise PCA (grupo NA foi significativamente diferente do grupo AP). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Análise KEGG. A análise de enriquecimento da via KEGG foi realizada separadamente nos genes diferencialmente expressos para alta (A) e para baixo (B) no grupo da doença. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Análise GSEA. (A) A análise GSEA mostrou que os genes centrais no grupo experimental foram principalmente enriquecidos no topo, mostrando uma tendência de regulação para alta. (B) No grupo controle, os genes centrais foram principalmente enriquecidos na base e apresentaram tendência de queda. Em conclusão, os genes inflamatórios foram regulados para cima no grupo experimental (AP) e para baixo no grupo controle (NA). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Diagrama da rede PPI. (A) Colorido pelo ID de cluster, onde nós que compartilham o mesmo ID de cluster geralmente estão próximos uns dos outros. (B) Coloração com valores P, onde itens contendo mais genes possuem valores P mais significativos. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: análise mcode de DEGs. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Análise gênica do hub. (A) Os 20 melhores genes hub (painel esquerdo) e os 10 melhores genes hub (painel direito) obtidos pelo método de cálculo de graus via plugin CytoHubba no Cytoscape, que estão principalmente associados à imunidade e inflamação. (B) Interseção dos genes hub e o painel inflamatório olink 92 genes identificaram 5 genes de interseção. (C) O algoritmo CIBERSORT foi empregado para comparar a abundância de infiltração de 22 subconjuntos de células imunes entre os grupos AP e NA. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 7: Análise bioinformática dos genes hub. (A) Anotação funcional dos genes hub usando o banco de dados Metascape. (B) Análise de enriquecimento de reguladores transcricionais associados a genes hub baseada em assinaturas de tipo celular. (C) Análise de enriquecimento de doenças dos genes hub realizada com o banco de dados DisGeNET. (D) Padrões de expressão específicos de tecidos de genes hub identificados via banco de dados PaGenBase. (E) Rede reguladora transcricional de genes hub analisada usando o banco de dados TRRUST. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

MCODE	VAI	Descrição	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Receptores de acetilcolina nicotínica altamente permeáveis ao cálcio	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Receptores de acetilcolina nicotínica pré-sinápticos	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Receptores de acetilcolina nicotínica pós-sinápticos altamente permeáveis ao cálcio	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Canais de potássio em domínio de poros tandem	-10.3
MCODE_2	VAI:0030322	Estabilização do potencial de membrana	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Fase 4 - potencial de membrana de repouso	-9.7

Tabela 1: As características basais dos pacientes com PA

MCODE	VAI	Descrição	Log10(P)
MCODE_1	VAI:0030322	Receptores de acetilcolina nicotínica altamente permeáveis ao cálcio	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	Receptores de acetilcolina nicotínica pré-sinápticos	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	Receptores de acetilcolina nicotínica pós-sinápticos altamente permeáveis ao cálcio	-16.7

Tabela 2: A análise de enriquecimento MCODE dos DEGs.

MCODE	VAI	Descrição	Log10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	Receptores de acetilcolina nicotínica altamente permeáveis ao cálcio	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	Receptores de acetilcolina nicotínica pré-sinápticos	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	Receptores de acetilcolina nicotínica pós-sinápticos altamente permeáveis ao cálcio	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	Canais de potássio em domínio de poros tandem	-10.3
MCODE_2	VAI:0030322	Estabilização do potencial de membrana	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	Fase 4 - potencial de membrana de repouso	-9.7

Tabela 3: A análise de enriquecimento MCODE do gene hub.

Arquivo Suplementar 1: Controle (n=3) expressão gênica.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Pacientes (n=10) Gene da tabela central.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Com o aprofundamento contínuo das pesquisas sobre PA, novas citocinas são constantemente detectadas na PA, e a inflamação tornou-se um fator importante na gênese e desenvolvimento da^{AS 21,22}. A ativação da albumina pode romper a conexão entre as células endoteliais e a matriz íntima vascular e promover a descolagem das células endoteliais da íntima vascular. Lesão vascular intima^{induzida 23,24}. A inflamação induz a modificação oxidativa do LDL-C, e o LDL-C modificado, por sua vez, leva ao processo inflamatório na íntima da artéria, acelerando assim a formação de^{AP 25}. Placas instáveis podem eventualmente romper e causar SCA por causa de causas internas e^{externas 26}. Durante a ruptura da placa, macrófagos, células musculares lisas vasculares (VSMC) e linfócitos secretam fatores inflamatórios como interleucina-1 leucocitária (IL-1), IL-6, fator de adesão intervascular-1 e fator de adesão intercelular-1. Simultaneamente, a expressão da integrina leucocitária (CD11b/CD18), um receptor em monócitos e granulócitos, é^{aumentada em 27,28}. No entanto, o mecanismo molecular da inflamação que leva à formação da AP ainda precisa ser explorado mais a fundo.

A ocorrência e o desenvolvimento da PA causada pela inflamação é um curso complexo de ação multifator, mudança multigênica e doença em múltiplos estágios, especialmente intimamente relacionado à expressão anormal de muitos genes. Neste estudo, análises de RNA-Seq e bioinformática revelaram que, entre tecidos de controle saudáveis e AP, o gráfico vulcânico dos DEGs mostrou 2097 genes regulados para cima e 1616 para baixo. Análises adicionais de enriquecimento KEGG dos DEGs demonstraram que os DEGs estavam principalmente enriquecidos em vias relacionadas ao sistema imunológico e inflamatório. A análise do gene hub identificou os 10 principais genes hub, consistindo em CXCR4, CCL4, CCL3, CCL20, CXCL1, CCL5, CXCL8, CD4, CCR2 e CCR5. A interseção dos genes hub com os genes do painel inflamatório olink 92 revelou 5 genes comuns, incluindo CXCL1, CCL20, TNF, CCL3 e CCL4. Esses resultados sugerem que os fatores relacionados à inflamação CCL3, CCL4 e CXCL1 podem desempenhar um papel crucial no processo patológico da AP. A análise de infiltração imune revelou um microambiente distinto caracterizado por um aumento significativo nos macrófagos M0, juntamente com reduções nas células T CD8⁺, células NK ativadas e mastócitos em repouso dentro das placas.

Macrófagos M0 representam um pool não comprometido que pode internalizar facilmente LDL oxidado e se diferenciar em células de espuma, um evento marcante na aterogênese^{inicial 29}. A proporção elevada de macrófagos M0 observada no grupo da doença indica um acúmulo dessas células precursoras no microambiente da placa. CCL4, produzido principalmente por macrófagos e células T ativadas, atua como um estímulo persistente que sustenta a ativação dos macrófagos via via via sinalização NFκB, promove a expressão de moléculas de adesão e induz a metaloproteinase matricial-2 e -9, facilitando assim a transição dos macrófagos M0 para um estado pró-aterogênico e comprometendo diretamente a estabilidade da placa³⁰. A proporção reduzida de células T CD8⁺ pode refletir a supressão mediada por CCL3 dos subconjuntos ateroprotetores de células T. Komissarov et al. demonstraram que a migração das células T para placas ateroscleróticas humanas ocorre predominantemente pelo eixo CCR5-CCL3³¹. Além disso, Döring et ^al.32 descobriram uma via não canônica pela qual CCL17 sinaliza através do CCR8 para induzir a expressão de CCL3, o que, por sua vez, suprime a diferenciação regulatória das células T; a ablação genética de CCL3 em células T CD4⁺ aumentou os números de FoxP3⁺ Treg e limitou a aterosclerose, enquanto a administração de CCL3 agravou a doença e restringiu a diferenciação de Treg. Essa mudança provavelmente diminui as células T reguladoras CD8⁺ ateroprotetoras enquanto promove células T patogênicas efetivas, resultando na diminuição líquida da proporção de células CD8⁺ observada em nossa análise. As reduções nas células NK ativadas e nos mastócitos em repouso provavelmente refletem alterações no status de ativação, e não uma perda absoluta dessas populações. Bonaccorsi et ^al.33 relataram que placas carótidas sintomáticas apresentam aumento da infiltração de células NK e produção de IFN-γ, ligando diretamente a ativação das células NK à instabilidade clínica da placa. Para os mastócitos, Wezel et ^al.34 demonstraram que quimiocinas liberadas pelos mastócitos ativados, particularmente CXCL1, induzem o recrutamento de neutrófilos pelo eixo CXCL1/CXCR2, agravando assim a resposta inflamatória em andamento e promovendo a progressão e desestabilização da placa. Assim, a diminuição da proporção de células NK ativadas e mastócitos em repouso provavelmente reflete sua ativação, desgranulação ou exaustão dentro do meio inflamatório da placa, em vez de uma verdadeira depleção numérica.

Existem várias limitações neste estudo. Primeiro, este estudo é baseado exclusivamente no sequenciamento do transcriptoma e é limitado pelo tamanho reduzido da amostra. Além do tamanho limitado da amostra, devem ser observadas várias limitações técnicas do protocolo RNA-seq. O RNA-seq em massa mascara a heterogeneidade celular; Abordagens de célula única são necessárias para resolver a expressão específica de CCL3, CCL4 e CXCL1 por tipo de célula. A deconvolução imune computacional (CIBERSORT) fornece apenas estimativas, não medições diretas. A abundância de RNA nem sempre se correlaciona com os níveis de proteína; validação ortogonal é necessária. Estudos futuros devem abordar essas limitações utilizando transcriptômica unicelular, coortes maiores e independentes, validação ortogonal de proteínas.

Em conclusão, os achados atuais ressaltaram o importante papel dos fatores inflamatórios no processo fisiopatológico da AP. Além disso, identificamos os genes hub CCL3, CCL4 e CXCL1, que podem formar uma rede coordenada de quimiocinas que impulsiona a aterosclerose promovendo o acúmulo de macrófagos M0, suprimindo subconjuntos protetores de células T e alterando os estados de ativação das células NK e mastócitos. No geral, esses achados destacam as três quimiocinas como reguladores críticos do microambiente imune da placa e potenciais alvos terapêuticos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Trizol	Invitrogen	15596026CN	Extração de RNA
Espectrofotômetro Nanodrop ND-2000	Thermo Fisher Scientific	ND2000	Detecção de concentração de RNA
Bioanalisador Agilent 2100	Agilent	G2939BA	Controle de qualidade de RNA
Illumina HiSeq TM 2000	Illumina	HiSeq 2000	Sequenciamento de transcriptoma
Esferas magnéticas Oligo D (T)	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	S1550S	Enriquecimento de RNA