Teste de Neutralização de Redução de Fluorescência do Vírus Hepatite E para Medição de Títulos de Anticorpos Neutralizantes

Summary

Não existe um ensaio padrão de neutralização viral disponível para o Vírus da Hepatite E (HEV), um vírus de RNA de fita positiva não citopático. Aqui, um teste de neutralização de redução de fluorescência (FRNT) baseado na quantificação da proteína capsídea viral marcada com fluorescência é descrito para avaliar a eficácia de anticorpos anti-HEV.

Abstract

O ensaio de neutralização viral mede o potencial de neutralização de um anticorpo ou de uma mistura de anticorpos contra o vírus correspondente. É uma técnica valiosa para avaliar a eficácia de candidatos a vacina e anticorpos neutralizantes desenvolvidos contra o vírus. O teste de neutralização de redução de placas (PRNT) é um método popular para avaliar o título dos anticorpos neutralizantes específicos do vírus. No entanto, o PRNT não é viável no caso de vírus não citopáticos. O vírus da Hepatite E (HEV) é um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo, pertencente à família Hepeviridae. É uma das principais causas da hepatite viral aguda em todo o mundo. Não apresenta nenhum efeito citopático em culturas celulares de mamíferos. Uma vacina contra o HEV está disponível na China. No entanto, vacinas ou anticorpos terapêuticos contra o HEV não estão disponíveis na maior parte do mundo. Vários laboratórios têm trabalhado em candidatos a vacina contra o HEV. Um ensaio de neutralização para medir a eficácia das vacinas contra o HEV será uma ferramenta muito útil para os pesquisadores. Aqui, descrevemos um teste de neutralização por redução de fluorescência (FRNT) para estimar o título de neutralização de 50% (NT₅₀) dos anticorpos anti-HEV. Neutralizado com ORF2 anti-HEV, ou HEV neutralizado com IgG em coelhos, foi usado para infectar células Huh7, seguido pela coloração imunofluorescente da proteína viral ORF2. Células fluorescentes positivas foram quantificadas na aplicação ImageJ, e NT₅₀ foi estimado em 2,1 x 10³. Esse método pode ser aplicado para estimar o NT₅₀ de anticorpos anti-HEV presentes em soros de camundongos imunizados, soros individuais recuperados por HEV e anticorpos anti-HEV produzidos em laboratório.

Introduction

O vírus da Hepatite E (HEV) é um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo que pertence à família Hepeviridae ^1,2. Geralmente causa hepatite aguda autolimitada, mas pode causar hepatite crônica em indivíduos imunossuprimidos ^3,4. Mulheres grávidas têm alto risco de desenvolver insuficiência hepática fulminante, com a taxa de mortalidade aumentando até 30^%. A Organização Mundial da Saúde (OMS) relatou cerca de 19,47 milhões de casos de hepatite aguda E (AHE) e 3.450 mortes causada....

Protocol

Foi obtida aprovação do comitê de ética institucional (IEC) para coletar uma amostra fecal de um paciente infectado com HEV internado no Departamento de Gastroenterologia do AIIMS, em Nova Délhi. Foi obtido consentimento informado dos pacientes participantes do estudo. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento e quantificação do vírus

1. Com consentimento informado, obtenha a amostra fecal de um paciente infectado com HEV para purificação do vírus.
2. Resuspenda a amostra fecal na soro salino....

Results

Infecção de células Huh7 com caracterização de g1-HEV e vírus

O g1-HEV foi isolado de uma amostra fecal usando uma série de etapas, como ilustrado (Figura 1A). O número de cópias genômicas do g1-HEV purificado foi estimado por RT-qPCR, seguido pelo armazenamento a -80 °C. Para confirmar infecção viral e replicação, células Huh7 foram infectadas com equivalentes de 1,8 ×¹⁰ cópias genômicas do estoque pu.......

Discussion

FRNT é um método baseado em imunocoloração para estimar o potencial neutralizante de anticorpos. Ele tem sido usado para estimar valores NT₅₀ para anticorpos contra múltiplos vírus, incluindo vírus da Dengue (DENV), Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus-2 (SARS-CoV-2) e vírus da encefalite japonesa (JEV⁾23,24,25. Nesse método, o vírus é incubado com um anticorpo de teste (ou s.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos microfúgios de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
Prato de cultura celular de 12 poços	Corning	3512
Agitador incubador de 37 graus	Termo Científica	50163013
4′,6-diamidino-2-fenilindol	Abcam	AB104139	DAPI
Tubo centrífugo de 50mL	Falcon	352070
Prato de cultura celular de 6 poços	Corning	3516
Anticorpo secundário IgG da farinha Alexa 594	Termo Científica	A-11012
Anticorpo anti-ORF2	Genscript	NA	Sintetizado sob medida pela Genscript e caracterizado em nosso laboratório14
Anticorpo IgG anti-coelho	Genscript	NA
Albumina Sérica Bovina	HIMÍDIA	MB083	BSA
Microscópio confocal	Olympus	FV3000
DMEM, glicose alta	HIMÍDIA	AL007A
Soro Fetal Bovino	GIBCO	16000-044	FBS
ImageJ 1.54g	ImageJ.org (Wayne Rasband e colaboradores, NIH, EUA)
Soro Normal de Cabra	HIMÍDIA	RM-10701
Paraformaldeído	HIMÍDIA	GRN3660	PFA
Soro tampão de fosfato pH 7,4	HIMÍDIA	TL1006	PBS
Polietileneglicol 6000	SIGMA	81255	PEG6000
Kit de Sonda de 1 etapa do SOLIScript	SOLIS BIODYNE	08-57-00250
Reagente TRI	Centro de Pesquisa Molecular	TR118
Triton X100	SIGMA	X100
Tripsina-EDTA	GIBCO	25300-54