Não existe um ensaio padrão de neutralização viral disponível para o Vírus da Hepatite E (HEV), um vírus de RNA de fita positiva não citopático. Aqui, um teste de neutralização de redução de fluorescência (FRNT) baseado na quantificação da proteína capsídea viral marcada com fluorescência é descrito para avaliar a eficácia de anticorpos anti-HEV.
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Artigo de método
Teste de Neutralização de Redução de Fluorescência do Vírus Hepatite E para Medição de Títulos de Anticorpos Neutralizantes
Neste artigo
Resumo
Resumo
O ensaio de neutralização viral mede o potencial de neutralização de um anticorpo ou de uma mistura de anticorpos contra o vírus correspondente. É uma técnica valiosa para avaliar a eficácia de candidatos a vacina e anticorpos neutralizantes desenvolvidos contra o vírus. O teste de neutralização de redução de placas (PRNT) é um método popular para avaliar o título dos anticorpos neutralizantes específicos do vírus. No entanto, o PRNT não é viável no caso de vírus não citopáticos. O vírus da Hepatite E (HEV) é um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo, pertencente à família Hepeviridae. É uma das principais causas da hepatite viral aguda em todo o mundo. Não apresenta nenhum efeito citopático em culturas celulares de mamíferos. Uma vacina contra o HEV está disponível na China. No entanto, vacinas ou anticorpos terapêuticos contra o HEV não estão disponíveis na maior parte do mundo. Vários laboratórios têm trabalhado em candidatos a vacina contra o HEV. Um ensaio de neutralização para medir a eficácia das vacinas contra o HEV será uma ferramenta muito útil para os pesquisadores. Aqui, descrevemos um teste de neutralização por redução de fluorescência (FRNT) para estimar o título de neutralização de 50% (NT50) dos anticorpos anti-HEV. Neutralizado com ORF2 anti-HEV, ou HEV neutralizado com IgG em coelhos, foi usado para infectar células Huh7, seguido pela coloração imunofluorescente da proteína viral ORF2. Células fluorescentes positivas foram quantificadas na aplicação ImageJ, e NT50 foi estimado em 2,1 x 103. Esse método pode ser aplicado para estimar o NT50 de anticorpos anti-HEV presentes em soros de camundongos imunizados, soros individuais recuperados por HEV e anticorpos anti-HEV produzidos em laboratório.
Introdução
O vírus da Hepatite E (HEV) é um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo que pertence à família Hepeviridae 1,2. Geralmente causa hepatite aguda autolimitada, mas pode causar hepatite crônica em indivíduos imunossuprimidos 3,4. Mulheres grávidas têm alto risco de desenvolver insuficiência hepática fulminante, com a taxa de mortalidade aumentando até 30%. A Organização Mundial da Saúde (OMS) relatou cerca de 19,47 milhões de casos de hepatite aguda E (AHE) e 3.450 mortes causada....
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Protocolo
Foi obtida aprovação do comitê de ética institucional (IEC) para coletar uma amostra fecal de um paciente infectado com HEV internado no Departamento de Gastroenterologia do AIIMS, em Nova Délhi. Foi obtido consentimento informado dos pacientes participantes do estudo. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento e quantificação do vírus
- Com consentimento informado, obtenha a amostra fecal de um paciente infectado com HEV para purificação do vírus.
- Resuspenda a amostra fecal na soro salino....
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Resultados
Infecção de células Huh7 com caracterização de g1-HEV e vírus
O g1-HEV foi isolado de uma amostra fecal usando uma série de etapas, como ilustrado (Figura 1A). O número de cópias genômicas do g1-HEV purificado foi estimado por RT-qPCR, seguido pelo armazenamento a -80 °C. Para confirmar infecção viral e replicação, células Huh7 foram infectadas com equivalentes de 1,8 ×10 cópias genômicas do estoque pu.......
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Discussão
FRNT é um método baseado em imunocoloração para estimar o potencial neutralizante de anticorpos. Ele tem sido usado para estimar valores NT50 para anticorpos contra múltiplos vírus, incluindo vírus da Dengue (DENV), Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus-2 (SARS-CoV-2) e vírus da encefalite japonesa (JEV)23,24,25. Nesse método, o vírus é incubado com um anticorpo de teste (ou s.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Agradecimentos
Essa pesquisa foi parcialmente financiada por uma bolsa do Conselho de Assistência à Pesquisa da Indústria de Biotecnologia, Departamento de Biotecnologia do Governo da Índia, concedida a MS, S e BN. A pesquisa no laboratório de EM é apoiada por uma bolsa central do Instituto de Ciências e Tecnologia em Saúde Translacional. A SA é apoiada por uma posição de Cientista de Pesquisa de Projeto financiada pelo Conselho Indiano de Pesquisa Médica, Governo da Índia. A UB conta com o apoio de uma Bolsa de Pesquisa Sênior do Departamento de Biotecnologia do Governo da Índia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL microfuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 12-well cell culture dish | Corning | 3512 | |
| 37 degree incubator shaker | Thermo Scientific | 50163013 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole | Abcam | AB104139 | DAPI |
| 50mL centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
| 6-well cell culture dish | Corning | 3516 | |
| Alexa flour 594 secondary IgG Antibody | Thermo Scientific | A-11012 | |
| Anti-ORF2 antibody | Genscript | NA | Custom synthesized by Genscript and characterized in our laboratory14 |
| Anti-rabbit IgG antibody | Genscript | NA | |
| Bovine Serum Albumin | HIMEDIA | MB083 | BSA |
| Confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| DMEM, high glucose | HIMEDIA | AL007A | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 16000-044 | FBS |
| ImageJ 1.54g | ImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA) | ||
| Normal Goat Serum | HIMEDIA | RM-10701 | |
| Paraformaldehyde | HIMEDIA | GRN3660 | PFA |
| Phosphate Buffer Saline pH 7.4 | HIMEDIA | TL1006 | PBS |
| Polyethyleneglycol 6000 | SIGMA | 81255 | PEG6000 |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | SOLIS BIODYNE | 08-57-00250 | |
| TRI reagent | Molecular Research Centre | TR118 | |
| Triton X100 | SIGMA | X100 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300-54 |
Referências
- Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
- Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Fron....
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Reimpressões e permissões
