Method Article

Teste de Neutralização de Redução de Fluorescência do Vírus Hepatite E para Medição de Títulos de Anticorpos Neutralizantes

DOI:

10.3791/69892

⸱

May 22nd, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não existe um ensaio padrão de neutralização viral disponível para o Vírus da Hepatite E (HEV), um vírus de RNA de fita positiva não citopático. Aqui, um teste de neutralização de redução de fluorescência (FRNT) baseado na quantificação da proteína capsídea viral marcada com fluorescência é descrito para avaliar a eficácia de anticorpos anti-HEV.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ensaio de neutralização viral mede o potencial de neutralização de um anticorpo ou de uma mistura de anticorpos contra o vírus correspondente. É uma técnica valiosa para avaliar a eficácia de candidatos a vacina e anticorpos neutralizantes desenvolvidos contra o vírus. O teste de neutralização de redução de placas (PRNT) é um método popular para avaliar o título dos anticorpos neutralizantes específicos do vírus. No entanto, o PRNT não é viável no caso de vírus não citopáticos. O vírus da Hepatite E (HEV) é um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo, pertencente à família Hepeviridae. É uma das principais causas da hepatite viral aguda em todo o mundo. Não apresenta nenhum efeito citopático em culturas celulares de mamíferos. Uma vacina contra o HEV está disponível na China. No entanto, vacinas ou anticorpos terapêuticos contra o HEV não estão disponíveis na maior parte do mundo. Vários laboratórios têm trabalhado em candidatos a vacina contra o HEV. Um ensaio de neutralização para medir a eficácia das vacinas contra o HEV será uma ferramenta muito útil para os pesquisadores. Aqui, descrevemos um teste de neutralização por redução de fluorescência (FRNT) para estimar o título de neutralização de 50% (NT50) dos anticorpos anti-HEV. Neutralizado com ORF2 anti-HEV, ou HEV neutralizado com IgG em coelhos, foi usado para infectar células Huh7, seguido pela coloração imunofluorescente da proteína viral ORF2. Células fluorescentes positivas foram quantificadas na aplicação ImageJ, e NT50 foi estimado em 2,1 x 103. Esse método pode ser aplicado para estimar o NT50 de anticorpos anti-HEV presentes em soros de camundongos imunizados, soros individuais recuperados por HEV e anticorpos anti-HEV produzidos em laboratório.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O vírus da Hepatite E (HEV) é um vírus de RNA de fita simples de sentido positivo que pertence à família Hepeviridae 1,2. Geralmente causa hepatite aguda autolimitada, mas pode causar hepatite crônica em indivíduos imunossuprimidos 3,4. Mulheres grávidas têm alto risco de desenvolver insuficiência hepática fulminante, com a taxa de mortalidade aumentando até 30%. A Organização Mundial da Saúde (OMS) relatou cerca de 19,47 milhões de casos de hepatite aguda E (AHE) e 3.450 mortes causadas pelo HEV globalmente em 20216. O HEV é transmitido em países em desenvolvimento principalmente por alimentos e água contaminados, devido à saneamento precário, enquanto infecções ocupacionais esporádicas em países desenvolvidos estão associadas ao consumo de carne crua ou malcozida 6. O HEV é classificado em oito genótipos. O genótipo (g) 1- e g2- HEV infectam exclusivamente humanos. g3- e g4-HEV possuem uma ampla variedade de hospedeiros, como humanos, coelhos, suínos, javalis e cervos. g5- e g6-HEV infectam javalis, enquanto g7- e g8-HEV infectam camelos. Um único caso de transmissão humana do g7-HEV foi relatado no Oriente Médio por meio do consumo de carne e leite decamelo 7,8. A infecção por HEV é mais comum em países de baixa a média renda. Vários surtos transmitidos pela água foram relatados em regiões endêmicas do Sul e Sudeste Asiático, África e México, principalmente causados por infecção por g1 e menos frequentemente por infecção por g2-HEV. Casos de infecção ocupacional esporádica em países desenvolvidos da Europa e do Leste Asiático são principalmente causados pelo g3-HEV 6,7.

O genoma do HEV é um RNA de fita mais de 7,2 kb que contém uma cápsula de 7-metilguanina na extremidade 5′, três quadros de leitura abertos (ORFs) seguidos por uma extremidade poli-adenilada de 3'. ORF1 codifica a poliproteína não estrutural, composta por sete domínios distintos: metiltransferase (Met), domínio Y, protease de cisteína semelhante a Papain (PCP), domínio V, macrodomínio (domínio X), helicase (Hel) e RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). O ORF2 codifica a proteína da capsíde, responsável pela montagem da capsídea viral. ORF3 codifica uma fosfoproteína que atua como viroporina e auxilia na saídaviral 9. Um quadro de leitura aberto adicional, ORF4, está presente no g1-HEV, que é traduzido por meio de um mecanismo independente da tampo, usando um elemento interno semelhante ao sítio de entrada de ribossomo localizado dentro do ORF1. A expressão de ORF4 é potencializada por compostos indutores de estresse no retículo endoplasmático. O ORF4 foi proposto para promover o complexo de replicação g1-HEV montagem10.

Embora o HEV não se replique de forma eficiente in vitro, algumas cepas do vírus, isoladas de pacientes com hepatite E, foram propagadas com sucesso em hepatócitos, linhagem celular pulmonar e linha celular epitelialdo cólon 11. No entanto, é difícil propagar o vírus de forma robusta nas células cultivadas. Clone infeccioso de cDNA de g1-HEV (cepa Sar55) tem sido usado em estudos in vitro, mas a produção e propagação eficiente de cepas de g1-HEV em células cultivadas ainda não foram alcançadas. Algumas cepas g3- e g4-HEV crescem melhor em célulascultivadas 12. No entanto, o vírus purificado produzido a partir de células transfectadas com o RNA genômico HEV transcrito in vitro e capado-p6 não é suficiente para múltiplos ensaios. Além disso, todas as partículas de HEV produzidas por culturas celulares são quase-envolvidas, o que afeta sua infectividade. Em contraste, o HEV encontrado em alimentos e água contaminados não é envolto e altamente infeccioso. O HEV presente nas fezes dos pacientes não é envolto e é a fonte comum de infecção natural. Portanto, o uso de HEV purificado das fezes do paciente garante uma infecção eficiente no sistema de cultura celular de mamíferos. Nossos estudos anteriores demonstraram a confiabilidade do g1-HEV purificado por fezes do paciente na quantificação da replicação viral em células de hepatoma humano (Huh7). Vírus purificado armazenado em -80 °C mantém a infectividade por vários anos, e já foi usado em vários estudos independentes para estimar a replicaçãoviral 10,13,14,15. Este estudo desenvolveu um ensaio de neutralização de HEV usando g1-HEV purificado obtido de um paciente. O vírus foi purificado, titulado, caracterizado e armazenado em alíquotas a -80 °C para uso futuro em ensaios de neutralização. Como o HEV não é citopático, o método tradicional PRNT não é útil para estimar o potencial de neutralização viral dos anticorpos anti-HEV. Houve várias tentativas de desenvolver ensaios de neutralização para HEV, incluindo um ensaio de neutralização baseado em citometria de fluxo, um ensaio de neutralização baseado em kit ELISA de antígenos para detectar pORF2 secretado em supernadantes celulares, um ensaio de ligação baseado em ELISA in vitro, um ensaio baseado em RT-PCR e um ensaio de neutralização baseado emfluorescência 16,17,18,19,20 . Um ensaio baseado em ELISA detecta indiretamente a ligação de anticorpos para avaliar a neutralização funcional do vírus, mas não pode medir a infecção real. O método baseado em citometria de fluxo geralmente mede a porcentagem de células infectadas usando um pseudovírus. O método de neutralização baseado em RT-PCR é mais complicado que o FRNT; portanto, as chances de erro de manuseio são maiores. Por outro lado, o método FRNT descrito aqui é limitado pela disponibilidade de vírus infecciosos de alto título e capacidades de imagem. No entanto, é um método eficiente para medir NT50 dos anticorpos anti-HEV.

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Protocol

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Foi obtida aprovação do comitê de ética institucional (IEC) para coletar uma amostra fecal de um paciente infectado com HEV internado no Departamento de Gastroenterologia do AIIMS, em Nova Délhi. Foi obtido consentimento informado dos pacientes participantes do estudo. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento e quantificação do vírus

  1. Com consentimento informado, obtenha a amostra fecal de um paciente infectado com HEV para purificação do vírus.
  2. Resuspenda a amostra fecal na soro salino tamponado com fosfato (DPBS) de Dulbecco a 10% da concentração final (p/v) e centrifuge a 7800 x g por 1h a 4 °C.
    NOTA: Use luvas ao manusear a amostra fecal de HEV e limpe a área de trabalho com etanol 70% após o trabalho (realize todas as etapas dentro de um armário de Biossegurança).
  3. Colete o sobrenadante e passe por um filtro de 0,45 μm.
  4. Adicione 8% PEG6000 preparado em 0,4 M de NaCl ao sobrenadante viral e incube por 16 horas a 0 °C.
  5. Centrifuge a amostra a 18.000 x g por 30 minutos a 4 °C.
  6. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet em 40 mL do Modified Eagle Medium (DMEM) da Dulbecco.
  7. Concentre a suspensão a 5 mL de volume por filtração de fluxo tangencial (TFF) usando um cartucho de membrana de 30 kDa. Filtre por um filtro de 0,2 μm dentro do gabinete de Biossegurança, faça alíquotas e armazene a -80 °C. Use uma alíquota para isolar o RNA total e realizar a RT-qPCR.
  8. Use múltiplas diluições do plasmídeo pSK-HEV2 [vetor pBluscript contendo cDNA de um clone infeccioso de g1-HEV (ID Genbank: AF444002.1)] (1 ng a 0,000001 ng de DNA/reação com diluição serial 10x) para traçar um padrão para quantificação de RNA viral.
  9. Plote o gráfico com a quantidade de DNA pSK-HEV2 no eixo X e os valores correspondentes de Ct no eixo Y. Extrapola a concentração de RNA viral a partir do gráfico padrão.
  10. Quantifique o nível de RNA genômico do HEV a partir do gráfico padrão e calcule o número de cópias genômicas do vírus usando a seguinte fórmula: Número de cópias = ng*(número/mol) / bases *(ng/g)*(g/mol de bases).

2. Infecção das células Huh7 com g1-HEV

  1. Pegue um frasco T75 contendo células Huh7. Verifique ao microscópio se as células estão confluentes e saudáveis.
  2. Remova a mídia por aspirador (realize todas as etapas no gabinete de biossegurança). Adicione 10 mL de DPBS, faça girar e remova.
  3. Adicione 1 mL de solução de tripsina a 0,05%, garantindo que ela seja distribuída uniformemente na superfície.
  4. Incubar dentro de uma incubadora deCO2 por 30–60 segundos, até que as células estejam 90% descoladas.
  5. Adicione 5 mL de meio completo, espalhe-o uniformemente por toda a superfície do T75 e pipete várias vezes para criar uma população unicelular uniforme, livre de agregados.
  6. Transfira a suspensão da célula para um tubo cônico de 50 mL, centrífuga a 200 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
  7. Aspire o meio de cultura do tubo cônico dentro do gabinete de biossegurança.
  8. Adicione 5 mL de meio completo ao tubo e suspenda as células em uma suspensão uniforme por meio de pipeteamento suave.
  9. Pegue 10 μL de suspensão de células e coloque em uma lâmina contadora de células. Conte as células em 4 quadrantes, calcule a média/mL.
  10. Semear 0,5 x 106 células/poço de uma placa de 6 poços em 2 mL de DMEM (suplementado com 10% de FBS).
  11. No dia seguinte, remova o meio, lave 1 mL de DPBS e adicione 50 μL do vírus g1-HEV (equivalente a 4,5 × 10 cópiasgenômicasdo g1-HEV purificado) em 1 mL de meio sem soro (SFM).
  12. Incube as células em uma incubadora de 5% deCO2 a 37 °C por 1 hora.
  13. Lave as células com 500 μL de DPBS, depois adicione 2 mL de meio completo (DMEM suplementado com 2% de FBS).
  14. Incubar as células por 72 h em uma incubadora de 5% de CO2 a 37 °C.
  15. Prossiga para os ensaios a jusante.

3. Ensaio RT-qPCR

  1. Remova o meio de crescimento da placa de 6 poços (do passo 2.15) e lave as células com 1 mL de DPBS.
  2. Adicione 1 mL de reagente TRI diretamente na placa de 6 poços para lisar as células. Pipete o lisado várias vezes, depois transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    NOTA: O reagente TRI é tóxico se inalado, engolido ou se entrar em contato com a pele. Use luvas de proteção ao usar o reagente e evite respirar vapores. Preferencialmente, use dentro do capuz químico. Todo material plástico deve ser de qualidade livre de RNAse.
  3. Incube as amostras em temperatura ambiente por 5 minutos. Adicione 0,2 mL de clorofórmio, tape firmemente o tubo e depois faça vórtice por 10–15 s (O clorofórmio é perigoso e tóxico; manuseio com EPI adequado). Incube por 2–3 minutos.
  4. Centrifuge as amostras por 15 minutos a 12.000 × g a 4 °C. Transfira a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 0,5 mL de isopropanol à fase aquosa e misture bem invertendo o tubo algumas vezes.
  5. Incube por 10 minutos em temperatura ambiente.
  6. Centrifugar por 10 minutos a 12.000 × g a 4 °C. Descarte o supernadante.
  7. Ressuspenda o pellet em 1 mL de etanol a 75%. Centrifuge por 5 minutos a 7500 × g a 4 °C. Descarte o supernadante.
  8. Seque o pellet de RNA ao ar por 5 a 10 minutos.
  9. Ressuspenda o pellet em água livre de nuclease (NFW) de 50 μL, incube a 55 °C por 10 minutos, misture por toque manual e meça a concentração de RNA por espectrofotometria.
  10. Realize RT-qPCR de um passo baseado em sonda TaqMan usando os seguintes Primers:
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    G1-Sonda HEV: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGGAATCACC [BHQ1]3′; Ribonuclease P (RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    RP Probe: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG[BHQ1]3′.
  11. Calcule a quantificação relativa do RNA g1-HEV usando o método 2−ΔΔCT .

4. Ensaio de imunofluorescência (IFA)

  1. Divida as células Huh7 conforme descrito nos passos anteriores.
  2. Coloque o revestimento de vidro de grau microscopico em uma placa de 12 poços e seme 0,2 ×10 6 células/poço em meio completo de 1 mL (DMEM suplementado com 10% de FBS).
  3. Infectar as células com cópias genômicas 1,8 × 104 do g1-HEV purificado em 500 μL SFM. Incube as células em uma incubadora de 5% deCO2 a 37 °C por 1 hora.
  4. Lave as células três vezes com 500 μL de DPBS.
  5. Adicione 2 mL de mídia completa (DMEM complementado com 2% de FBS).
  6. Incubar as células por 72 horas em incubadora de 5%CO2 , 37 °C.
  7. Lave as células três vezes com 500 μL de DPBS, incubando por 5 minutos em temperatura ambiente entre cada lavagem.
  8. Adicione 500 μL de PFA a 4% (Paraformaldeído) às células e incube por 20 minutos em temperatura ambiente.
    NOTA: O PFA a 4% é prejudicial se inalado, causa irritação na pele e nos olhos, e pode causar reação alérgica na pele. Por segurança, use luvas de proteção e proteção ocular ao usar o reagente e evite respirar vapores.
  9. Lave as células com 500 μL de DPBS, três vezes por 5 minutos cada, e incube em DPBS por 30 minutos.
  10. Adicione 250 μL de solução bloqueante (5% Soro Normal de Cabra, 0,5% BSA, 0,3% Triton X-100 em DPBS) às células e incube por 1 hora em temperatura ambiente (RT).
  11. Remover a solução bloqueante, lavar uma vez com 500 μL de DPBS e incubar as células com 250 μL de anticorpo primário (DPBS, 0,3% Triton X-100, 5% BSA, 0,5% Soro de Cabra Normal, diluição 1:500 do anticorpo anti-ORF2 ou IgG de coelho), durante a noite a 4 °C.
  12. Lave as células com 500 μL de DPBS três vezes por 5 minutos cada.
  13. Incubar as células com anticorpo secundário (DPBS, 0,3% Triton X-100, 5% BSA, 0,5% Soro Normal de Cabra, diluição 1:1000 do anticorpo anti-coelho Alexa fluor 594) por 1 hora na RT.
  14. Lave as células três vezes com DPBS por 5 minutos cada. Adicione 10 μL de reagente antidesfaçamento de ouro Prolong com solução DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) à lâmina de vidro. Monte as células contendo o coverslip, com as células voltadas para a solução DAPI em lâminas de vidro, evitando bolhas de ar.
  15. Sele a capa com tinta para unhas.
  16. Adquira imagens fluorescentes em um microscópio confocal com objetiva 60x.
  17. Ajuste o microscópio para visualização e aquisição de sinais fluorescentes.
  18. Primeiro, foque os núcleos na lâmina correspondentes a células simuladas (não infectadas) com ampliação de 60x. Ajuste a tensão de limiar e o laser para que nenhum sinal de fluorescência de fundo seja visível. Verifique a lâmina de controle com anticorpo (IgG de coelho) e verifique se não há sinal de fluorescência de fundo visível.
  19. Visualize lâminas de células infectadas por HEV sem alterar os parâmetros acima. Adquira imagens em 1028 x 1028 pixels.

5. Teste de Neutralização por Redução de Fluorescência (FRNT)

  1. Neutralização do vírus e infecção de células Huh7
    1. Divida as células Huh7 conforme descrito nos passos anteriores. Coloque o engobe de cobertura em uma placa de 12 poços e semeie 0,2 × 106 células/poço em meio completo de 1 mL (DMEM + 10% FBS).
    2. No dia seguinte, prepare uma diluição serial de 10 vezes de anticorpos (anti-ORF2 e IgG de coelho) em SFM com concentração inicial de 25 μg/mL de anticorpo em passos de 1:10 até diluição de 1:105 . O volume final da diluição deve ser de 100 μL.
    3. Adicione 1,8 x 10 cópiasgenômicas equivalentes ao g1-HEV purificado a cada diluição de anticorpos.
    4. Incube a mistura de anticorpos e vírus em incubadora de 5% deCO2 , 37 °C por 1 hora.
    5. Remova a placa de 12 poços contendo células Huh7 (semeadas no dia anterior) e lave as células com 500 μL DPBS.
    6. Adicione a mistura de anticorpos e vírus às células e coloque a placa em uma incubadora deCO2 a 5% a 37 °C por 1 hora.
    7. Lave as células com 500 μL de DPBS.
    8. Adicione DMEM + meio FBS a 2% às células e incube a placa em uma incubadora com 5% de CO2 a 37 °C por 72 horas.
    9. Realize o IFA conforme mencionado na seção 4 (passo 4.7 em diante).
    10. Adquira imagens fluorescentes de 5 campos aleatórios usando um objetivo 10x em 1028 x 1028 pixels.
    11. Salve as imagens no formato JPEG/TIFF. Quantifique os pontos fluorescentes usando a análise ImageJ, conforme descrito abaixo.
    12. Para analisar a imagem no ImageJ, converta a imagem RGB para uma imagem de 8 bits. Clique na imagem > digite > 8 bits.
    13. Ajuste o limite da imagem. Clique na imagem > ajuste > limiar. Selecione o nível do limiar inferior como 40 e o nível do limiar superior como 255.
    14. Para contar, selecione Analisar> Analisar Partículas. Selecione resultados de exibição, limpe resultados, resuma, exclua nas bordas e retorno de investimento compósito. Desmarque Adicionar ao gerenciador, inclua buracos e sobreponha. Aperte Ok e a contagem de pontos fluorescentes aparecerá.
  2. Estimativa do NT50
    1. Calcule a % de neutralização de cada diluição usando a seguinte fórmula:
      % Neutralização= 100-[((células ORF2-positivas em diluição)⁄(células ORF2-positivas no controle do vírus)) X 100]
    2. Calcule NT50 usando a seguinte fórmula:
      log10(NT50) = log10D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log10D2-log10D1)
      Onde, D1 = Diluição em que % de neutralização é inferior a 50
      D2 = Diluição em que % de neutralização é superior a 50
      N1= % Neutralização abaixo de 50
      N2= % Neutralização acima de 50
    3. Calcule o antilog de Log10 NT50 usando a fórmula:
      NT50= 10log10(NT50)
    4. Plote o gráfico da (média±SD) de todos os campos.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Infecção de células Huh7 com caracterização de g1-HEV e vírus

O g1-HEV foi isolado de uma amostra fecal usando uma série de etapas, como ilustrado (Figura 1A). O número de cópias genômicas do g1-HEV purificado foi estimado por RT-qPCR, seguido pelo armazenamento a -80 °C. Para confirmar infecção viral e replicação, células Huh7 foram infectadas com equivalentes de 1,8 ×10 cópias genômicas do estoque pu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRNT é um método baseado em imunocoloração para estimar o potencial neutralizante de anticorpos. Ele tem sido usado para estimar valores NT50 para anticorpos contra múltiplos vírus, incluindo vírus da Dengue (DENV), Síndrome Respiratória Aguda Grave Coronavírus-2 (SARS-CoV-2) e vírus da encefalite japonesa (JEV)23,24,25. Nesse método, o vírus é incubado com um anticorpo de teste (ou s...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Essa pesquisa foi parcialmente financiada por uma bolsa do Conselho de Assistência à Pesquisa da Indústria de Biotecnologia, Departamento de Biotecnologia do Governo da Índia, concedida a MS, S e BN. A pesquisa no laboratório de EM é apoiada por uma bolsa central do Instituto de Ciências e Tecnologia em Saúde Translacional. A SA é apoiada por uma posição de Cientista de Pesquisa de Projeto financiada pelo Conselho Indiano de Pesquisa Médica, Governo da Índia. A UB conta com o apoio de uma Bolsa de Pesquisa Sênior do Departamento de Biotecnologia do Governo da Índia.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microfuge tubesAxygenMCT-150-C
12-well cell culture dishCorning3512
37 degree incubator shakerThermo Scientific50163013
4′,6-diamidino-2-phenylindoleAbcamAB104139DAPI
50mL centrifuge tubeFalcon352070
6-well cell culture dishCorning 3516
Alexa flour 594 secondary IgG AntibodyThermo ScientificA-11012
Anti-ORF2 antibodyGenscriptNACustom synthesized by Genscript and characterized in our laboratory14
Anti-rabbit IgG antibodyGenscriptNA
Bovine Serum AlbuminHIMEDIAMB083BSA
Confocal microscopeOlympusFV3000
DMEM, high glucoseHIMEDIAAL007A
Fetal Bovine SerumGIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband and contributors, NIH, USA)
Normal Goat SerumHIMEDIARM-10701
ParaformaldehydeHIMEDIAGRN3660PFA
Phosphate Buffer Saline pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
Polyethyleneglycol 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 1-step Probe KitSOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI reagentMolecular Research CentreTR118
Triton X100SIGMAX100
Trypsin-EDTAGIBCO25300-54

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
  2. Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Front Microbiol. 7, 1419(2016).
  3. Kamar, N., et al. Hepatitis E virus and chronic hepatitis in organ-transplant recipients. N Engl J Med. 358 (8), 811-817 (2008).
  4. Purcell, R. H., Emerson, S. U. Hepatitis E: An emerging awareness of an old disease. J Hepatol. 48 (3), 494-503 (2008).
  5. Nimgaonkar, I., Ding, Q., Schwartz, R. E., Ploss, A. Hepatitis E virus: Advances and challenges. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 15 (2), 96-110 (2018).
  6. Hepatitis E. , WHO. Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-e (2025).
  7. Songtanin, B., et al. Hepatitis E virus infections: Epidemiology, genetic diversity, and clinical considerations. Viruses. 15 (6), 1389(2023).
  8. Lee, G. H., et al. Chronic infection with camelid hepatitis E virus in a liver transplant recipient who regularly consumes camel meat and milk. Gastroenterology. 150 (2), 355-357 (2016).
  9. Zhou, Z., Xie, Y., Wu, C., Nan, Y. The hepatitis E virus open reading frame 2 protein: Beyond viral capsid. Front Microbiol. 12, 739124(2021).
  10. Nair, V. P., et al. Endoplasmic reticulum stress induced synthesis of a novel viral factor mediates efficient replication of genotype-1 hepatitis E virus. PLoS Pathog. 12 (4), e1005521(2016).
  11. Meister, T. L., et al. Cell culture systems for the study of hepatitis E virus. Antiviral Res. 163, 34-49 (2019).
  12. Fu, R. M., Decker, C. C., Dao Thi, V. L. Cell culture models for hepatitis E virus. Viruses. 11 (7), 608(2019).
  13. Kaushik, N., et al. Zinc salts block hepatitis E virus replication by inhibiting the activity of viral RNA-dependent RNA polymerase. J Virol. 91 (21), 10-1128 (2017).
  14. Gupta, J., et al. Antiviral activity of zinc oxide nanoparticles and tetrapods against the Hepatitis E and Hepatitis C viruses. Front Microbiol. 13, 881595(2022).
  15. Ansari, S., et al. Network controllability analysis reveals the antiviral potential of Etravirine against hepatitis E virus infection. mSystems. 10 (9), e00438-25(2025).
  16. Gremmel, N., et al. Hepatitis E virus neutralization by porcine serum antibodies. J Clin Microbiol. 61 (11), e00373-23(2023).
  17. Cai, W., et al. A high-throughput neutralizing assay for antibodies and sera against hepatitis E virus. Sci Rep. 6 (1), 25141(2016).
  18. Liu, C., et al. An optimized high-throughput neutralization assay for hepatitis E virus (HEV) involving detection of secreted Porf2. Viruses. 11 (1), 64(2019).
  19. Meng, J., Dubreuil, P., Pillot, J. A new PCR-based seroneutralization assay in cell culture for diagnosis of hepatitis E. J Clin Microbiol. 35 (6), 1373-1377 (1997).
  20. Emerson, S. U., et al. Putative neutralization epitopes and broad cross-genotype neutralization of Hepatitis E virus confirmed by a quantitative cell-culture assay. J Gen Virol. 87 (3), 697-704 (2006).
  21. Deshmukh, T. M., et al. Immunogenicity of candidate hepatitis E virus DNA vaccine expressing complete and truncated ORF2 in mice. Vaccine. 25 (22), 4350-4360 (2007).
  22. Gupta, J., et al. Expression, purification and characterization of the hepatitis E virus like-particles in the Pichia pastoris. Front Microbiol. 11, 141(2020).
  23. Guo, J., et al. Fluorescence Reduction Neutralization Test: A novel, rapid, and efficient method for characterizing the neutralizing activity of antibodies against dengue virus. Curr Issues Mol Biol. 47 (3), 140(2025).
  24. Bewley, K. R., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by wild-type plaque reduction neutralization, microneutralization and pseudotyped virus neutralization assays. Nat Protoc. 16 (6), 3114-3140 (2021).
  25. Islam, M. D., et al. Neutralizing antibodies against the Japanese encephalitis virus are produced by a 12ákDa E coli expressed envelope protein domain III (EDIII) tagged with a solubility-controlling peptide. Vaccine. 56, 127143(2025).

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