Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento, purificação e cultivo de células marginais primárias da stria vascular do camundongo, e para estabelecer modelos in vitro de estresse oxidativo e senescência celular para estudar distúrbios da parede lateral coclear.
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Artigo de método
Isolamento e Cultura de Células Marginais Primárias da Stria Vascularis de Camundongos Neonatais
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A stria vascular é uma estrutura chave no ouvido interno responsável por gerar e manter o potencial endococlear (EP), e sua disfunção está intimamente associada a várias formas de perda auditiva. A stria vascular é composta por células marginais, células intermediárias e células basais, entre as quais as células marginais desempenham um papel central na geração e manutenção da EP. Portanto, estabelecer um modelo de cultura primária in vitro de células marginais é essencial para investigar as características biológicas da stria vascular e seu envolvimento em distúrbios relacionados à perda auditiva.
Neste estudo, isolamos e cultivamos com sucesso células marginais primárias da stria vascular de camundongos neonatais. Os tecidos estridos foram obtidos por microdissecação, digeridos com colagínase tipo II e purificados por placagem diferencial para remover a maioria dos fibroblastos, com células cultivadas atingindo mais de 80% de confluência ao séimo dia. A coloração por imunofluorescência demonstrou expressão estável da citoceratina 18 (CK18) e do membro 1 da subfamília Q dependente de voltagem do potássio (KCNQ1), confirmando o sucesso do isolamento, alta pureza e preservação da função fisiológica das células marginais.
Com base nesse modelo, foram estabelecidos modelos in vitro de estresse oxidativo e senescência celular, utilizando peróxido de hidrogênio (H2O2) e D-galactose, respectivamente. As células tratadas apresentaram níveis significativamente aumentados de espécies reativas intracelulares de oxigênio (ROS) e positividade β-galactosidase (SA-β-gal) associada à senescência, indicando alta sensibilidade das células marginais primárias ao estresse oxidativo e estímulos indutores de senescência. Coletivamente, este estudo estabelece um sistema estável e reprodutível para a cultura e modelagem de células marginais primárias de camundongos, fornecendo uma plataforma in vitro confiável para investigar disfunção da stria vascular e mecanismos relacionados.
Introdução
No sistema auditivo, vários tecidos dentro da cóclea trabalham em conjunto para converter ondas sonoras complexas em sinaiselétricos 1. A estria vascular regula a composição iônica da endolinfa e gera o Potencial Endococlear (EP), mantendo assim a homeostase coclear e garantindo a função normal das células ciliadas internas e externas. É composta por três tipos celulares distintos: células marginais, células intermediárias e células basais. As células marginais formam uma monocamada epitelial polarizada que fica diretamente voltada para a endolinfa e é selada por junções apertadas. A membrana basolateral das células marginais é enriquecida com dois transportadores de potássio-chave, Na⁺/K⁺-ATPase e NKCC1, envolvidos na regulação do transporte de íons de sódio e potássio nas strias vasculares. A função da Na⁺/K⁺-ATPase foi demonstrada estar diretamente associada à EP 2,3. Os canais K⁺ KCNQ1/KCNE1 estão localizados na membrana apical das células marginais e geram um potencial adicional de difusão K⁺ que contribui para a formação do EP4. As células marginais são enriquecidas com múltiplas proteínas relacionadas ao potássio e atuam como a unidade celular central que impulsiona a reciclagem do potássio na endolinfa coclear. Assim, as células marginais são as células-chave responsáveis por gerar e manter a EP.
A stria vascular (SV) demonstrou desempenhar um papel crítico na patogênese de múltiplos distúrbios associados à perda auditiva neurosensorial (SNHL), incluindo perda auditiva relacionada à idade (ARHL), perda auditiva induzida por ruído (NIHL), perda auditiva hereditária (HHL) e perda auditiva induzida por drogas (DIHL). Além disso, vários outros distúrbios auditivos, como doença autoimune do ouvido interno (IDA), doença autoinflamatória do ouvido interno (AID) e doença de Ménière (DM), embora etiologicamente distintos, também foram demonstrados por estudos recentes envolvendo o SV em seus mecanismos patogênicossubjacentes 5,6. Portanto, estabelecer modelos celulares confiáveis para investigar a patogênese da perda auditiva é essencial. Estudos demonstraram que a redução da densidade celular marginal serve como um forte preditor da EP ao longo da vida murinha, enquanto a atrofia da stria vascular representa uma lesão característica inicial emARHL 7,8. A cultura in vitro de células marginais pode fornecer um modelo confiável para estudar a patogênese da ARHL e explorar potenciais alvos terapêuticos. Além do ARHL, estudos recentes revelaram uma alta correlação e possível relação subjacente entre a stria vascularis e outros distúrbios auditivos, sugerindo que modelos celulares marginais in vitro podem ter aplicações maisamplas 5,9,10.
Este estudo descreve um protocolo para a dissecação e cultura da stria vascularis em cócleas neonatais de camundongo, seguido pela purificação de células marginais usando placagem diferencial, fornecendo assim um modelo celular confiável para pesquisas em patologias relacionadas à stria vascular.
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Protocolo
Os filhotes de camundongos neonatais (P0-3) foram fornecidos por Biont. Todos os procedimentos experimentais estavam em conformidade com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicadas pelos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (Publicação do NIH, revisada em 2011) e aprovadas pelo Comitê de Ética Animal do Hospital Renmin da Universidade de Wuhan (WDRM202400019).
1. Esterilização e preparação de materiais
- Prepare as ferramentas de dissecação, incluindo dois pares de pinças de microdissecação, um par de pinças padrão, uma tesoura cirúrgica e uma tesoura de microdissecação. Esterilize todas as ferramentas usando uma autoclave e seque em um forno a 60 °C por 4 horas.
- Prepare 100 mL de meio celular epitelial animal (meio EpiCM-a) conforme as instruções do fabricante. Adicione soro bovino fetal (FBS), suplemento de crescimento de células epiteliais (EpiCGS-a) e solução de penicilina/estreptomicina ao meio basal para alcançar concentrações finais de 2% FBS, 1% EpiCGS-a e 1% penicilina/estreptomicina.
- Desinfete o estágio e o alojamento do estereoscópio com 75% de etanol. Depois, coloque as ferramentas de dissecação autoclavada e o microscópio desinfetado dentro de um gabinete de segurança biológica. Expeça todos os itens à luz UV por 30 minutos para garantir total esterilidade antes de iniciar o procedimento de dissecação.
2. Dissecação e isolamento ósseo temporal para coleta auditiva de epitélio
- Eutanasie filhotes de camundongos neonatais (P0-3) após anestesia com isoflurano a 4%, desinfete com 75% de etanol e realize a decapitação no gelo. Use outros métodos eticamente aprovados, se necessário.
- Imobilize a cabeça, abra o couro cabeludo ao longo da sutura sagital usando tesoura de microdissecação, separe o couro cabeludo bilateralmente e o excise.
- Corte a cabeça do rato neonatal ao longo da linha média usando tesouras de microdissecação. Remova o tecido cerebral com pinças para expor os ossos temporais (Figura 1A).
- Observe os ossos temporais bilaterais na base craniana, remova outros ossos desnecessários e retenha o tecido ósseo temporal contendo a cóclea (Figura 1B).
- Transfira um osso temporal para um recipiente estéril de 35 mm contendo a Solução Salada Balanceada de Hank (HBSS) fresca sobre gelo.
- Transfira o outro osso temporal para o microscópio, fixe o tecido ósseo temporal com um par de pinças e use outro par para realizar uma dissecação romba do tecido muscular superficial até que o anel branco semicircular do ossículo fique visível (Figura 1C). Após confirmar a posição coclear, continue a dissecação contundente para baixo até que seja observado tecido coclear translúcido (Figura 1D).
NOTA: Os passos 2.6-2.7 devem ser realizados no gelo. - Usando uma microdissecação, remova cuidadosamente um pequeno pedaço da parede óssea na curva apical da cóclea, insira delicadamente um lado da pinça na cóclea e separe a parede óssea do labirinto membranoso. Remova a parede óssea e estenda o tecido membranoso do labirinto em uma Solução Equilibrada de Sal de Hank (HBSS) fresca (Figura 1E).
- Fixe a membrana basilar com um par de pinças e separe cuidadosamente a estria vascular com outro par de pinças. Transfira-a para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1 mL de solução de colanase tipo II de 1mg/mL colocada sobre gelo (Figura 1F).
- Repita os passos acima para coletar a stria vascular do outro lado.
3. Desagregação enzimática para obtenção de células marginais da stria vascular
- Incube o tubo microcentrífugo contendo o tecido colhido em solução de colagênase tipo II de 1mg/mL a 37 °C por 30 minutos.
NOTA: A solução de colagênase tipo II foi preparada diluindo a colagênase tipo II em soro salino tamponado com fosfato (PBS; 2,7 mM KCl, 2,0 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 10 mMNa 2HPO 4). - Centrifuge o tubo a 300 × g por 8 minutos.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante. Adicione 1 mL de meio de cultivo para terminar a digestão, triture suavemente para ressuspender as células e centrifuge novamente a 300 × g por 8 minutos.
- Aspire o sobrenadante e adicione 1 mL de meio fresco para cultura. Triture para obter uma suspensão de célula única, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mL e adicione meio adicional para ajustar o volume total para 10 mL.
- Misture a suspensão da célula cuidadosamente pipetando repetidamente, depois transfira 1 mL da suspensão para cada poço de uma placa de 6 poços. Cultive as células em 2 mL de DMEM suplementado com 2% de FBS, 1% de EpiCGS-a e 1% de solução de penicilina/estreptomicina a 37 °C em uma incubadora de 5% deCO-2 .
- Troque o meio diariamente e monitore o status da célula. O crescimento agrupado de células marginais pode tipicamente ser observado 2 dias após a placagem.
4. Purificação das células marginais
- No terceiro dia de cultivo, observe o aparecimento de numerosos fibroblastos em forma de fuso ao redor dos aglomerados de células marginais semelhantes a paralelepípedos (Figura 2B).
- Aproveitando as diferenças nas taxas de aderência, pipeteie suavemente para remover parcialmente os fibroblastos em forma de fuso. Usando uma pipeta de 1 mL, lave suavemente a solução salina balanceada do D-Hanks em grandes áreas em cada um dos quatro quadrantes. Monitore a purificação celular ao microscópio e ajuste a força e a direção da pipetagem de acordo. Geralmente, a lavagem em grandes áreas é realizada duas vezes. Após cada rodada, examine a densidade de fibroblastos microscopicamente; Com base nessas observações, aplique pipeteamento suave localizado em áreas densamente povoadas de fibroblastos para obter uma distribuição esparsa e uniforme ao longo da placa de cultivo.
NOTA: Uma densidade adequada de fibroblastos foi mantida, pois a remoção completa ou purificação excessiva pode restringir o crescimento das células primárias. Recomendamos manter uma proporção aproximada de 2:1 de células marginais em relação aos fibroblastos. - Cesse a purificação quando os fibroblastos aparecem dispersos entre aglomerados celulares marginais sob exame microscópico. Remova o sobrenadante e adicione 2 mL de meio fresco para cultivo para continuar o cultivo.
5. Coloração por imunofluorescência
- No segundo dia pós-purificação, examine a morfologia celular ao microscópio. Ao observar formação adequada de agrupamentos celulares e densidade adequada, aspire o meio de cultivo e lave as células três vezes com soro salino tamponado com fosfato (PBS, pH 7,4).
- Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 15 minutos em temperatura ambiente. Após remover a solução fixadora, lave as células três vezes com PBS (5 min por lavagem).
- Permeabilize células com 0,5% de Triton X-100 por 15 minutos. Remova a solução e lave as células três vezes com PBS (5 min por lavagem).
- Bloqueie células com PBS contendo 10% de soro de cabra por 30 minutos em temperatura ambiente.
- Incubar células com anticorpo monoclonal anti-camundongo CK18 (diluído em 1:300 em PBS contendo 3% de soro de cabra) ou anticorpo KCNQ1 (G-8) (diluído em 1:100 em PBS contendo 3% de soro de cabra) durante a noite a 4 °C.
- Lave as células três vezes com PBS (10 min por lavagem). Incube com o anticorpo secundário correspondente (diluído em 1:300 em PBS contendo 3% de soro de cabra) por 1 hora em temperatura ambiente.
- Remova o anticorpo secundário e lave as células três vezes com PBS (10 min por lavagem).
- Aplique 1-2 gotas de meio de montagem antifade contendo DAPI em lâminas, monte os lâminas de cobertura e examine amostras usando um sistema de varredura a laser confocal.
NOTA: Exceto pelas etapas de lavagem, todas as soluções de incubação, incluindo anticorpos, foram adicionadas em volumes suficientes para cobrir completamente as células.
6. Tratamento H2O 2 e coloração ROS
- Após 7 dias de cultura, quando as células marginais formam uma monocamada confluente, induz-se estresse oxidativo por meio do tratamento com 1 mMH 2O2. Prepare a solução de trabalho de 1 mM diluindo a solução de estoque 30% deH2O2 1:10000 em meio celular epitelial. Incube os grupos experimentais com essa solução funcional, enquanto trata os grupos controle apenas com meio celular epitelial.
- Após 16 horas de tratamento, remova cuidadosamente o meio e lave as células com PBS. Avalie os níveis intracelulares de ROS em células marginais usando um Kit de Ensaio de Espécies Reativas de Oxigênio conforme o protocolo do fabricante.
- Remova o meio de cultura, depois adicione MitoTracker Red CMXRos diluído (um corante seletivo para mitocôndrias) e DCFH-DA às células, e incube a 37 °C em uma incubadora de cultura celular por 30 minutos.
- Lave as células três vezes com PBS (5 min cada), monte as coberturas e observe as amostras usando um microscópio confocal a laser.
7. Tratamento com D-galactose e coloração SA-β-gal
- Após 7 dias de cultura, quando as células marginais formam uma monocamada confluente, o pó de D-galactose foi dissolvido em meio EpiCM-a para preparar uma solução de trabalho de 40 mg/mL de D-gal. Incubar grupos experimentais com essa solução (2 mL por poço de uma placa de 6 poços, 48 h, a 37 °C) para induzir a senescência celular, enquanto se trata grupos controle com o mesmo volume de meio Epi.
- Após 48 horas de tratamento, remova cuidadosamente o meio e lave as células com PBS. Avalie a senescência celular em células marginais usando o kit de coloração SA-β-gal conforme as instruções do fabricante.
- Conserte as células com solução fixadora por 15 minutos em temperatura ambiente. Após remover o fixador, lave as células três vezes com PBS (5 min por lavagem).
- Incubar células com solução de trabalho de coloração SA-β-gal contendo 5% de X-Gal (1 mL por poço de uma placa de 6 poços) durante a noite a 37 °C em uma incubadora umidificada sem CO2.
- Capture imagens de coloração de SA-β-gal sob iluminação em campo claro usando um microscópio.
8. Análise estatística
- Para comparações entre grupos tratados com H₂O₂ e grupos controle quanto à intensidade média de imunofluorescência da coloração ROS, e entre grupos tratados com D-galactose e controle quanto à proporção de células SA-β-gal-positivas, aplice-se testes t após avaliações de normalidade e logaritaritim.
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Resultados
Características de crescimento e morfológicas das células cultivadas
Usando esse protocolo, estabelecemos com sucesso culturas primárias de células marginais isoladas da cóclea murina. No segundo dia de cultura, a microscopia óptica revelou que as células haviam aderido ao substrato e começado a formar colônias agrupadas (Figura 2Aa). No terceiro dia, purificamos as células (Figura 2B). Observações subsequent...
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Discussão
Por décadas, as pesquisas sobre perda auditiva têm se concentrado principalmente no papel das células ciliadas sensoriais e suas conexões sinápticas com os neurônios ganglionaresespirais 11. Numerosos estudos publicados foram dedicados ao estabelecimento e otimização de modelos in vitro de cultivo de células ciliadas, que desempenharam um papel indispensável na investigação de danos celulares, regeneração e efeitos de fármacosototóxicos<...
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Divulgações
Os autores declaram que a pesquisa não apresenta conflitos comerciais ou financeiros de interesse.
Agradecimentos
Expressamos nossa gratidão ao Departamento de Otorrinolaringologia-Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital Renmin da Universidade de Wuhan (Wuhan, China) e ao Instituto de Pesquisa em Otorrinolaringologia-Cirurgia da Cabeça e Pescoço, Hospital Renmin da Universidade de Wuhan (Wuhan, China) pelo generoso apoio e incentivo. Esse trabalho foi apoiado pela Fundação de Construção e Incubação de Centros de Saúde Nacional da China (ZX0000000037), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81700916, 82301294), Fundação de Ciências Naturais da Província de Hubei (2017CFB242) e o Projeto de Pesquisa Científica da Comissão de Saúde da Província de Hubei (WJ2017Q005).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Servicebio | EP-1501-J | Uso para cultura |
| Prato de Cultura Celular de 35 mm | NEST | 706001 | Uso para dissecação |
| 4% de paraformaldeído | Servicebio | G1101 | Coloração imunofluorescente |
| Placa de 6 poços | Servicebio | CCP-6H | Uso para cultura |
| Anticorpo Anti-Coelho conjugado Alexa Fluor 488 | Proteintech | SA00013-2 | Coloração imunofluorescente |
| Meio de Montagem Antifade com DAPI | Absin | abs9235 | Coloração imunofluorescente |
| Kit de Contagem de Células-8 | Beyotime | C0037 | Uso para contagem de células |
| Colagenose Tipo II | Biosharp | BS164 | Uso para cultura |
| Sistema de Varredura a Laser Confocal | Olympus | FV1200 | Coloração imunofluorescente |
| DCFH-DA | Invitrogen | C2938 | Coloração ROS |
| D-gal | Solarbio | D8310 | Uso para modelagem de células |
| EpiCM-a Medium | Sciencell | 4131 | Uso para cultura |
| Pinças finas | RWD | F11020-11 | Uso para dissecação |
| Soro de Cabra | Beyotime | C0265 | Coloração imunofluorescente |
| H2O2 | Mkbio | MM0707 | Uso para modelagem de células |
| Solução Equilibrada de Sal de Hank (HBSS) | Biosharp | BL561A | Uso para cultura |
| Isoflurano | RWD | R510-22-10 | Uso para dissecação |
| Anticorpo KCNQ1 (G-8) | Santa Cruz | SC-365186 | Coloração imunofluorescente |
| Microscópio | Olympus | SZX7-1063 | Uso para dissecação |
| Microscópio | Olympus | IX71 | Usado para observar os resultados da coloração por imunofluorescência |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen | M7512 | Coloração ROS |
| Filhotes de Camundongos Neonatais (P0-P3) | fornecido pelo BIONT | ||
| PBS | Servicebio | G4202 | Coloração imunofluorescente |
| Anticorpo monoclonal Rabbit Anti-Mouse CK18 | Proteintech | 10830-1-AP | Coloração imunofluorescente |
| Kit de Coloração Senescência β-Galactosidase | Beyotime | C0602 | Coloração de envelhecimento |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Coloração imunofluorescente |
Referências
- Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
- Bovee, S., et al. The stria vascularis: Renewed attention on a key player in age-related hearing loss. Int J Mol Sci. 25 (10), 5391(2024).
- Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Lateral wall Na,K-ATPase and endocochlear potentials decline with age in quiet-reared gerbils. Hear Res. 61 (1-2), 35-46 (1992).
- Hibino, H., et al. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Arch. 459 (4), 521-533 (2010).
- Johns, J. D., et al. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hear Res. 428, 108682(2023).
- Yu, W., et al. Role of the stria vascularis in the pathogenesis of sensorineural hearing loss: A narrative review. Front Neurosci. 15, 774585(2021).
- Ohlemiller, K. K., et al. Cellular correlates of age-related endocochlear potential reduction in a mouse model. Hear Res. 220 (1-2), 10-26 (2006).
- Mahendrasingam, S., et al. Relative time course of degeneration of different cochlear structures in the CD/1 mouse model of accelerated aging. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (4), 437-453 (2011).
- Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
- Ohlemiller, K. K., et al. The endocochlear potential as an indicator of reticular lamina integrity after noise exposure in mice. Hear Res. 361, 138-151 (2018).
- Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hear Res. 349, 138-147 (2017).
- Levano, S., et al. Whole neonatal cochlear explants as an in vitro model. J Vis Exp. (197), e65160(2023).
- Wu, K. Y., et al. Isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice. J Vis Exp. (199), e65687(2023).
- Schmiedt, R. A., et al. Effects of furosemide applied chronically to the round window: A model of metabolic presbyacusis. J Neurosci. 22 (21), 9643-9650 (2002).
- Kurata, N., et al. Histopathologic evaluation of vascular findings in the cochlea in patients with presbycusis. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (2), 173-178 (2016).
- Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Med. 2, 30(2004).
- Ding, L., Wang, J. miR-106a facilitates the sensorineural hearing loss induced by oxidative stress by targeting connexin-43. Bioengineered. 13 (6), 14080-14093 (2022).
- Wan, H., et al. PARP1 inhibition prevents oxidative stress in age-related hearing loss via PAR-Ca(2+)-AIF axis in cochlear strial marginal cells. Free Radic Biol Med. 220, 222-235 (2024).
- Zhang, Y., et al. Decreased poly(ADP-ribose) polymerase 1 expression attenuates glucose oxidase-induced damage in rat cochlear marginal strial cells. Mol Neurobiol. 53 (9), 5971-5984 (2016).
- Fetoni, A. R., et al. Pathogenesis of presbycusis in animal models: A review. Exp Gerontol. 46 (6), 413-425 (2011).
- Marie, A., et al. Senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) as a model of age-related hearing loss. Neurosci Lett. 656, 138-143 (2017).
- Li, W., et al. Rodent models in sensorineural hearing loss research: A comprehensive review. Life Sci. 358, 123156(2024).
- Bommakanti, K., et al. Cochlear histopathology in human genetic hearing loss: State of the science and future prospects. Hear Res. 382, 107785(2019).
- Nicolson, T. Navigating hereditary hearing loss: Pathology of the inner ear. Front Cell Neurosci. 15, 660812(2021).
- Liu, W., et al. Applications and challenges of CRISPR-Cas gene-editing to disease treatment in clinics. Precis Clin Med. 4 (3), 179-191 (2021).
- Guo, D., et al. Establishment methods and research progress of livestock and poultry immortalized cell lines: A review. Front Vet Sci. 9, 956357(2022).
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Reimpressões e permissões
