Patches dissolventes de microneedle array fabricados por técnica de fundição com solvente e caracterização essencial de dispositivos biomédicos baseados em microagulhas

Summary

O presente trabalho tem como objetivo servir como um guia prático que permita aos pesquisadores preparar seus próprios dispositivos DMAP usando o método de fundição por solvente, também conhecido como micromoldagem, e realizar caracterizações básicas.

Abstract

A tecnologia baseada em microagulhas revolucionou o campo da pesquisa em entrega de pele e transdérmica e é considerada hoje como a abordagem mais direta para administrar medicamentos através da pele. O sucesso dos Patches Microneedle Array (MAPs) se deve principalmente à sua capacidade de anular a função da barreira cutânea que impede a entrada de medicamentos aplicados topicamente ao perfurar indolor a camada do estrato córneo . Os MAPs dissolvíveis (DMAPs) se destacam entre outros tipos de dispositivos baseados em MAPs devido à biocompatibilidade de seus materiais constituintes, à possibilidade de autoadministração pelos pacientes e à ausência de resíduos cortantes gerados após o uso. Os DMAPs geralmente são feitos de materiais poliméricos que se redispersam ao serem inseridos na pele quando em contato com fluidos intersticiais, liberando sua carga. No nível de bancada, os DMAPs são comumente fabricados usando o método de fundição por solvente, que envolve o uso de moldes mestres negativos do formato e comprimento desejados dos MAPs, sobre os quais dispersões poliméricas carregadas em fármacos são fundidas. Posteriormente, eles são forçados a preencher as cavidades do molde pela aplicação de uma força centrífuga ou pressão positiva. Após a secagem, os DMAPs ficam sólidos e são descolados dos moldes mestres, passando rotineiramente por vários estudos de caracterização antes do uso. Esses ensaios normalmente compreendem o estudo das propriedades mecânicas dos DMAPs, determinação do teor residual de água, capacidade ex vivo de penetrar na estrutura da pele, desempenho de liberação de fármacos e avaliação in vitro da biocompatibilidade.

Introduction

Embora a administração tópica e transdérmica de substâncias farmacologicamente ativas através e dentro da pele seja considerada uma alternativa promissora à administração oral de medicamentos, ela apresenta desafios significativos devido à função natural da barreira cutânea exercida pela camada do estrato córneo . Essa limitação afeta especialmente moléculas grandes, especialmente aquelas com peso molecular >500 Da¹. Além disso, a difusão passiva através da pele de outras moléculas com propriedades fisicoquímicas específicas, como hidrofilicidade ou lipofilicidade notáveis, também é restringida. Diferentes estratégias tecnológicas foram propostas para superar essa barreira, incluindo iontoforese, sonoforese, eletroporação, uso de potenciadores químicos, métodos térmicos e sistemas nanodimensionados. No entanto, os Patches de Microneedle Array (MAPs) se destacam entre eles por várias vantagens: extrema eficiência em anular a função do estrato corneu , custo-benefício, experiência indolor para os pacientes e possibilidade de autoadministração sem a necessidade de pessoal^{médico 2}.

MAPs são dispositivos que contêm projeções em forma de agulha em tamanho micro que perfuram a camada do estrato córneo e contornam a barreira epidérmica. Vários tipos de MAPs são descritos na literatura, a saber: MAPs sólidos, revestidos, dissolvíveis, inchados e ocos. Os MAPs dissolvíveis (DMAPs) são compostos por materiais poliméricos solúveis em água e empregam uma estratégia de "cutucar e liberar", o que explica suas características mais interessantes. Particularmente, eles se dissolvem ao serem inseridos na estrutura da pele em contato com fluidos intersticiais, liberando seu conteúdo. Em comparação com a estratégia de "cutucar e remendar" realizada pelos MAPs sólidos, onde são usados para criar microcanais dentro da estrutura da pele que permitem a passagem de uma^{formulação 3,4} posteriormente aplicada ^topicamente, a abordagem "cutucar e liberar" não é sujeita ao tempo em que os microcanais permanecem abertos. A estratégia de "poke and flow" requer a preparação de MAPs ocos, cuja arquitetura é consideravelmente mais complexa e difícil de fabricar. Uma vantagem adicional dos DMAPs é que eles não geram resíduos cortantes após a aplicação, reduzindo assim o risco de lesões por agulhas e contaminação biológica. Além disso, sua aplicação simples e minimamente invasiva possibilita a autoadministração pelos pacientes, apoiando seu uso em ambientes com recursos limitados ou geograficamente remotos, onde o acesso a profissionais de saúde treinados, infraestrutura médica e sistemas seguros de descarte de objetos cortantes é^{limitado 2}. A comunidade científica focada na administração dérmica e transdérmica de fármacos tem recorrido cada vez mais à tecnologia MAPs, especialmente DMAPs, para superar as limitações das estratégias mencionadas. Embora a primeira publicação sobre MAPs remonte aos anos 1980, a tecnologia experimentou um grande aumento no início dos anos 2000. Desde então, o número de publicações cresceu exponencialmente, chegando a aproximadamente 500 artigos por ano^{atualmente 5}.

DMAPs são comumente fabricados pelo método de fundição por solvente ou^{micromoldagem 6}. Essa técnica de fabricação é baseada no uso de moldes mestres negativos com o formato e comprimento desejados dos MAPs. Após a fundição de dispersões poliméricas carregadas com medicamentos ou até sistemas nanodimensionados, uma força externa é aplicada para preencher as cavidades em forma de microagulha do molde mestre. Uma vez secos, os DMAPs podem ser cuidadosamente desmoldados removendo-os ou dissolvendo o molde mestre com um agente químico. Esses moldes mestres são feitos de diferentes materiais, sendo o polidimetilsiloxano (PDMS) o mais comum, graças à sua flexibilidade e baixa adesividade, o que facilita a desmoldagem dos DMAPs. A preparação dos moldes mestres é tipicamente realizada usando métodos litográficos; no entanto, moldes comerciais de PDMS de vários formatos, comprimentos e densidades de microagulhas agora estão disponíveis.

Aqui, é fornecida uma diretriz para a preparação de DMAPs utilizando a técnica de fundição com solvente. Nesse caso, o processo é realizado usando força centrífuga ou aplicação de pressão positiva. Isso permite uma alternativa de protocolo de custo eficiente aos métodos de fabricação de alto custo de dispositivos biomédicos baseados em MAPs, possibilitando que um grupo mais amplo de pesquisadores incorpore os MAPs em seus trabalhos de pesquisa relacionados à pele. Além disso, a caracterização essencial para fins acadêmicos e de pesquisa básica que precede os testes in vivo inclui comprimento e geometria da agulha, resistência mecânica à compressão, desempenho na inserção ex vivo , carregamento e liberação do medicamento, teor residual de água, estabilidade, absorção ex vivo de fármacos e perfil de segurança in vitro .

Protocol

Os reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Fabricação de matrizes de microagulhas dissolventes por centrifugação

1. Prepare a dispersão coloidal aquosa dos materiais constituintes dos DMAPs, dissolvendo-os na quantidade apropriada de água e mexendo vigorosamente. Dependendo dos polímeros selecionados e da concentração, o tempo de dispersão pode variar. Se necessário, aqueça a água moderadamente (40-45 °C) para facilitar a dispersão do polímero.
   NOTA: Os polímeros mais comuns usados para preparar DMAPs são poli(vinil pirrolidona) (PVP), goma karaya, ácido hialurônico (HA), poli(éter vinílico de metil-ácido alt-maleico) (PMVE-MA), poli(álcool vinílico) (PVA), carboximetil celulose (CMC), quitosana, etc., porém, qualquer outro material solúvel em água com propriedades ótimas pode ser utilizado. Para a maioria das formulações, a concentração típica de trabalho varia de 5% a 30% em peso por semana. Concentrações mais baixas geralmente produzem DMAPs de dissolução rápida, enquanto concentrações mais altas geram dispositivos de dissolução lenta. No entanto, a concentração ideal deve ser determinada empiricamente preparando diferentes protótipos de DMAP, pois depende do peso molecular do polímero, da viscosidade e das propriedades mecânicas desejadas das microagulhas.
2. Deixe os polímeros se agitarem minimamente durante a noite para alcançar a dispersão completa, enquanto permite a remoção das bolhas de ar.
3. Centrifuge a dispersão polimérica se as bolhas de ar persistirem (1000 x g; 5 min; 25 °C).
4. Adicione a carga (medicamento ou partícula nanodimensionada) na concentração desejada e mexa moderadamente até que fique homogênea, sem incorporar novas bolhas de ar.
5. Descarte os moldes PDMS em placas de 12 poços. Para isso, instale os moldes nos poços com argila para modelar, cimento dental ou qualquer material similar.
6. Fundir 50 μL da mistura polimérica carregada de fármacos nos moldes PDMS e na centrífuga (3000 x g; 5 min; 25 °C). Depois, gire as placas 180° e repita o processo de centrifugação para garantir o preenchimento de todas as cavidades em forma de agulha.
7. Remova cuidadosamente o excesso de dispersão polimérica carregada de fármacos. Use uma pipeta para transferir a dispersão polimérica se for líquida; Use uma espátula se for muito viscoso.
8. Repita o processo de centrifugação dupla (passo 1.6) para colocar de volta no molde qualquer dispersão polimérica carregada de fármacos que possa ter transbordado durante a etapa anterior.
9. Seque a dispersão polimérica carregada de fármacos nos moldes sob vácuo (600 mBar; 30 min; 25 °C).
10. Repita o protocolo pelo menos duas vezes entre as etapas 1.6 e 1.9 para garantir o preenchimento correto dos moldes mestres com a dispersão polimérica carregada pelo medicamento.
    NOTA: A força centrífuga pode ser progressivamente reduzida por meio de 500 x g (25 °C) a cada repetição.
11. Prepare uma dispersão polimérica altamente concentrada, livre de medicamentos, para formar a base do dispositivo DMAPs. Isso garantirá que o medicamento presente na dispersão preenchida nas cavidades do mofo não retorne para a placa base.
12. Fundir 50 μL da dispersão polimérica livre sobre os moldes de PDMS e espalhar centrifugando duas vezes, incluindo placas de ponto médio, em uma rotação de 180° (500 x g; 5 min; 25 °C; 2x). Após a centrifugação, adicione 100 μL da dispersão a cada molde, seguido pela adição de mais 50 μL à placa base após 12 horas.
13. Deixe os DMAPs nos moldes de PDMS para secar por 3 a 5 dias em temperatura ambiente em um dessecador de vedação a seco.
14. Desfaça cuidadosamente os DMAPs do PDMS com pinças ou retire-os usando fita adesiva de celulose (Figura 1).
15. Caracterize os DMAPs fabricados (veja o passo 3).

2. Fabricação de matrizes de microagulhas dissolventes aplicando pressão positiva

1. Prossiga de forma semelhante à descrito na seção anterior até a etapa 1.5.
2. Funda 150 μL da mistura polimérica carregada com fármacos nos moldes PDMS e coloque-os em um tanque de pressão.
3. Encha o tanque de pressão com ar até atingir uma pressão de 3-4 bar por pelo menos 15 minutos.
4. Remova cuidadosamente o excesso de dispersão polimérica carregada de fármacos. Para isso, se a dispersão polimérica for líquida, use uma pipeta, enquanto se for consideravelmente viscosa, remova-a com uma espátula.
5. Repita a aplicação de pressão (passos 2.2-2.3) para colocar de volta no molde qualquer dispersão polimérica carregada de fármacos que possa ter transbordado durante a etapa anterior.
6. Seque a dispersão polimérica carregada de fármacos nos moldes sob vácuo (600 mbar; 30 min; 25 °C).
7. Prepare uma dispersão polimérica altamente concentrada, livre de medicamentos, para formar a base do dispositivo DMAPs. Isso garantirá que o medicamento presente na dispersão preenchida nas cavidades do mofo não retorne para a placa base.
8. Fundida 0,2 g da dispersão polimérica livre sobre os moldes de PDMS e aplique uma pressão positiva, conforme descrito no passo 2.3.
9. Prossiga de forma semelhante à descrito na seção anterior, a partir do passo 1.13.

3. Caracterização dos DMAPs

NOTA: Nesta etapa, foram realizados métodos envolvendo o uso de tecidos de pele humana e/ou animal de acordo com as diretrizes institucionais. Além disso, os métodos envolvendo o uso de amostras de pele animal foram realizados de acordo com o princípio dos 3Rs para experimentação animal.

1. Visualize os DMAPs usando uma microcâmera com a ampliação apropriada para distinguir as projeções em forma de^{agulha 7}.
   NOTA: Se eles foram carregados com um medicamento ou corante colorido, uma cor diferente deve ser observada entre as pontas e a placa base.
2. Conecte os DMAPs a um dispositivo de suporte e visualize a morfologia e o comprimento das projeções semelhantes a microagulhas por microscopia óptica. Uma estrutura de ponta afiada deve ser observada. Registre o comprimento das projeções semelhantes a microagulhas com o software apropriado para seu microscópio óptico.
   NOTA: Para medir o comprimento da microagulha por microscopia óptica, os MAPs devem ser exibidos perpendicularmente aos objetivos. As medições de comprimento e o formato das projeções semelhantes a microagulhas devem ser confirmadas por Microscopia Eletrônica de Varredura.
3. Avalie as propriedades mecânicas dos DMAPs em direção à deformação das microagulhas após compressão em uma superfície sólida. Para isso, coloque o dispositivo DMAPs em um aplicador DMAP comercialmente disponível e comprima-o contra uma superfície plana de aço inoxidável por 30 s. Após a compressão, registre o comprimento das projeções semelhantes a microagulhas e calcule a porcentagem de deformação comparando-a com o comprimento inicial de acordo com a seguinte^{equação 7}:
   
   Onde, h_o e h_f representam respectivamente o comprimento das microagulhas antes e depois da compressão.
   NOTA: Se disponível, o uso de um analisador de texturas padroniza a força de compressão. Nesse caso, uma força de 32 N/array imita a força média do polegar que os pacientes aplicam ao autoadministrar dispositivos DMAPs.
4. Determinar a capacidade preliminar de inserção dos DMAPs por um método substituto de pele artificial baseado em folhas termoplásticas feitas de material do tipo^{olefina 8}. Para isso, comprima o dispositivo DMAPs contra oito folhas vinculadas seguindo as condições descritas no passo 3.4. O número de furos criados em cada camada é observado por microscopia óptica ou usando uma câmera de microscópio, e a porcentagem de penetração em diferentes profundidades é calculada.
   NOTA: Folhas termoplásticas comercialmente disponíveis geralmente apresentam espessura de 127 μm.
5. Determine a capacidade de inserção ex vivo dos DMAPs usando explantes de pele humana, suína ou roedora previamente excisados e cuidadosamente podados. Limpe o explante da pele com água abundante, deixando de molho por 1-2 minutos em água e depois coloque sobre um material de espuma envolto em papel alumínio, com o lado do stratum corneum voltado para cima.
   1. Prossiga com a inserção sob as condições descritas no passo 3.4. Deixe os DMAPs inseridos na pele até a dissolução das pontas das microagulhas. Se os DMAPs forem carregados com um corante ou medicamento colorido, a coloração dos lados interno e externo da pele revela uma inserção bem-sucedida dos^{DMAPs 9}. Além disso, microcanais podem ser observados por análise histológica das seções da^{pele 7}.
      NOTA: Esta etapa, envolvendo pele humana ou animal ex vivo , foi realizada de acordo com as diretrizes e aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Humana e Animal da Universidade de Valencia. O consentimento informado foi obtido quando aplicável, e todos os experimentos seguiram padrões éticos institucionais e europeus para o uso de tecidos humanos e animais em pesquisas biomédicas.
6. Determinar o teor residual de água por análise termogravimétrica. A perda de peso observada até 100-110 °C é atribuída ao¹⁰ residual de água.
   NOTA: Dependendo da fonte da literatura, o teor máximo residual permitido de água é de 5% a 10% do peso total para garantir a secagem ideal dos DMAPs.
7. Quantifique a carga imergindo os DMAPs em 5-10 mL de água (ou, alternativamente, em um meio aquoso de liberação apropriado para o medicamento analisado) a 32-37 °C e quantificando a quantidade de carga usando um método analítico ideal.
   NOTA: A espectrofotometria UV-Vis é comumente usada para análise de pequenas moléculas. Para compostos com baixos limites de detecção e quantificação, a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) acoplada a detecção UV-Vis, fluorescência ou eletroquímica é altamente recomendada. HPLC acoplado a espectrometria de massa pode ser empregado quando são necessárias sensibilidade e especificidade excepcionais. A determinação analítica das cargas de proteínas e anticorpos é tipicamente realizada usando ensaios de ácido bicinconínico (BCA) e imunoensaios, como o ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) ou Western bloting, respectivamente. Perfis de liberação de medicamentos são obtidos por amostragem (0,2-1 mL) em pontos de tempo predeterminados a partir do meio^{aquoso de liberação 11}. Após cada ponto de amostragem, o volume subtraído é substituído pelo mesmo volume de meio de liberação temperada para evitar erros relacionados à autoconcentração de amostras.
8. Avalie a estabilidade dos DMAPs repetindo os ensaios de caracterização mencionados acima para garantir que as características dos DMAPs permaneçam constantes durante o período de armazenamento sob as condições de armazenamento projetadas.
   NOTA: Se a carga for termoestável, os DMAPs normalmente são armazenados à temperatura ambiente (25 °C). Para ingredientes ativos termossensíveis, os DMAPs são armazenados a 4 °C. A umidade relativa deve ser mantida abaixo de 30%. A estabilidade dos DMAPs é rotineiramente monitorada ao longo de um período de seis meses.
9. Determine a deposição e absorção da pele ex vivo por meio da pele usando um sistema de células de difusão de Franz (FDC). Para isso, prepare a pele conforme descrito e insira os DMAPs na estrutura da pele por 30 s, conforme descrito no passo 3.6.
   1. Depois, cole a câmara doadora de FDC na pele com a quantidade adequada de cianoacrilato. Quando seco, fixe o complexo da câmara doadora de pele à câmara receptora usando grampos^{apropriados 12}. Por fim, prossiga com o protocolo de amostragem conforme descrito na subseção 3.5.
      NOTA: Esta etapa envolvendo pele humana ou animal ex vivo foi realizada de acordo com as diretrizes e aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Humana e Animal da Universidade de Valencia. O consentimento informado foi obtido quando aplicável, e todos os experimentos seguiram padrões éticos institucionais e europeus para o uso de tecidos humanos e animais em pesquisas biomédicas. Se os DMAPs se dissolverem lentamente, fixe-os à pele usando faixas adesivas cirúrgicas para evitar a auto-expulsão da estrutura da pele.
10. Avalie a biocompatibilidade in vitro usando ensaios de atividade metabólica, como ensaios à base de Tetrazólio e Resazurina, ou testes de proliferação, incluindo ensaios 5-Bromo-2'-desoxiuridina bromodeoxiuridina (BrdU), conforme as instruções do fabricante.
    NOTA: As linhagens celulares preferidas são queratinócitos, fibroblastos ou melanócitos. Células não expostas a DMAPs são tipicamente usadas como controles negativos, enquanto células tratadas com dodecil sulfato de sódio (SDS) a 1% servem como controles positivos. A avaliação da biocompatibilidade depende do perfil de dissolução dos DMAPs. Para DMAPs de dissolução rápida (dissolvendo dentro de 24 horas), é utilizado o método baseado em extrato, onde o dispositivo é dissolvido antes da exposição celular. Para DMAPs de dissolução lenta, aplica-se o método de contato direto, com o dispositivo adicionado diretamente aos poços semeados. De acordo com as normas internacionais ISO 10993, os resultados de viabilidade celular >70% são considerados não tóxicos.

Results

DMAPs fabricados devem denotar uma aparência homogênea com formação bem-sucedida de projeções semelhantes a microagulhas, como mostrado na Figura 2A. Quando uma carga colorida é carregada apenas na estrutura da microagulha, uma pequena quantidade de droga pode contaminar a base dos DMAPs devido ao transbordamento das pontas ou à limpeza incompleta antes da fundição da dispersão polimérica livre. No entanto, observa-se uma diferença clara entre as duas estrut...

Discussion

O protocolo descrito aqui permite a preparação de DMAPs. No entanto, a versatilidade e a ampla variedade de materiais poliméricos que podem ser usados na fabricação de DMAPs permitem a produção de dispositivos de dissolução com diferentes características. Os resultados apresentados correspondem a DMAPs de dissolução rápida, pois foram produzidos com PVP, um polímero altamente dispersível em água em baixa concentração. O tempo de dissolução dos DMAPs pode ser facilmente ajustado simplesme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de 12 poços de cultura celular	N/A	N/A	Sem especificações. Qualquer placa comercial de cultura celular de 12 poços é adequada
Centrífuga	Eppendorf	Centrífuga 5810 G	Substituível por qualquer outra centrífuga adaptável a placas de cultura celular
Azul de metileno	Sigma Aldrich	66720	CAS 122965-43-9. Substituível por qualquer outra corante ou marca
Argila para modelar	N/A	N/A	Sem especificações. Qualquer argila comercial para modelar é adequada
Folhas termoplásticas do tipo olefina	Amcor	PM996	Parafilm M
Poliuretano (álcool vinílico) (PVA) MW: 9-10 kDa	Sigma Aldrich	363146	CAS 9002-89-5. Substituível por qualquer outra marca
Poliuretano (vinil pirrolidona) (PVP) MW: 40 kDa	Sigma Aldrich	PVP40	CAS 9003-39-8. Substituível por qualquer outra marca
Moldes de polidimetilsiloxano (PDMS)	Tecnologias Micropoint	ST-06	Distribuição de agulhas de matriz 15 x 15; Altura: 600 e micro; m; Base 200 & micro; m; Passo da agulha 500 µm. Substituível por qualquer outro molde PDMS com outro formato e comprimento de cavidade
Tanque de pressão	Protrima	AT-10HT	Substituível por qualquer outro tanque de pressão que suporte 4 bar de pressão