Artigo de método

Avaliação do Efeito da Timoquinona na Sinalização Keap-1/Nrf-2, Estresse Oxidativo e Comportamento em Ratos

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DOI:

10.3791/69924

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13 de março de 2026

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo demonstra como avaliar os efeitos da timoquinona na via Keap-1/Nrf-2, biomarcadores de estresse oxidativo e desfechos comportamentais em um modelo de rato com exposição subcrônica à deltametrina.

Resumo

Desenvolvimentos recentes em pesquisas sobre exposição a pesticidas aumentaram o interesse em estratégias protetoras baseadas em antioxidantes. A timoquinona (TQ), um composto bioativo derivado de plantas, tem sido relatado como tendo efeitos protetores contra diversos agentes tóxicos. Este estudo descreve um protocolo para avaliar os efeitos da TQ sobre parâmetros de estresse oxidativo, a via de sinalização Keap-1/Nrf-2 e os desfechos comportamentais em ratos expostos a baixa dose de Deltametrina (DTM). Aqui, 24 ratos Wistar Albino machos adultos (250 ± 20 g) foram aleatoriamente distribuídos em quatro grupos (n = 6/grupo): controle, TQ, DTM e DTM+TQ. DTM (1,28 mg/kg) e TQ (10 mg/kg) foram administrados intragicastricamente por 30 dias. O peso corporal foi monitorado durante todo o estudo. Atividade locomotora e comportamento semelhante à ansiedade foram avaliados usando o teste de campo aberto no dia 31, e comportamento semelhante à depressão foi avaliado usando o teste de natação forçada no dia 32. Ao final do período experimental, o plasma e os tecidos cerebrais foram coletados para análises bioquímicas, histopatológicas e moleculares. Marcadores de estresse oxidativo, incluindo malondialdeído, óxido nítrico total, glutationa e níveis do grupo sulfhidrilo, foram medidos em amostras de plasma e córtex cerebral. Os níveis de expressão da proteína ECH-associada ao kelch (Keap-1) e do fator eritróide 2 (Nrf-2) relacionados ao fator nuclear 2 (Nrf-2) foram analisados usando Western blotting e imunohistoquímica. Esse protocolo oferece uma abordagem abrangente e reprodutível para investigar a neurotoxicidade induzida por pesticidas e os efeitos moduladores de compostos antioxidantes.

Introdução

Inseticidas são amplamente usados na agricultura e em ambientes domésticos para controlar pragas; No entanto, a exposição crônica a doses baixas pode resultar em contaminação ambiental e efeitos adversos à saúde tanto em humanos quanto em animais. Essa exposição, especialmente por meio de alimentos e água contaminados, tem sido associada a um risco aumentado de distúrbios neurológicos e outras toxicidadessistêmicas 1.

Os piretroides substituíram em grande parte os inseticidas organofosforados devido a regulamentações mais rigorosas sobre estes últimos e sua toxicidade relativamente menor para mamíferos. O DTM, um piretroide tipo II contendo um grupo α-ciano, está entre os inseticidas mais comumente usados no mundo e é considerado altamente eficaz contrainsetos 2. Apesar disso, estudos experimentais demonstraram que a exposição ao DTM induz estresse oxidativo e neurotoxicidade em modelosanimais 3,4.

O DTM é um composto altamente lipofílico que atravessa facilmente a barreira hematoencefálica e prejudica a função neuronal ao prolongar a abertura dos canais de sódio dependentes de voltagem. Esse efeito leva a disparos neuronais repetitivos, aumento do influxo intracelular de sódio e geração aumentada de espécies reativas de oxigênio, resultando, em última análise, em danos oxidativos, inflamação e alterações comportamentais, especialmente em regiões cerebrais vulneráveis como o hipocampo e o córtexcerebral 1. Dada a crescente preocupação com a neurotoxicidade induzida por pesticidas, tem sido direcionada uma atenção crescente para estratégias protetoras baseadas em antioxidantes derivadas de fontes naturais. TQ, um dos principais componentes bioativos do óleo essencial Nigella sativa, foi relatado como possuindo potentes propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias eneuroprotetoras 5. Diversos estudos demonstraram seus efeitos benéficos contra o estresse oxidativo induzido quimicamente e processosneurodegenerativos 5,6,7,8,9.

Um dos principais mecanismos subjacentes aos efeitos protetores da TQ envolve a modulação da via de sinalização Keap-1/Nrf-2. Essa via desempenha um papel central na manutenção da homeostase redox celular ao regular a expressão de enzimas antioxidantes e desintoxicantes. Sob condições de estresse oxidativo, a repressão mediada por Keap-1 do Nrf-2 é aliviada, permitindo que o Nrf-2 se transloque para o núcleo e ative a expressão gênica dependente do elemento de respostaantioxidante 9.

Como a exposição ao DTM induz alterações em níveis molecular, bioquímico, histológico e comportamental, uma única abordagem analítica é insuficiente para capturar toda a extensão de seus efeitos neurotóxicos. Portanto, esse protocolo integra avaliações comportamentais, análises de biomarcadores de estresse oxidativo, avaliação histopatológica e investigação molecular da via Keap-1/Nrf-2 para fornecer uma estrutura abrangente e reprodutível para estudar a neurotoxicidade induzida por pesticidas e os efeitos moduladores de compostos antioxidantes como o TQ.

Em conjunto, as evidências resumidas acima destacam a necessidade de uma abordagem experimental integrada para esclarecer os mecanismos subjacentes à neurotoxicidade induzida pelo DTM e avaliar potenciais intervenções protetoras. Ao combinar avaliações comportamentais com análises bioquímicas, histopatológicas e moleculares da via Keap-1/Nrf-2, o protocolo atual possibilita uma avaliação multidimensional do dano neuronal relacionado ao estresse oxidativo. A interpretação dos achados experimentais dentro desse arcabouço mecanicista enfatiza como a TQ modula a sinalização redox, atenua a lesão tecidular e melhora os resultados comportamentais no contexto da exposição subcrônica ao DTM.

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Protocolo

O Comitê Local de Ética de Experimentação Institucional com Animais aprovou o protocolo experimental sob o número de registro 68429034/35. A duração total do estudo foi de 32 dias. Antes dos experimentos, os animais estavam aclimatados às condições padrão de laboratório. Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos em estrita conformidade com as diretrizes institucionais e internacionais de ética animal. Os materiais experimentais usados neste protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

NOTA: Resíduos químicos e biológicos foram descartados de acordo com as diretrizes de segurança laboratorial e gestão de resíduos da instituição. Ácidos, bases e solventes orgânicos foram coletados em recipientes separados e rotulados e entregues à unidade institucional de resíduos perigosos. Materiais biológicos e consumíveis contaminados foram coletados em recipientes de risco biológico, esterilizados e transferidos para a instalação institucional apropriada para descarte final.

1. Desenho experimental

  1. Obtenha 24 ratos Wistar Albino machos adultos pesando 250 ± 20 g no Laboratório de Experimentos em Animais. Aloje cada rato individualmente em gaiolas a 24 ± 2 °C sob um ciclo de 12 horas de luz/escuro, com acesso ad libitum a comida padrão para ratos e água da torneira.
  2. Divida aleatoriamente os animais em quatro grupos (n = 6 por grupo): Grupo 1: Controle (C), Grupo 2: TQ, Grupo 3: DTM, Grupo 4: DTM + TQ.
  3. Dissolva DTM (98% de pureza) em óleo de milho e administre em uma dose de 1,28 mg/kg via gavage intragástrico por 30 dias.
  4. Dissolva o TQ em uma dose de 10 mg/kg em óleo de milho e administre via gavage intragástrico por 30 dias. Prepare todos os medicamentos frescos diariamente e administre em volume total de 1 mL/kg.
  5. No grupo de tratamento combinado, administrar a QT imediatamente após o DTM. Administre óleo de milho isolado ao grupo controle para lidar com o estresse relacionado ao gavage.
    NOTA: A dose de DTM foi selecionada com base na literatura anterior para induzir estresse oxidativo sem causar morbidade e corresponde aproximadamente a 1/100 do DL501.

2. Medição do peso corporal

  1. Meça o peso corporal nos dias 1, 10, 20 e 30 do estudo (Figura 1).

3. Parâmetros comportamentais

  1. Realize todos os testes comportamentais sob condições padronizadas para garantir consistência. Grave tanto o Teste de Natação Forçada (FST) quanto o Teste em Campo Aberto (OFT) usando uma câmera aérea que oferece uma visão completa do aparelho de teste. Mantenha a iluminação em aproximadamente 100–150 lux. Defina imobilidade como a ausência de movimento ativo, exceto pelos movimentos mínimos necessários para manter a postura e a respiração. Limpe todas as arenas de teste com 70% de etanol entre os animais para evitar influências olfativas.
  2. FST
    1. Realize a FST no dia 32 para avaliar comportamentos semelhantes à depressão. Realize uma sessão pré-teste de 15 minutos, 24 horas antes da sessão de teste de 5 minutos, para habituar os animais ao ambiente aquático e minimizar o estresse induzido por novidades. Não realize pontuação comportamental durante a sessão pré-teste.
    2. Individualmente, coloque os ratos em recipientes cilíndricos (diâmetro: 35 cm, altura: 50 cm) contendo 30 cm de água, mantidos a 25 ± 1 °C por 5 minutos.
    3. Registre as durações da natação, escalada e imobilidade usando uma câmera de vídeo. Quantifique parâmetros comportamentais em segundos a partir das gravaçõesde vídeo 10.
    4. Defina os comportamentos da seguinte forma:
      Imobilidade: Considere o animal imóvel quando permanece flutuando sem movimentos ativos, fazendo apenas movimentos mínimos necessários para manter a cabeça acima da água.
      Natação: Defina natação como movimento horizontal ativo em todo o cilindro, com movimentos coordenados das quatro patas.
      Escalada: Defina escalada como movimentos vigorosos direcionados para cima das patas dianteiras contra a parede cilíndrica enquanto o animal permanece em posição vertical.
    5. Se o animal permanecer completamente imóvel, avalie o comportamento como imobilidade de acordo com os critérios pré-definidos.
    6. Não aplique estimulação externa ou correção de curso durante a sessão de teste. Permita que o animal se comporte livremente durante todo o período de 5 minutos, a menos que a intervenção seja necessária por razões de segurança (por exemplo, risco de afogamento).
  3. OFT
    1. Realize a OFT no dia 31 para avaliar a atividade locomotora e comportamentos semelhantes àansiedade 11. Registre movimentos individuais por 5 minutos em uma arena de 90 x 35 cm, divididos em 24 unidades iguais por linhas pretas.
    2. Quantifique os seguintes parâmetros comportamentais a partir de gravações de vídeo feitas por um investigador cego para a alocação de grupos:
      Número de travessias com as quatro patas (atividade locomotora)
      Tempo passado nas zonas central e periférica (comportamento parecido com ansiedade)
    3. Se um animal permanecer completamente imóvel, registre o comportamento como imobilidade e atribua travessias zero para esse período.
    4. Não aplique estimulação externa, reposicionamento ou correção de curso durante a sessão de teste.
    5. Permita que o animal se comporte livremente durante todo o período de 5 minutos, a menos que seja necessária intervenção por motivos de segurança.
    6. Limpe a arena com 70% de etanol entre os animais para eliminar sinais olfativos.

4. Avaliação de marcadores de estresse oxidativo

  1. Realize todos os procedimentos no dia 32. Anestesiar profundamente ratos com xilazina intramuscular (5 mg/kg) e cetamina (45 mg/kg). Confirme anestesia profunda pela ausência do reflexo de retirada dos pedais. Colete aproximadamente 3–5 mL de sangue por punção cardíaca em tubos revestidos com EDTA.
  2. Eutanásia completa por exsanguinação sob anestesia profunda e confirmação da morte antes da coleta do tecido. Centrifuge amostras de sangue a 3.000 x g por 10–15 minutos a 4 °C. Colete cuidadosamente o plasma sem perturbar a camada buffy e armazene as aliquotas a −80 °C. Dissecar o cérebro rapidamente no gelo. Separe o hemisfério cerebral esquerdo e o hipocampo para análises bioquímicas e congele rapidamente em nitrogênio líquido (armazenamento de −80 °C). Fixe o hemisfério cerebral direito em formalina tamponada neutra a 10% para avaliação histológica.
  3. Análises de Estresse Oxidativo Plasmático
    1. Peroxidação de Lípidos Plasmáticos (Ensaio TBARS)
      1. Amostras de plasma de centrífuga (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Misture 0,5 mL de plasma com 1 mL de reagente TCA–TBA–HCl (15% ácido tricloroacético (TCA), 0,375% ácido tiobarbitúrico (TBA), 0,25 N ácido clorídrico (HCl)). Centrifuge a 1.000 x g por 10 minutos e transfira o sobrenadante para tubos de vidro. Adicione 50 μL de hidroxitoluno butilado 0,02% (BHT) para evitar oxidação artificial.
      2. Aqueça a 100 °C por 15 minutos, resfrie até temperatura ambiente, centrifuge a 1.000 x g por 10 minutos e meça a absorção sobrenadante a 532nm 10. Calcule a concentração de MDA usando a lei de Beer–Lambert
        ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1, l = 1 cm e expressa como plasma nmol/mL.
    2. Níveis de Tiol Plasmático (RSH)
      1. Misture 0,5 mL de plasma com tampão Tris-HCl (100 mM, pH 8,2) contendo 1% de dodecilsulfato de sódio (SDS) e 2 mM de ácido etilendediaminetetraacético (EDTA). Incube por 5 min a 25 °C e centrifuge (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Use o sobrenadante para análise.
      2. Adicione 0,3 mM 5,5′-dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) e incube a 37 °C por 15 minutos. Meça a absorção em 412nm 10. Calcule as concentrações de RSH usando ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 e expresse como plasma μmol/L.
    3. Níveis de NOx do Plasma (Reação Griess)
      1. Desproteinize o plasma com 0,3 M hidróxido de sódio (NaOH) e 5% de sulfato de zinco (ZnSO₄). Centrifuge a 20.000 x g por 5 minutos e colete o sobrenadante.
      2. Prepare soluções de stock de nitrato (100, 10 e 1 mmol/L) e gere uma curva padrão (1–100 μmol/L). Carregue 100 μL de sobrenadante (poços duplicados) em uma microplaca.
      3. Adicione 100 μL de cloreto de vanádio (III) (VCl₃), seguido de 50 μL de sulfanilamida e 50 μL de etilendiamina N-(1-naftil). Incube de 30 a 45 minutos em temperatura ambiente e meça a absorção a 540nm 10. Determine as concentrações de NOx a partir da curva padrão e expresse como plasma μmol/L.
  4. Análises de estresse oxidativo tecidual
    1. Use aproximadamente 100 mg de tecido do hemisfério cerebral esquerdo para todas as análises bioquímicas.
    2. Peroxidação de lipídios tecituais (ensaio TBARS)
      1. Homogeneize tecido (1:10 p/v) em TCA 10% gelado. Adicione um volume igual de 0,67% TBA e aqueça a 100 °C por 15 minutos. Resfrie e centrifuge (3.000 x g, 10 min, 4 °C)10. Meça a absorção do supernadante a 535 nm. Calcule o MDA usando ε = 1,56 × 105 M⁻1 cm⁻1 e exprima como nmol/g tecido úmido.
    3. Níveis de glutationa tecidular (GSH)
      1. Homogeneize o tecido em 10% de TCA (1:10 p/v) e centrifuge (3.000 x g, 10 min, 4 °C). Misture 0,5 mL de sobrenadante com 2 mL de solução DTNB (0,4 mg/mL em citrato de sódio a 1%). Meça a absorção imediatamente a 412 nm. Calcule o GSH usando ε = 13.600 M⁻1 cm⁻1 e expresse como μmol/g tecido úmido.
    4. Níveis de NOx tecidual (Reação de Griess)
      1. Homogeneize tecido em soro salino tamponado com fosfato (PBS) (1:5 p/v) e centrífuga (2.000 x g, 5 min). Desproteinizar o supernadante com 0,3 M de NaOH e 5% de ZnSO₄. Centrifuge (3.000 x g, 20 min) e colete o supernadante transparente.
      2. Prepare padrões de nitrato (1–100 μmol/L). Carregue 100 μL de sobrenadante em poços duplicados. Adicione os reagentes VCl₃ e Griess conforme descrito acima. Incube por 45 minutos a 37 °C e meça a absorção a 540nm 10. Determine as concentrações a partir da curva padrão e expresse como tecido μmol/g.
        ATENÇÃO: Procedimentos envolvendo produtos químicos perigosos, incluindo TCA, HCl, NaOH e solventes orgânicos, foram realizados em uma exaustão química certificada. Equipamentos de proteção individual (EP) apropriados, como jalecos de laboratório, luvas resistentes a produtos químicos, óculos de proteção e, quando necessário, protetores faciais, foram usados em todos os experimentos. Todos os produtos químicos foram manuseados de acordo com as diretrizes institucionais de segurança e as folhas de dados relevantes de segurança de materiais (MSDS).

5. Determinação dos níveis de Keap-1 e Nrf-2 por análise de Western blot

  1. Corte o tecido do hipocampo em pedaços de 50 mg e coloque em tubos de homogeneização contendo 500 μL de tampão RIPA suplementado com um coquetel inibidor de protease.
  2. Adicione uma quantidade apropriada de esferas magnéticas e homogeneize a 1.000 x g por dois ciclos. Centrifuge a 14.000 x g por 10 minutos a 4 °C.
  3. Transfira o sobrenadante para limpar tubos de microcentrífuga e centrifuge novamente sob as mesmas condições. Mantenha amostras no gelo e determine as concentrações de proteínas.
  4. Meça as concentrações de proteína usando um fluorômetro com o Kit de Ensaio BR de Proteína, seguindo as instruções do fabricante.
  5. Prepare géis SDS–PAGE a 10% para eletroforese. Ajuste a concentração de proteína para 30 μg/μL.
  6. Adicione 4x tampão de Laemmli na proporção de 3:1 e suplemente com 10% de β-mercaptoetanol. Aqueça as amostras a 95 °C por 5 minutos, depois centrifuge brevemente.
  7. Carregue 5 μL de marcador proteico e 30 μg de proteína por rota. Faça gels a 110 V por 60–90 minutos.
  8. Ative as membranas de PVDF em metanol 100% por 3–5 minutos, depois equilibre em 1× transfera buffer por 10 minutos em temperatura ambiente antes da transferência.
  9. Molhar os papéis filtrantes e esponjas com o tampão de transferência e montar cuidadosamente o sanduíche de transferência, garantindo a remoção completa das bolhas de ar. Realize a transferência de proteínas usando um sistema de transferência úmida a 100 V por 90 minutos a 4 °C (tensão constante).
  10. Bloqueie membranas em Albumina Sérica Bovina (BSA) a 3% por 1 hora em temperatura ambiente em um agitador orbital. Incubar membranas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários diluídos em 3% de BSA (Keap-1 e Nrf-2, 1:3.000; β-actina, 1:1.000).
  11. Lave as membranas 5 vezes por 5 minutos com 1 × soro com Tris-buffer e detergente Tween 20 0,1% (TBS-T). Incube com anticorpo secundário (1:15.000) por 1 hora em temperatura ambiente, no escuro.
  12. Lave as membranas conforme descrito e incube com um substrato de quimioluminescência aprimorada (ECL) (por exemplo, substrato HRP à base de luminol) conforme as instruções do fabricante (misturando volumes iguais de reagente A e B imediatamente antes do uso). Aplique substrato suficiente para cobrir completamente a superfície da membrana (aproximadamente 1 mL por membrana) e incube por 1–2 minutos em temperatura ambiente.
  13. Detectar sinais quimioluminescentes usando um sistema de imagem digital equipado para detecção de quimiluminescência (não é necessário um comprimento de onda específico de excitação, pois a emissão de luz resulta da reação HRP–luminol). Adquira imagens usando configurações automáticas de exposição, garantindo bandas não saturadas. Mantenha parâmetros de exposição idênticos para todas as amostras dentro do mesmo blot.
  14. Realizar análise densitométrica usando software de análise de imagem sob parâmetros idênticos de seleção de ROI, subtração de fundo e normalização. Normalize as intensidades das bandas Keap-1 e Nrf-2 para a proteína de manutenção correspondente, β-actina. Exporte valores normalizados como arquivos .csv para análise estatística.

6. Análise histopatológica

  1. Fixe o hemisfério cerebral direito com 10% de formalina neutra por 72 horas. Desidrate por uma série graduada de etanol (70%–100%), se incorpore na parafina e corte a 5 μm.
    Obtenha seções cerebrais coronais nos níveis do córtex hipocampal e entorrinal de acordo com as coordenadas estereotáxicas definidas em Paxinos & Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Academic Press). Use o visualizador interativo do atlas cerebral de ratos (https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas para verificar e refinar a localizaçãoanatômica 11.
  2. Prepare quatro seções coronais consecutivas (5 μm de espessura) a partir de tecido cerebral embutido em parafina utilizando procedimentos histológicos padrão. Tinga as seções com hematoxilina e eosina (H&E) de acordo com os protocolosconvencionais 12. Examine todas as lâminas sob um microscópio óptico com ampliação de 200×. Certifique-se de que a avaliação histológica seja realizada por um pesquisador cego para minimizar o viés doobservador 13.
    NOTA: Este procedimento garantiu uma comparação anatômica consistente entre os grupos.
  3. Avaliar semiquantitativamente a perda neuronal, edema celular, picnose nuclear, infiltração inflamatória e congestão vascular em 10 campos aleatórios por seção.
  4. Calcule as médias de pontuações para cada parâmetro por grupo. Os critérios de pontuação foram os seguintes: 0 (nenhum, <5%), 1 (leve, <33%), 2 (moderado, 33–66%) e 3 (grave, >66%; Tabela 1).

7. Análise imunohistoquímica da reatividade do Nrf-2 e Keap-1 no hipocampo e córtex entorrinal

  1. Prepare seções de 5 μm de espessura do hipocampo e córtex entorhinal e monte-as em lâminas de vidro.
  2. Desparafinize e reidrate as seções, depois lave em soro salino tamponado com fosfato (PBS) em temperatura ambiente.
  3. Incube seções com peróxido de hidrogênio a 3% por 5 minutos para bloquear a atividade endógena da peroxidase. Lavar seções com PBS
  4. Realize a coleta de antígeno aquecendo as lâminas em tampão de citrato de sódio (pH 6,0) por 10–15 minutos. Deixe as lâminas esfriarem por 30 minutos, depois lave com PBS.
  5. Incube novamente as seções com peróxido de hidrogênio a 3% por 15 minutos para garantir a inibição completa da peroxidase. Lave as seções com PBS.
  6. Aplique uma solução bloqueante por 10 minutos para reduzir a ligação inespecífica. Incube as seções durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra Nrf-2 (diluição 1:100) e Keap-1 (diluição 1:200). Lave as seções com PBS após a incubação.
  7. Incube seções com um anticorpo secundário adequado por 30 minutos em temperatura ambiente. Lave as seções com PBS.
  8. Aplique estreptavidina–peroxidase nas seções e incube por 20 minutos em temperatura ambiente em uma câmara umidificada (mantendo uma umidade relativa de 95–100% usando uma caixa de incubação lacrada contendo papel filtro umedecido). Lave as seções com PBS após a incubação.
  9. Aplique cromogênio DAB e monitore o desenvolvimento de cores sob um microscópio óptico a 100× de ampliação. Pare a reação enxaguando os lâminas com água da torneira.
  10. Contra-tinga as seções com hematoxilina diluída 1:9 por 5 minutos em temperatura ambiente. Enxágue bem com PBS e água destilada. Monte as seções usando um meio de montagem permanente.
  11. Examine as seções tingidas sob um microscópio óptico. Capture fotomicrografias com ampliação de ×400 a partir de 16 campos representativos por seção.
  12. Quantifique a imunorreatividade do Nrf-2 e Keap-1 usando software de análise de imagens. Registre e analise os dados quantificados para avaliação estatística adicional.
  13. Para análise imunohistoquímica, abra as imagens no ImageJ e calibre usando a ferramenta Set Scale. Converta todas as imagens para escala de cinza de 8 bits para padronizar as medições de intensidade. Defina manualmente regiões de interesse (ROIs) para áreas com coragem positiva e regiões adjacentes de fundo e salve-as no ROI Manager.
  14. Quantifique a intensidade da coloração usando deconvolução consistente de cor H-DAB, seguida por parâmetros de limiar idênticos em todas as amostras. Meça o valor médio de cinza, densidade óptica e porcentagem da área positiva.
  15. Para análise baseada em células, imagens com limiar segmentado usando a ferramenta Watershed e quantifique células positivas usando Analyze Particles. Todos os dados eram exportados como arquivos .csv para análise estatística.

8. Análise estatística

  1. Realize análises estatísticas usando a versão 29.0 do SPSS. Insira os dados brutos na aba Vista de Dados, com cada linha representando um animal individual e variáveis definidas na aba Vista de Variáveis; o grupo experimental foi codificado como uma variável categórica (Controle, TQ, DTM e DTM+TQ).
  2. Avalie a normalidade dos dados usando o teste de Shapiro–Wilk selecionando Analisar > Estatísticas Descritivas > Explorar, atribuindo variáveis de resultado à Lista de Dependentes e Grupo à Lista de Fatores, e ativando gráficos de Normalidade com testes. Para variáveis normalmente distribuídas, realize comparações de grupos usando análise unidirecional da variância (ANOVA) via Analisar > Comparar Médias > ANOVA Unidirecional, com estatísticas descritivas e o teste de Levene para homogeneidade de variâncias ativados em Opções.
  3. Quando um efeito principal significativo foi detectado, aplique o teste post hoc de Tukey pelo menu Post Hoc para identificar diferenças de grupo par a par. Use os resultados do teste de Levene para confirmar a homogeneidade da variância (p > 0,05).
  4. Para dados de pontuação histopatológicos que não atenderam às suposições paramétricas, realize uma análise não paramétrica usando o teste de Kruskal–Wallis, selecionando Analisar > Testes Não Paramétricos > Diálogos Legados > K Amostras Independentes, seguido pelo teste post hoc de Dunn com correção de Bonferroni usando o módulo de teste não paramétrico de Amostras Independentes.
  5. Exportando resultados estatísticos e tabelas resumidas como arquivos .xls ou .csv, os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (SD), e um valor-p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

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Resultados

Medições de peso corporal
O peso corporal foi registrado nos dias 1, 10, 20 e 30. Ratos dos grupos C e TQ apresentaram aumento progressivo do peso corporal durante o período experimental, sem diferença significativa entre esses grupos no dia 30. Em contraste, ratos expostos ao DTM apresentaram uma redução significativa do peso corporal em comparação com os controles. A coadministração de TQ atenuou a perda de peso associada ao DTM. Nenhuma mortalidade foi observada du...

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Discussão

Este estudo demonstra que a exposição bucal subcrônica ao DTM induz alterações comportamentais, bioquímicas, moleculares e histopatológicas consistentes em ratos, e que a TQ mitiga efetivamente esses efeitos quando administrada simultaneamente. Ao integrar testes comportamentais padronizados com perfil de estresse oxidativo, análise em nível de via da sinalização Keap-1/Nrf-2 e avaliação histopatológica, o protocolo fornece uma estrutura robusta e reprodutível para avaliar a neurotoxicid...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse ou interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Essa pesquisa não recebeu financiamento externo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
5,5'-Dithiobis (2-ácido nitrobenzoico)Thermo Scientific & nbsp;  69-78-3 
Centrífuga de bancada NF048Nü ve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, Estados Unidos7D2C10
Solução BSA  Proteintech, Estados Unidos)66201-1-IG
Hidroxitolueno butiladoSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatö R Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM   Bayer TR01426058O
Hematoxilina e traço; eosina Bio OpticaW01030708
Ácido clorídricoMerck7647-01-0
Programa de software Image J NIH; Washington, EUAhttps://imagej.net/ij/
Kit de coloração imunohistoquímica  Sistema de Detecção de Grande Volume Lab VisionTM UltraVisionTM: antipolivalenteHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Alemanhahttps://www.leicabiosystems
.com/equipamento-histológico/mi
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Microscópio óptico  Nikon, Eclipse Ni-U, 940728
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Leitor de Microplacas NanoBMG LABTECHSPECTROstar Nano
solução salina tamponada com fosfato  MerckP4417
Anticorpos primários Keap-1 ProteintechCat nº 10503-2-AP, 1:200
Anticorpos primários Nrf-2 ProteintechCat No. 16396-1-AP, 1/100
Kit de Ensaio BR de Proteína Qubit  ThermoFisher Scientific-INVITROGENP33211
Citrato de sódioMerck03-04-6132
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Substrato Quimioluminescente West Pico PLUS e o iBright 750 Sistema científico Thermo Fisherhttps://www.clinxsci.com/product
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Solução de sulfato de zincoMerck7733-02-0

Referências

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