Análise Espectral Raman Assistida por Aprendizado de Máquina do Nanosensor ssDNA-SWCNT responsivo à serotonina para Maior Seletivitud contra Dopamina

Summary

O protocolo descreve a análise espectral Raman de nanosensores SWCNT envoltos em ssDNA, possibilitando a medição seletiva aprimorada da serotonina contra dopamina com a assistência de um modelo de aprendizado de máquina.

Abstract

A serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) desempenha papéis críticos na neuromodulação, mas os métodos atuais de detecção têm dificuldade em fornecer a detecção em tempo real da 5-HT com alta sensibilidade e seletividade. Anteriormente, desenvolvemos um nanosensor de serotonina no infravermelho próximo (nIRHT), que consiste em um nanotubo de carbono de parede simples envolto em ssDNA que detecta sensibilmente o 5-HT. No entanto, a resposta de fluorescência do nIRHT não pode discriminar entre 5HT e dopamina (DA), limitando suas aplicações práticas. Neste estudo, a espectroscopia Raman combinada com aprendizado de máquina supera esse desafio de seletividade. As características espectrais da banda G revelaram assinaturas distintas para a ligação entre 5HT e DA ao nIRHT, com a DA causando maior supressão na banda G. Empregamos Raman diferencial (ΔRaman) para isolar mudanças espectrais específicas do analito e treinamos três modelos de aprendizado de máquina para classificação. O modelo de floresta aleatória com ΔRaman alcançou desempenho ótimo com 95,8% de precisão, superando significativamente modelos usando espectros Raman brutos. Essa abordagem mostrou maior especificidade, com respostas negligenciáveis à acetilcolina, GABA e glutamato, e atingiu um limite de detecção de 0,1 μM adequado para aplicações fisiológicas. Essa abordagem baseada em Raman transforma o sensor de fluorescência nIRHT não seletivo em uma plataforma capaz de discriminação robusta de neurotransmissores, superando questões de seletividade na detecção molecular baseada em nanotubos de carbono de parede única (SWCNT).

Introduction

A serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) é um neurotransmissor crítico que regula o humor, a cognição, o sono e o apetite, com disfunção implicada em depressão, ansiedade e outros distúrbios^{neuropsiquiátricos.} O monitoramento em tempo real da dinâmica da serotonina em sistemas biológicos continua desafiador devido à escala de tempo de milissegundos da transmissão sináptica e ao complexo ambiente químico do tecido^{neural 2}. Apesar dos avanços significativos nas tecnologias de detecção de neurotransmissores, alcançar tanto alta sensibilidade quanto seletividade molecular para a serotonina continua a apresentar desafios analíticos substanciais.

Os métodos atuais de detecção de serotonina vão desde técnicas analíticas tradicionais até plataformas emergentes de nanossensores. Cromatografia líquida de alto desempenho com detecção eletroquímica (HPLC-ED) permanece o padrão de excelência, atingindo limites de detecção de 0,056 nM com excelente^{reprodutibilidade 3}. No entanto, o HPLC requer preparação extensiva da amostra e tempos de análise de 15 a 30 minutos, impedindo o monitoramento em^{tempo real 4}. A voltametria cíclica de varredura rápida (FSCV) permite resolução temporal subssegundos em microeletrodos de fibra de carbono, mas sofre de incrustação de eletrodos e seletividade limitada entre neurotransmissores estruturalmente^{semelhantes 5,6}. Desenvolvimentos recentes em sensores fluorescentes geneticamente codificados, incluindo iSeroSnFR⁷ e GRAB-5HT⁸, alcançam sensibilidade e faixa dinâmica notáveis, mas exigem modificação genética dos tecidos-alvo, limitando assim a tradução clínica.

Sensores ópticos de nanotubos de carbono de parede única (SWCNT) surgiram como plataformas promissoras para a detecção de neurotransmissores sem^{rótulo 9}. SWCNTs funcionalizados por DNA exibem modulação de fluorescência no infravermelho próximo (nIR) ao se unir ao analito, permitindo a detecção na janela transparente ao tecido (900-1400 nm)^10,11. O grupo de Landry desenvolveu o sensor nIRHT por meio da evolução sistemática dos ligantes por enriquecimento exponencial (SELEC), selecionando ~10¹⁰ sequências únicas de ssDNA para identificar construtos responsivos à^{serotonina 12}. Este sensor alcança sensibilidade micromolar com aumento de fluorescência de 200% ao se ligar à serotonina, operando independentemente da dopamina ou oxidação da serotonina. Para descartar interferência oxidativa, nosso estudo anterior confirmou a estabilidade dessas soluções de neurotransmissores; Análises UV-Vis e RMN não revelaram alterações oxidativas ou novas formações de pico em comparação com o 5HT¹² puro. Além disso, o curto tempo de incubação e as condições de pH neutro usadas no sistema são projetados para evitar a formação significativa de quinona. De forma semelhante, o grupo Strano foi pioneiro no reconhecimento molecular da fase corona (CoPhMoRe), demonstrando que SWCNTs envolvidos em (GT)₁₅ detectam dopamina em concentrações 11 nM¹³. Nosso grupo avançou recentemente nesse campo por meio de otimização guiada por aprendizado de máquina, alcançando melhorias de sensibilidade de 2,5 vezes usando triagem de alta produtividade de sequências sistematicamente^{mutadas 14}.

Apesar desses avanços, persiste uma limitação fundamental na seletividade insuficiente entre serotonina e dopamina. Ambos os neurotransmissores contêm anéis aromáticos e cadeias de etilamina, que diferem por apenas um único grupo^{hidroxila 15}. Sensores SWCNT baseados em fluorescência atuais normalmente alcançam razões de seletividade abaixo de 5:1, inadequadas para distinguir neurotransmissores co-liberados em ambientes^{sinápticos 16}. Esse desafio de seletividade é particularmente crítico, já que serotonina e dopamina frequentemente colocalizam regiões cerebrais que regem recompensa e^{motivação 17}.

A espectroscopia Raman oferece informações químicas complementares por meio da análise de modos vibracionais do complexo^{SWCNT-analito 18}. A banda G (~1580 cm⁻¹) dos SWCNTs se divide em componentes G⁺ e G⁻, com frequências sensíveis à adsorção molecular e à dopagem^{eletrônica 19}. Um estudo anterior demonstrou que tensioativos não covalentes em SWCNT induzem mudanças espectrais Raman distintas na região^{da banda G 20}.

Neste trabalho, demonstramos a análise espectral Raman assistida por aprendizado de máquina do sensor nIRHT para alcançar maior seletividade entre serotonina e dopamina. Caracterizamos sistematicamente respostas Raman dependentes da concentração de 0,01 a 100 μM, revelando impressões digitais espectrais distintas para cada neurotransmissor. Três modelos de aprendizado de máquina — rede neural convolucional (CNN), máquina vetorial de suporte (SVM) e floresta aleatória (RF) — foram treinados em conjuntos de dados espectrais para classificar a identidade do analito. De forma crítica, introduzimos o processamento Raman diferencial, que remove sinais de linha de base para isolar características específicas do analito. O modelo RF otimizado com processamento DR alcança 95,8% de precisão de classificação, representando um avanço significativo na discriminação molecular. Essa abordagem multimodal, combinando sensibilidade à fluorescência do nIR com especificidade química Raman, oferece um caminho para o monitoramento seletivo e em tempo real da serotonina em ambientes biológicos complexos.

Protocol

1. Fabricação de nanosensores SWCNT nIRHT funcionalizada por ssDNA

1. Combine 1 mg de nanotubos de carbono de parede simples (SWCNTs), 100 μL de 1 mM E6#9 ssDNA e 900 μL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) em um tubo de 1,5 mL.
   ATENÇÃO: O pó de SWCNT seco é um risco potencial de inalação. Manuseie o pó dentro de uma capela química certificada e use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo máscara e luvas.
2. Disperse a mistura usando um sonicador de banho por 5 minutos. Sonice a mistura usando um sonicador de ponta equipado com uma sonda de 3 mm a 50% de amplitude por 30 minutos em um banho de gelo.
3. Centrifuge a solução sonicada a 21.500 x g por 1 hora para precipitar SWCNTs não dispersos. Colete cuidadosamente 850 μL do sobrenadante e transfira-o para um novo tubo.
4. Meça a absorção da suspensão SWCNT coletada em um comprimento de onda de 632 nm. Calcule a concentração usando o coeficiente de extinção SWCNT de 0,036 (mg/L)⁻¹ cm⁻¹. Armazene a solução final do sensor nIRHT a 4 °C até o uso posterior.

2. Medição de espectros Raman

1. Carregue 90 μL da dispersão nIRHT de 10 mg/L em uma placa de 96 poços. Meça o espectro Raman do sensor em um buffer PBS usando uma fonte de excitação a laser de 532 nm. Defina esse espectro gravado como referência.
   ATENÇÃO: É crucial manter estritamente a potência do laser em 10 mW e o comprimento de onda em 532nm ao investigar amostras biológicas vivas. Potências mais altas do laser podem induzir fototoxicidade severa e comprometer a viabilidade celular. O laser de 532 nm a 10 mW utilizado neste protocolo está bem estabelecido como seguro e não destrutivo para análise de células vivas, preservando organelos^{sensíveis 21} e a atividade eletrofisiológica dos neurônios^{primários 22} , garantindo uma aquisição robusta do sinal Raman.
2. Aumente cada solução de 90 μL do sensor (10 mg/L) com 10 μL da solução do analito para atingir concentrações finais de 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 e 100 μM. Espere por 5 minutos após a adição do analito para permitir incubação suficiente.
3. Meça os espectros Raman das amostras incubadas. Prepare amostras em triplicado para cada concentração e repita os passos 2.1 a 2.2 para garantir a reprodutibilidade.

3. Análise de dados baseada em aprendizado de máquina

1. Construa o conjunto de dados a partir de um total de 208 espectros Raman, compreendendo 77 respostas à dopamina (DA), 76 respostas à serotonina (5HT) e 47 respostas ao grupo controle (PBS).
2. Realize a subtração de fundo na região da banda G dos dados espectrais. Normalize os dados subtraídos do fundo com base no pico da banda G+.
3. Aplique um filtro mediano para reduzir o ruído nos espectros normalizados. Isolar as mudanças espectrais (ΔRaman) subtraindo o espectro de controle normalizado de cada espectro tratado pelo analito.
4. Desenvolver um modelo de Rede Neural Convolucional (CNN), uma Floresta Aleatória (RF) e uma Máquina de Vetores de Suporte (SVM) para a classificação ternária de 5HT, DA ou o controle.
5. Divida todo o conjunto de dados em conjuntos de treinamento, validação e teste usando uma proporção de 6:2:2.
6. Configure a arquitetura CNN com três camadas de convolução 1D utilizando uma função de ativação do ReLU e um tamanho máximo de pooling de 2, seguidas por duas camadas totalmente conectadas.
7. Configure a SVM usando um kernel de Função de Base Radial (RBF) para classificação não linear.
8. Configure o modelo RF usando hiperparâmetros padrão.
9. Treine os modelos construídos usando validação cruzada de 5 vezes. Calcule as métricas médias de desempenho em todas as 5 partes para garantir robustez estatística.
10. Selecione o modelo que gerar maior precisão nos dados de validação para a análise final.
11. Avalie o modelo selecionado no conjunto de teste para verificar sua capacidade de generalização.
12. Determine o limite indireto de detecção (LOD) excluindo sequencialmente dados do conjunto de treinamento que estejam abaixo de um limiar de concentração de 0,1 μM.
13. Teste o modelo treinado em toda a faixa de concentração, incluindo concentrações abaixo dos critérios, para estabelecer o LOD final.

Results

O nanosensor SWCNT funcionalizado por DNA ssDNA E6#9 (nIRHT), desenvolvido anteriormente pela metodologia SELEC, demonstra aprimoramento reversível de fluorescência nIR após a ligação ao 5HT, permitindo imagens 5HT in vitro e ex^{vivo 12} em tempo real. A sequência E6#9 (5'-CCCCCCCAGCACCACAGCACACTCCCCCCCC-3') envolve SWCNTs para criar sítios de ligação para 5HT. No entanto, esse sensor carece de especificidade: tanto o 5-HT quanto o DA resultam em a...

Discussion

A análise espectroscópica Raman proporcionou um aumento significativo na especificidade do sensor nIRHT, uma capacidade não alcançável com sua resposta convencional de fluorescência. Observamos que a DA induziu uma supressão mais pronunciada da banda G⁻ (1570 ^cm-1) em comparação com a 5HT. Essas assinaturas diferenciais provavelmente surgem de orientações moleculares variadas e geometrias de ligação na superfície do SWCNT. Especificamente, a metade catecol da DA provavelmente ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	Nanointegris
iDus1.7 InGaAs	ANDOR	DU490A-1,9
Ramantouch	Nano Fóton
Vibra Cell 130	SONICS