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Imagem por Ressonância Magnética Multianimal para Medições de Tumores em Modelos de Câncer de Pâncreas em Ratos

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DOI:

10.3791/69927

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3 de fevereiro de 2026

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Biomedical Imaging, Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo utiliza uma cama multicâmara para ressonância magnética paralela (RM) de até quatro animais para detectar tumores de adenocarcinoma pancreático em modelos de camundongos geneticamente modificados. Esse protocolo de ressonância magnética multianimal é rápido e econômico para detectar e medir tumores, facilitando a seleção de animais para estudos pré-clínicos e o monitoramento longitudinal do crescimento tumoral.

Resumo

Modalidades avançadas de imagem in vivo , como ressonância magnética (RM), são ferramentas essenciais para detectar tumores de forma eficaz em modelos de camundongos pré-clínicos. A ressonância magnética fornece informações anatômicas detalhadas sobre a localização e o tamanho do tumor. No entanto, essa modalidade de imagem é cara e demorada. Para superar essa barreira de acesso sem comprometer a qualidade da imagem, foi implementado um protocolo de ressonância magnética multianimais. Esse protocolo utiliza um inserto de leito de quatro câmaras para obter ressonâncias magnéticas anatômicas de alta resolução com vários animais em uma única sessão de aquisição. Simultaneamente, imaginar múltiplos camundongos reduz o tempo e o custo desse procedimento. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de ressonância magnética multianimal projetado para aumentar a eficiência da detecção de tumores e do monitoramento longitudinal tumoral em um modelo de camundongo geneticamente modificado por Kras, com p53-deletado (KPC) de adenocarcinoma ductal pancreático. Esse modelo KPC clinicamente relevante e bem estabelecido forneceu insights valiosos sobre os mecanismos moleculares subjacentes à carcinogênese pancreática, à progressão tumoral e à resistência ao tratamento. Como prova de conceito, esse protocolo é aplicado para validar o benefício terapêutico do agente quimioterapêutico padrão de cuidado gemcitabina no modelo KPC. As futuras aplicações deste desenho de estudo pré-clínico guiado por ressonância magnética são brevemente discutidas para avaliar a eficácia terapêutica das terapias combinadas.

Introdução

O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) continua sendo uma das malignidades mais letais. Apesar de melhorias modestas na sobrevivência nos últimos anos, a taxa de sobrevivência a 5 anos ainda é de apenas 13%. Na maioria dos casos, a PDAC é detectada em estágio avançado, frequentemente envolvendo invasão local ou metástase distante, o que complica o tratamento. A doença é biologicamente diversa e marcada por células tumorais altamente invasivas, um estroma desmoplástico denso e baixavascularização 2,3,4. Esse microambiente tumoral complexo continua dificultando os esforços para caracterizar plenamente os componentes celulares e não celulares que influenciam a progressão da doença. Para lidar com isso, são necessários modelos pré-clínicos eficazes que imitem de perto a progressão da doença humana e a desmoplasia.

Uma variedade de modelos de camundongos pode ser usada para estudar a biologia da progressão do câncer e avaliar a eficácia de terapiasinovadoras 5,6. O modelo de camundongo geneticamente modificado (GEMM) impulsionado por KRas desenvolve espontaneamente tumores pancreáticos que recapitulam muitas características fisiopatológicas e moleculares do PDAChumano 3,7,8,9,10,11. Em particular, o modelo KPC movido por Kras, eliminado por p53 (LSL-KrasG12D; p53lox/+; Pdx1-Cre) é um PDAC bem caracterizado GEMM 7,8,9. A imagem tumoral é um componente importante dos estudos pré-clínicos. A detecção e a medição do tamanho tumoral permitem a seleção de animais para estudos pré-clínicos, monitoramento longitudinal do crescimento tumoral e progressão da doença, e avaliação da resposta ao tratamento.

Modalidades avançadas de imagem in vivo, como ultrassom (EUA), bioluminescência (BLI), tomografia computacional (TC), imagem de fluorescência (FLI), tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (MRI) podem ser usadas para imagem tumoral no modelo KPC e modelos PDACsimilares 12,13,14,15,16. No entanto, a imagem tumoral no modelo KPC pode ser desafiadora, e cada uma dessas modalidades oferece pontos fortes e limitações únicas. Tecnologias de imagem óptica, como bioluminescência (BLI) e ultrassom (EUA), são não invasivas e econômicas. No entanto, sua resolução espacial limitada, especialmente para órgãos internos, pode levar a uma correlação fraca com os volumestumorais 12,15,17,18. A bioluminescência requer células geneticamente modificadas que expressem sinal de luciferase, o que também depende da entrega do substrato, do fluxo sanguíneo e da oxigenação dos tecidos. Um tomógrafo computacional oferece imagens rápidas com artefatos de movimento mínimos, mas contraste pobre de tecidos moles sem agentes de contraste. O contraste iodado pode causar toxicidade em camundongos. A imagem por fluorescência requer agentes de contraste/sondas fluorescentes, e a autofluorescência dos órgãos abdominais reduz a sensibilidade.

Devido às limitações associadas a outros métodos de imagem, a ressonância magnética (RM) é geralmente considerada a técnica mais confiável para avaliar tumores profundos, oferecendo contraste superior de tecidos moles e sensibilidade molecular para estruturas anatômicasinternas 13,14,15,19 . No entanto, protocolos padrão de ressonância magnética pré-clínica envolvem altos custos operacionais e longos tempos de aquisição, podendo ser uma barreira para muitos laboratórios de pesquisa. A ressonância magnética multianimal pode superar essa barreira de acesso reduzindo o tempo de preparação do animal pré-exame (anestesia), o tempo de varredura e a recuperação pós-exame. Este protocolo demonstra a viabilidade técnica da imagem tumoral por PDAC (Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura 4) e o uso de achados de imagem para recrutar animais para tratamento quimioterapêutico com gemcitabina (Figura 5). Tumores PDAC apresentam múltiplos mecanismos inerentes que contribuem para a resistência contra agentes quimioterápicos padrão de cuidado (SOC). como gemcitabina, gemcitabina/nab-paclitaxel ou FOLFIRINOX 2,3,4. Esse protocolo oferece uma plataforma adequada e robusta para avaliar novos agentes terapêuticos e quimioterapia SOC a fim de encontrar combinaçõespromissoras 20,21,22,23,24,25,26,27 que possam melhorar a resposta ao tratamento nos pacientes.

Protocolo

Todos os experimentos descritos foram conduzidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Michigan State University. Todos os procedimentos envolvendo animais vivos seguem as diretrizes estabelecidas para garantir o bem-estar e o tratamento humano dos animais. Este protocolo descreve o uso e tratamento do modelo de camundongos KPC do PDAC: LSL-K-Ras G12D (Krastm4Tyj); p53lox/lox (Trp53tm1Brn); Pdx1-Cre (Pdx1-cre6Tuv)9.

1. Preparação pré-imaginária animal

  1. Garanta a verificação adequada da genotipagem dos camundongos KPC antes do uso. Transporte camundongos experimentais da instalação animal para a instalação de imagem.
  2. Anestesie até quatro camundongos em uma câmara de indução pré-aquecida e selada com 1,5-2% de isoflurano e 0,8-2 L/min de oxigênio. Confirme a anestesia aplicando um estímulo tóxico (beliscão nos dedos dos pés).
  3. Aplique lubrificante oftálmico em ambos os olhos de cada camundongo para evitar a dessecação da córnea.

2. Configuração de cama de ressonância magnética multianimal

  1. Coloque dois camundongos anestesiados em posição ventral na parte inferior (esquerda e direita) do inserto impresso em 3D da cama, que está preso ao suporte padrão de PET/RM fornecido pelo fornecedor. Certifique-se de que os animais estejam posicionados com a coluna e os membros retos.
    NOTA: Uma impressora 3D foi usada para imprimir os insertos da cama (Arquivo Suplementar 1 e Arquivo Suplementar 2).
  2. Conecte a entrada de ar na cama do fabricante aos cones do nariz usando tubos (diâmetro interno 1/16", diâmetro externo 1/8"), e conexões Luer (por exemplo, 7 conectores macho 1/16", 2 conectores fêmea-fêmea, 2 conectores soquete T para soquete).
  3. Prenda a cabeça do camundongo em um cone nasal para manter a anestesia (1,5-2% isoflurano, 0,8-2 L/min oxigênio). Cubra a parte inferior com a parte superior dos insertos impressos em 3D (Figura 2B).
  4. Coloque os outros dois camundongos anestesiados em uma posição ventral na parte superior (esquerda e direita) do inserto impresso em 3D.
  5. Prenda a cabeça do camundongo em um cone nasal para manter a anestesia (1,5-2% isoflurano, 0,8-2 L/min oxigênio).
  6. Adesse o painel de monitoramento respiratório no canto superior esquerdo do rato. Certifique-se de que o monitor esteja na altura do abdômen, e não do tórax, para medir a respiração sem sinal do batimento cardíaco.
  7. Ajuste o nível de isoflurano para manter uma frequência respiratória de 30-40 bpm durante todo o exame, tipicamente 1,5-2%. Se a trilha de respiração não for visível ou a amplitude for muito baixa, certifique-se de que a almofada esteja firmemente presa pela fita e que todas as conexões do tubo estejam firmes.
  8. Cubra a cama para completar a câmara de ressonância magnética multianimal (Figura 2B).
    NOTA: A cama de PET/ressonância magnética para rato único fornecida pelo fornecedor é equipada com ar quente circulante para manter a temperatura corporal dos animais (~35-37 °C). Até quatro mouses podem ser escaneados simultaneamente com inserts impressos em 3D. As configurações exatas da temperatura da água quente, assim como a entrada e a saída de ar, vão depender da configuração em cada local, incluindo a distância da sala de controle até a ressonância magnética. Esses podem ser configurados em cada local usando uma série de varreduras piloto onde a temperatura é monitorada durante todo o processo e depois padronizada para cada estudo.

3. Configuração de pré-varredura e calibração de imagens

  1. Certifique-se de que os camundongos estejam no centro da bobina de ressonância magnética no sentido do comprimento, alinhando o laser vermelho com o centro da cama multicâmara antes de enviar o suporte da cama para dentro do cano.
  2. Atribua uma etiqueta ao escaneamento usando o ID do mouse e a data da varredura no seguinte formato: Esforço, ID do Mouse, Data da Varredura.
  3. Configure uma varredura FLASH ponderada T1 com uma fatia axial, duas fatias coronais e duas fatias sagitais para visualizar os camundongos na cama de quatro câmaras e definir a área de imagem usando as seguintes configurações: TR/TE 50/2,4 ms, 2 médias, ângulo de inversão 20°, resolução 0,313 mm, espessura da fatia de 1 mm, tempo de varredura 13 s.
  4. Verifique se todo o corpo do mouse está no campo de visão e se os ratos estão retos. Se não, repita os passos de posicionamento do mouse e/ou mova a cama do mouse para dentro ou para fora do cano.
    NOTA: Esses parâmetros foram baseados nas especificações do sistema de ressonância magnética utilizado. Esses parâmetros podem ser ajustados conforme necessário para otimizar a aquisição de imagem de acordo com os requisitos experimentais e/ou as capacidades do sistema de ressonância magnética.

4. Imagem por ressonância magnética multianimal

  1. Configure a sequência de eco rápido de rotação ponderada em T2 com os seguintes parâmetros: Tempo de repetição (TR): 3.200 ms, Tempo de eco: 46 ms, Número de médias: 10, Resolução no plano: 300 x 300 μm, Número de fatias coronais: 14, Intervalo intraslice: 0,3 - 0,7 mm, Supressão de gordura: Ativada, Fator raro: 8, Pacotes de fatia: 2, Tempo total de aquisição da imagem: 14 min.
  2. Clique no centro (translação) e na borda (rotação) das caixas amarela e verde na imagem localizadora para ajustar o posicionamento do pacote de fatias conforme necessário, otimizando a cobertura da região do pâncreas e de outros órgãos abdominais para o conjunto superior e inferior dos animais.
  3. Confirme se todos os quatro camundongos estão corretamente alinhados na configuração de camas multianimais antes de prosseguir com a varredura.
  4. Monitore a respiração durante as sequências de imagem e ajuste o nível de isoflurano, se necessário.
  5. Após a realização da ressonância magnética, verifique se a qualidade da imagem está adequada. Procure por artefato de movimento, que aparece como desfoque, se um mouse se moveu durante a varredura. Verifique a cobertura total do abdômen. Se necessário, reposicione os mouses e faça a varredura novamente.

5. Recuperação de camundongos

  1. Quando o exame for concluído e verificado, remova a cama do sistema de ressonância magnética.
  2. Abra o topo da cama multicâmara. Remova o monitor respiratório do rato superior esquerdo e transfira os animais da parte superior e inferior dos insertos impressos em 3D para a gaiola de recuperação.
  3. Coloque os animais em uma gaiola de recuperação sobre uma almofada térmica de 37 °C para recuperação pós-anestesia.
  4. Monitore a frequência respiratória e o movimento para garantir a recuperação completa da anestesia antes de devolver os camundongos às gaiolas domésticas. Sinais de recuperação incluem respiração e movimento normais (caminhada).

6. Processamento e análise de arquivos por ressonância magnética

  1. Exporte as imagens DICOM do software de ressonância magnética para um programa de análise de imagens para cortar as imagens de uma imagem com quatro mouses para uma imagem para cada mouse individual.
  2. No software, abra a imagem do conjunto superior de animais no módulo View . As configurações automáticas de janela/nível são suficientes, mas ajuste na aba de controle geral de exibição de imagem se necessário, para que os mouses fiquem visíveis. Na aba VOI , desenhe manualmente uma caixa generosa ao redor do canto superior direito do mouse usando um objeto analítico cubo; Depois, corte a imagem ao redor dessa caixa na aba de operações de Mascaramento e contorno . Ao salvar o novo arquivo, edite os metadados e o nome do arquivo DICOM para o ID correto do mouse; depois, repita para o mouse no canto superior esquerdo usando a mesma imagem, abra a imagem para o conjunto inferior de mouses e repita o corte e salvamento do retorno do retorno.
    NOTA: O VOI não precisa ser preciso.
  3. Use um software de visualização de ressonância magnética para analisar imagens armazenadas em arquivos DICOM.
  4. Analise cortes de imagem do dorsal ao ventral ou do ventral ao dorsal. Localize o baço e o estômago para estabelecer um contexto adequado para a identificação de pâncreas e/ou tumores pancreáticos.
  5. Defina "Região de Interesse" (ROI) desenhando uma linha na fronteira do tumor e realize segmentação semiautomatizada para calcular o volume tumoral. Observe cistos de líquido e outros achados hipercromáticos (Figuras 3 e Figura 4).
    NOTA: Um visualizador de ressonância magnética deve ser usado para analisar arquivos DICOM.

7. Tratamento com gemcitabina

  1. Realize ressonância magnética semanalmente em animais com KPC até que o tumor comece a se formar e possa ser detectado (volume de ≥20mm 3). Antes de escanear, certifique-se de que os camundongos estão com boa saúde (sem perda excessiva de peso ou sinais de desconforto, dificuldade para respirar e/ou ofegante).
  2. Estabeleça um regime de tratamento assim que os critérios tumorais forem atendidos.
    NOTA: Para o grupo tratado, a gemcitabina foi injetada intraperitonealmente (i.p.) em uma dose de 100 mg/kg duas vezes por semana.
    ATENÇÃO: A gemcitabina é um agente quimioterapêutico citotóxico. Manuseie com equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados, incluindo luvas e jaleco. Descarte seringas e materiais contaminados de acordo com os protocolos institucionais de resíduos perigosos.
  3. Realize exames de ressonância magnética (após as seções 1 a 6) uma vez por semana para monitorar a resposta tumoral à gemcitabina.
  4. Sacrificar animais quando o tumor atende aos critérios de eutanásia com base em medições de volume feitas pela ressonância magnética (Seção 6) e/ou outros sintomas.
  5. Ao fazer uma ressonância magnética em camundongos tratados, coloque uma barreira protetora para evitar a possível transferência do agente quimioterapêutico por excreções. Durante e após trabalhar com gemcitabina, siga boas práticas de higiene pessoal. Descarte as seringas vazias usadas em um recipiente para objetos cortantes de quimioterapia.
  6. Após concluir o trabalho, borrife todo o equipamento de anestesia, leitos de ressonância magnética e todas as superfícies de trabalho com 70% de etanol. Coloque barreiras protetoras e luvas quimicamente contaminadas usadas durante a imagem em um saco plástico, amarre o saco e coloque-o em um barril de fibra para incineração.
  7. Agende sessões de imagem antes da próxima rodada de tratamento para minimizar a exposição ao agente quimioterapêutico.
    NOTA: Uma frequência de ressonâncias magnéticas de duas semanas pode ser considerada dependendo da taxa de crescimento tumoral e do regime de tratamento. As respostas ao tratamento por cinética tumoral podem ser avaliadas por meio de imagens longitudinais (Figura 5).

Resultados

Animais com KPC desenvolvem tumores pancreáticos após as 12 semanas de idade, com 9 anos de idade. Utilizando uma cama de ressonância magnética multicâmara, a triagem tumoral de camundongos KPC foi iniciada aos 10 semanas de idade. Isso permitiu recrutar animais apresentando tumores de aproximadamente 200mm3 para o estudo pré-clínico com o tratamento com gemcitabina. Foram observadas diferenças na cinética tumoral e variações na apresentação tumoral. A maioria dos tumores de KPC apresentou um padrão sólido de crescimento com foco único ou predominante (Figura 4A), o que facilitou o recrutamento animal para tratamentos e avaliação do volume tumoral. No entanto, animais com múltiplos pequenos tumores sólidos espalhados por todo o pâncreas também foram observados (Figura 4A). Alguns casos de PDAC também podem apresentar lesões císticas intratumorais preenchidas com fluido, acompanhadas por lesões císticas peritumorais não neoplásicas e retenção de líquidos resultantes de obstrução ductal da vesícula biliar e/ou pâncreas. (Figura 4A).

Após o recrutamento, os animais foram aleatoriamente distribuídos em dois grupos experimentais: um grupo controle que não recebeu tratamento e um grupo tratado que recebeu administração intraperitoneal (p) de gemcitabina em uma dose de 100 mg/kg duas vezes por semana. Dos 23 animais elegíveis no total, 4 fêmeas e 7 machos foram alocados ao grupo controle, e 6 fêmeas e 6 machos ao grupo tratado. Ressonâncias magnéticas semanais foram realizadas usando o sistema de cama multianimal (Figura 5A), que nos permitiu monitorar continuamente as mudanças na cinética de crescimento tumoral tanto no grupo controle quanto no tratado (Figura 5B).

Os dados de imagem processados demonstram que tumores no modelo KPC tratado com gemcitabina apresentaram um padrão de crescimento mais lento em comparação com o grupo controle não tratado (Figura 5C), o que esteve associado a um aumento estatisticamente significativo (Log rank test, p = 0,04) na sobrevivência geral da coorte tratada (Figura 5D). A sobrevivência mediana para KPC não tratada foi de 20 semanas, enquanto o grupo tratado apresentou prolongamento da sobrevivência mediana de mais de 23 semanas (Figura 5D).

Figura 1
Figura 1: Fluxo de trabalho de procedimento de ressonância magnética multianimais, processamento e análise de imagens. Etapas-chave do protocolo de ressonância magnética multianimal são destacadas, desde a preparação pré-escaneada até os estudos pré-clínicos guiados por imagem. Até 4 animais são anestesiados em uma câmara de indução (preparação pré-escaneada) e preparados para colocação em uma cama multianimal (configuração de cama de ressonância magnética multianimais). Uma imagem pré-escaneada dos animais em configuração 2 x 2 (2 no compartimento superior, 2 no compartimento inferior) seguida por uma varredura por ressonância magnética (imagem por ressonância magnética). Os dados de imagem de cada animal são salvos como arquivos individuais e analisados independentemente (Análise de Imagens). A identificação de imagem e o tamanho do tumor são usados para selecionar animais para estudos pré-clínicos e monitorar a resposta ao tratamento (ensaios pré-clínicos). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2
Figura 2: Etapas principais para ressonância magnética multianimal desde a configuração até a varredura. (A) Painel superior, montagem do sistema personalizado de leito de ressonância magnética multianimais. Insertos de cama impressos em 3D personalizados com portas de anestesia integradas cabem em um suporte padrão de cama para PET/MRI de um único rato. No painel inferior, esses inserts impressos em 3D dividem a cama em duas câmaras, permitindo a imagem simultânea de até quatro animais: os animais 1 e 2 em cima do inserto superior, e os animais 3 e 4 em cima do insert inferior. O plano transversal e o plano modificado frontal dos inserts da impressora 3D do visualizador STL são mostrados. (B) Colocação sequencial de camundongos em uma cama de ressonância magnética multicâmara (de cima para baixo). Imagem superior, dois animais colocados em posição ventral na parte inferior (esquerda e direita) do inserto impresso em 3D, que fica dentro da cama PET/MRI fornecida pelo fornecedor. Imagem do meio, os outros dois camundongos estão posicionados em posição ventral na parte superior (esquerda e direita) do inserto impresso em 3D; O mouse posicionado no lado esquerdo do inserto superior possui um monitor respiratório acoplado. Imagem inferior: montagem completa de quatro animais com a capa em cima. Todos os animais têm cabeças fixadas em um cone nariz para manter a anestesia (1,5-2% isoflurano, 0,8-2 L/min de oxigênio). Arranjo final dos quatro animais no suporte da cama de ressonância magnética com administração de anestesia, aquecedor de água morna e sistema de monitoramento de sinais vitais para permitir a varredura de ressonância magnética e a aquisição de dados de todos os animais em uma única sessão. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3
Figura 3: Coleta e processamento de dados de ressonâncias magnéticas multianimais. (A) Vista representativa (plano medial) da ressonância magnética inicial dos quatro animais. (B) Ressonância magnética (plano dorsal) dos quatro camundongos em uma cama multicâmara: dois camundongos posicionados na parte inferior (3, 4) e dois camundongos no topo (1, 2) dos insertos impressos em 3D. (C) Arquivo final de ressonância magnética de alta resolução de cada varredura individual do camundongo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4: Apresentações diversas de tumores PDAC: uma análise integrada de ressonância magnética e histológica. (A) Imagem representativa de ressonância magnética (plano dorsal) ilustrando a variabilidade anatômica dos tumores PDAC (da esquerda para a direita): pâncreas normal, tumores multifocais com lesões císticas preenchidas com líquido e massa tumoral sólida. Os órgãos anatômicos são codificados por cores da seguinte forma: estômago (amarelo), baço (verde), tumor (roxo), acúmulo de líquido devido à obstrução dos ductos (azul). Barra de escala branca = 1 cm. (B) Seções histológicas de tumores coloridos com H&E ao lado de classes celulares baseadas em sobreposições de classificadores treinados assistidos por computador, destacando as características histopatológicas dos tumores alinhadas com os achados da ressonância magnética. Área do tumor (T) delineada em preto para todas as amostras quando o tumor está presente. As classes celulares são mostradas em cor: tecido pancreático normal (cinza), tumor (vermelho) e células imunes (amarelo). Barra de escala preta = 0,5 cm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Aplicação de ressonância magnética multianimal para recrutamento animal e monitoramento do crescimento tumoral durante o tratamento com gemcitabina. (A) Linha do tempo do desenho experimental: Animais (14+ semanas de idade) foram recrutados após uma ressonância magnética detectar um tumor ≥ 200 mm3. Os camundongos do grupo tratado receberam gemcitabina (100 mg/kg, i.p., b.i.w.) até atingirem os critérios de eutanásia. Ressonâncias magnéticas multianimais foram realizadas durante todo o experimento para todos os animais, a fim de monitorar a cinética do crescimento tumoral. (B) Imagens representativas de ressonância magnética (plano dorsal) mostrando progressão tumoral de um animal do grupo não tratado e de um animal do grupo tratado, do Dia 0 até o último dia do experimento (desfecho de sobrevivência). Barra de escala branca = 1 cm. (C,D) Gráficos ilustrando a cinética do crescimento tumoral (C, n = 4 [2 F, 2 M] vs. 4 [2 F, 2 M]) e a sobrevivência geral (D, n = 11 [4 F, 7 M] vs. 12 [6 F, 6 M]) no grupo controle não tratado e tratado. A significância estatística para as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier foi determinada pelo teste de Log-rank (Mantel-Cox) (* p < 0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Arquivo STL para impressão 3D do inserto inferior com portas de anestesia integradas que cabe em um suporte padrão de cama PET/MRI para rato único. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Arquivo STL para impressão 3D do inserto superior com portas de anestesia integradas que cabe em um suporte padrão de cama PET/MRI para rato único. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Esse protocolo utiliza uma cama padrão de PET/MRI para rato único fornecida pelo fornecedor, modificada com inserções impressas em 3D feitas sob medida, que permitem a varredura simultânea de até quatro camundongos (Figura 1). Essa configuração multianimal reduz substancialmente não apenas o tempo caro de escaneamento de ressonância magnética, mas também a duração total do procedimento. Ele permite a preparação paralela (anestesia, posicionamento na cama e carga de cama), escaneamento e recuperação de quatro animais em uma única sessão, em comparação com o tempo adicional necessário para preparar, escanear e recuperar cada animal individualmente em quatro sessões separadas. O conjunto também inclui cones nasais individuais para administração controlada de anestesia a cada animal, monitoramento vital dedicado para um animal e capacidades integradas de aquecimento para manter a temperatura corporal de todos os camundongos escaneados (Figura 2). Os insertos impressos em 3D proporcionam alinhamento consistente dos animais e melhoram a consistência da segmentação. O monitoramento respiratório em tempo real permite a avaliação contínua e o ajuste da anestesia durante a varredura, minimizando assim artefatos de movimento.

Esse protocolo foi utilizado para detectar e monitorar longitudinalmente a progressão do tumor pancreático no modelo KPC (Figura 5A-C) tratado com o agente quimioterapêutico gemcitabina, servindo como um estudo pré-clínico de prova de conceito. Gemcitabina, sozinha ou em combinação, é um tratamento de primeira ou segunda linha para pacientes com câncer de pâncreas local oumetastático 28,29,30. Esses resultados em animais tratados com gemcitabina são consistentes com relatos anteriores, que também mostraram benefício emsobrevivência 31. Mais importante ainda, esse protocolo oferece uma plataforma adequada e robusta para estudar terapias combinadas de novos agentes terapêuticos e quimioterapia SOC no modelo KPC ou modelos similares de PDAC. Essas terapias combinadas podem ser inibidores de pequenas moléculas, imunoterapia, siRNAs, moduladores de atividade de microRNA e outros oligonucleotídeos terapêuticos contra alvosmoleculares-chave 20,21,22,23,24,25,26,27 . Essas terapias combinadas também podem incluir alvos geneticamente modificados para entender sua interação com a quimioterapia SOC ou outras terapias em estágio inicialde desenvolvimento 9,20,32.

Embora o foco deste protocolo seja a imagem do pâncreas e de outros órgãos da cavidade abdominal, este protocolo multianimal e as sequências descritas de ressonância magnética podem ser aplicados para caracterização anatômica de outros modelos de câncer em camundongos, como câncer de mama e glioblastoma, ou outras doenças envolvendo o rim e/oufígado 33. Estamos cientes de outros protocolos que descrevem a ressonância magnéticamultianimal 18,34. Por exemplo, Dazai et al. descreveram a varredura de ressonância magnética neuroanatômica de até setecamundongos 18. Embora esse sistema permita a imagem cerebral de sete animais, ele não possibilita controle individual do anestésico e da temperatura para cada camundongo. A câmara de alojamento deles é projetada para camundongos que pesam menos de aproximadamente 32 g; Em contraste, nossa cama multicâmara suporta uma gama mais ampla de tamanhos corporais de camundongos. Dependendo do órgão pretendido, do tempo de varredura e da resolução, o protocolo de Dazai et al. pode oferecer algumas vantagens em relação ao protocolo descrito aqui.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado, em parte, pela bolsa R01 CA258314 do Instituto Nacional do Câncer e pela bolsa MSU Tetrad Initiative for Interdisciplinary Research edição 2024 para a LFS. Somos gratos ao Núcleo de Análise de Tecidos do Programa de Saúde de Precisão da MSU, ao Instituto de Ciências e Engenharia Quantitativas da Saúde da MSU/Programa de Imagem Molecular de Precisão do Programa de Imagem Molecular, aos Recursos Animais do Campus da MSU, ao Laboratório Veterinário de Diagnóstico da MSU e ao Centro de Análise e Mapeamento Quantitativo de Bioelementos (QBEAM) da MSU pela assistência técnica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Impressora 3D  StratasysJ750 Para inserções de leito de ressonância magnética multi-animais
Gemcitabina HClApexBioA1402-500Para injeções de ip & nbsp;
HOROSHOROShttps://horosproject.org/Para análise de ressonância magnética
IsofluranoCovetrus11695067772Para anestesia de camundongos
Vaporizador de isofluranoSOMNI ScientificVS6002Para anestesia de camundongos
Seringas de Insulina U-100 de Baixa DoseBD14-826-79Para injeções de ip & nbsp;
Acoplamentos de tubo Luer Lock, plugues retis de nylon, farpado para tubo de 1/16" de diâmetro x7McMaster51525K521Para montagem de camas de ressonância magnética multi-animais
Acoplamentos de tubo Luer Lock, plugue, para tubo de bardbed de 1/16" de diâmetro x 2McMaster7466N11Para montagem de camas de ressonância magnética multi-animais
Conector Luer macho para macho X2SAIMMLPara montagem de camas de ressonância magnética multi-animais
Sistema de monitoramento e portão de pequenos animais compatível com RMSAIIModelo 1030monitorar animais durante a ressonância magnética
Adaptador de cama para ressonância magnéticaBrukerT150743Componente de leito de ressonância magnética fornecido pelo fornecedor
Bobina de ressonância magnética, 72 mm de divisão interiorBrukerT20209V3Bobina de ressonância magnética fornecida pelo fornecedor
Rato médio multimodal de berçoBrukerT151629Leito de ressonância magnética fornecido pelo fornecedor
lubrificante oftálmico & nbsp;Covetrus75848Para uso durante anestesia
Software ParaVision 360Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/paravision-360.htmlPara análise de ressonância magnética
PMOD 4.2Brukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/preclinical-imaging/pmod.htmlPara análise de ressonância magnética
sistema de ressonância magnética pré-clínica  BrukerBioSpec 70/30Para ressonância magnética
Resina Stratasys Vero ClearStratasysRGD810Para fabricação de leito de ressonância magnética multi-animal
Conectores Soquete em T, Luer Lock Tube x2McMaster51525K443Para cama de ressonância magnética de vários animais  
tubo (diâmetro interno 1/16", diâmetro externo 1/8")BrukerT12330Para montagem de camas de ressonância magnética multi-animais

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