Medições Ultradiluídas Automatizadas da Autoassociação para a Identificação de Anticorpos com Propriedades Favoráveis de Solução de Alta Concentração

Resumo

Aqui, descrevemos uma adaptação de alto rendimento de um ensaio de estabilidade coloidal de anticorpos em larga escala para gerar grandes conjuntos de dados e suportar previsões de desenvolvimento prontas para IA/ML.

Resumo

Um dos principais desafios na engenharia de anticorpos é o desenvolvimento de métodos analíticos de triagem para avaliar a estabilidade coloidal, garantindo que os biológicos sejam adequados para formulação e administração em alta concentração. A espectroscopia de nanopartículas de autointeração estabilizada por carga (CS-SINS), uma versão modificada da espectroscopia convencional de autointeração de nanopartículas por captura de afinidade (AC-SINS), foi adaptada como uma avaliação robusta de estabilidade coloidal para prever o comportamento de soluções em alta concentração. Esse método possibilita decisões críticas de desenvolvimento em estágio inicial ao identificar problemas de estabilidade coloidal antes que recursos significativos sejam investidos, reduzindo substancialmente as taxas de desistência a jusante e acelerando os prazos de seleção dos candidatos. Este estudo demonstra que o ensaio se integra perfeitamente aos fluxos de trabalho de descoberta existentes e pode ser realizado em paralelo com ensaios típicos em estágio inicial devido aos seus requisitos mínimos de amostra, fornecendo dados valiosos para prever comportamentos de alta concentração sem comprometer outros esforços de caracterização. Foi demonstrado que medições rotineiras de espalhamento dinâmico da luz (DLS), além do deslocamento no comprimento de onda da ressonância do plasmon, podem melhorar a confiabilidade do método HTP descrito aqui. Em conjunto, espera-se que a validação cruzada usando medições DLS e programas automatizados de análise facilite a seleção confiável de terapêuticas candidatas a anticorpos de várias modalidades.

Introdução

No desenvolvimento e formulação de anticorpos terapêuticos, opalescência e viscosidade são considerações fundamentais no desenvolvimento de um produto comercial centrado no^paciente 1,2,3,4,5,6,7,8. Classicamente, grandes quantidades de proteína são necessárias para observar diretamente essas propriedades em alta concentração, impedindo efetivamente a identificação ótima de leads durante os estágios iniciais da descoberta de anticorpos, quando a disponibilidade de proteínas é limitada. A identificação confiável desses fenômenos é fundamental para avaliações de desenvolvibilidade que mitiguem o comportamento ruim de soluções de alta concentração a^jusante 1,2,3,4,5,6,7,8. Assim, há interesse significativo em métodos de alta taxa e baixa concentração, que são preditivos de comportamentos ruins da solução em concentrações^elevadas 9,10,11,12,13,14,15,16. Um desses métodos, o kD-DLS, demonstrou ser confiável para prever propriedades de alta concentração, mas não atende aos requisitos de baixo consumo de proteína e alto rendimento dos fluxos de trabalho em estágio^{inicial 12,13}.

Recentemente, um ensaio baseado em nanopartículas de ouro de consumo ultrabaixo conhecido como CS-SINS demonstrou ter forte correlação com os resultados dos experimentos kD-DLS e é razoavelmente eficaz em prever propriedades ruins da solução em alta^{concentração 16}. Essas características tornam o CS-SINS um candidato ideal para desenvolvimento como ferramenta de triagem de alto rendimento. O ensaio CS-SINS utiliza um anticorpo de captura imobilizado em superfícies de nanopartículas de ouro para ancorar anticorpos candidatos por meio de suas regiões Fc, deixando os braços Fab acessíveis às interações da solução. Essa configuração significa que as interações Fab-Fab dominam o sinal de autoassociação medido, o que é vantajoso, pois estudos indicam que domínios Fab contribuem predominantemente para as características de autoassociação de mAb, provavelmente devido às propriedades da região que determina a complementaridade (CDR)^{na superfície} 17,18,19,20,21,22,23 . Essa base mecanicista torna o CS-SINS bem adequado para prever riscos de estabilidade coloidal relevantes para formulações de alta concentração. Métodos alternativos de HTP, incluindo cromatografia de adsorção monocamada em pé (SMAC), uma abordagem baseada em colunas de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) que simula a autoassociação com uma fase estacionária genérica, e cromatografia de interação cruzada (CIC), envolvem preparação de colunas e requisitos de amostra^grande 17,24,25,26,27.

O método descrito aqui detalha uma configuração validada por placa do ensaio CS-SINS e possibilita a triagem de HTP por meio de automação e análise laboratorial, combinando as vantagens dos métodos existentes enquanto aumenta a confiabilidade dos resultados. Este estudo também demonstra como vários tipos de amostras produzem resultados de alta qualidade devido à natureza do enriquecimento da auto-interação no ensaio, estabelecendo que o método é agnóstico em relação às fontes proteicas. Além disso, consideramos como a comunicação precoce das propriedades coloidais para as equipes de projeto pode apoiar ainda mais o design estratégico de fármacos multicorpos^{multiespecíficos} 28,29,30,31,32,33,34.

O estudo das propriedades de soluções de alta concentração é tipicamente realizado a jusante em campanhas de seleção de candidatos multiespecíficas, após a seleção de leads e a conclusão da engenharia (Figura 1A). A previsão precoce dessas propriedades tornou-se viável com métodos como o CS-SINS, que exigem alguns microgramas de amostra, prevendo assim riscos de estabilidade coloidal com medições^{ultradiluídas 16}. A introdução da triagem precoce de desenvolvimento (Figura 1A), quando o grupo de candidatos é grande, e campanhas paralelas de geração de dados para formatos monoespecíficos e multiespecíficos poderiam melhor informar o processo de descoberta de medicamentos^31,32. O HTP CS-SINS se encaixa no paradigma existente de triagem molecular em paralelo à ligação e determinação da função, acrescentando assim ao pacote de informações sem interromper ou atrasar fluxos de trabalho existentes. A seleção de candidatos principais, com ênfase em propriedades coloidais favoráveis, impactará a progressão da seleção, conforme representado na Figura 1B.

No fluxo de trabalho proposto para triagem de desenvolvimento inicial, a identificação de leads considera o quadro completo das propriedades favoráveis do medicamento, incluindo fabricação e acesso do paciente, simplificando assim o desenvolvimento a^{jusante 34}. As propriedades de alta concentração dos biológicos podem determinar sua via de administração: injeções intravenosas que exigem visitas hospitalares ou injeções subcutâneas, que podem ser administradas em casa pelo paciente, mas frequentemente requerem um produto de alta^{concentração 35,36}. MAbs desenvolvíveis com baixa autoassociação são frequentemente formulados em >100 mg/mL ^5,35. A otimização de formulação usando excipientos, como agentes viscoredutores, pode superar os riscos de estabilidade coloidal para candidatos desejáveis com propriedades de solução fracas nas fases de desenvolvimento^{CMC 34,35}. No entanto, isso introduz desafios futuros na fabricação biofarmacêutica e aumenta os prazos para aprovações bem-sucedidas^{de medicamentos 36}. Excipientes conhecidos por reduzir viscosidade (como sais e aminoácidos) também podem afetar a estabilidade das proteínas, alterando os perfis de desenvolvimento previamente caracterizados e complicando ainda mais o^{processo 36,37}. Além disso, excipientes excessivos podem limitar a população de pacientes devido a considerações de imunogenicidade, diversas preocupações de segurança ou afetar a adesão ao tratamento, podendo introduzir novos desafios no espaço de produção 38,39,40. Starr et al. publicaram o método CS-SINS pela primeira vez, descrevendo a fração másica ótima de PLL e IgG como sendo 0,03 e confirmando a estabilização de nanopartículas por medições de potencial zeta para a auto-associação de mAb nas formulações^{de histidina 16}. Notavelmente, adicionar PLL em excesso cria superestabilização no ensaio e impede a observação da autointeração de mAb (a melhoria da estabilidade das nanopartículas de ouro por PLL é mostrada na Figura Suplementar 1). O uso de formulações de histidina sem sal minimiza a triagem eletrostática (aumentando o comprimento de Debye), o que amplia a gama de interações intermoleculares, amplificando assim sinais fracos de autoassociação e imitando comportamentos de alta concentração quando os anticorpos estão mais próximos. Em geral, formulações de baixa resistência iônica são preferidas para formulações de alta concentração, onde não se observa auto-associação.

Polímeros PLL grandes impedem a ocupação de mais mAbs de captura nas superfícies de nanopartículas de ouro, o que reduz a janela de deslocamento plasmônico e exige um programa mais sofisticado de ajuste de curvas e análise para análises subsequentes de dados. Este estudo utilizou uma ferramenta de portal web que sincroniza com bancos de dados internos. A principal vantagem desse custo inicial é o potencial de construção de dados de um grande pool de sequências para maximizar a diversidade de candidatos a jusante e mitigar gargalos nas fases de desenvolvimento mais^{caras 34, 35, 36}. O ensaio CS-SINS que descrevemos aqui se destaca como um método compatível com HTP, que demonstrou correlacionar-se bem com ensaios de estabilidade coloidal^{em estágio tardio 16}. O perfilamento assistido por IA está em andamento para o design cuidadoso de multiespecificidades para programas futuros e para a compreensão das contribuições individuais de cada domínio em formatos^complexos 41,42,43,44. Esses esforços influenciarão coletivamente as meta-análises e uma determinação mais detalhada das propriedades de estabilidade coloidal para terapias de anticorpos e, assim, economizarão tempo nos estágios iniciais de P&D.

Protocolo

A Figura 2 mostra a preparação da conjugação de nanopartículas, a Figura 3 mostra o fluxo de trabalho em sua totalidade, a Figura 4 mapeia o processo de automação do laboratório e a Figura 5 contém um diagrama do pipeline de análise de dados. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de tampões

NOTA: Semana 1 (preparação de exemplo)

1. Prepare histidina (10 mM), pH 6,0 (amostra e tampão de ensaio).
   NOTA: Esses passos são realizados no Dia 1.
   1. Dissolver 5 mM de monocloridrato monocloridrato de L-histidina e 5 mM de L-histidina em água ultrapura. Adicione ácido clorídrico em gota enquanto mexe até que o pH atinja 6,0, conforme medido com um medidor de pH calibrado.
   2. Filtre a solução através de um filtro de 0,22 μm do tamanho de um poro sob vácuo e colete o filtrado em um frasco estéril.
   3. Meça a condutividade para fins de controle de qualidade e garanta uma leitura de aproximadamente 500 μS/cm.
2. Prepare acetato de potássio (20 mM), pH 4,3 (tampão de conjugação de captura mAb).
   1. Dissolva acetato de potássio em água ultrapura e ajuste o pH para 4,3 com ácido acético glacial.
   2. Esterilize a solução por filtração a vácuo através de um filtro de 0,22 μm do tamanho dos poros, conforme descrito na etapa 1.1.2.
3. Prepare poli-L-lisina.
   1. Prepare uma solução de 5 mg/mL de estoque em água ultrapura e armazene a −20 °C até o uso.

2. Diálise de todas as amostras (candidatos mAbs)

NOTA: Realize essas etapas nos dias 2 a 5.

1. Pré-imerda 100 μL ou 300 μL de diálisadores em 10 mM de histidina, pH 6,0, por 5 minutos.
2. Transfira todas as amostras (50–100 μL) para fitas cassete de diálise. Submerga as cassetes em um buffer de histidina de 10 mM, pH 6,0 (700 mL por caixa), adicione barras de agitação aos reservatórios, coloque os reservatórios em placas magnéticas de agitação e incube a 4 °C por 2 h 15 min.
3. Realize sete trocas de tampão com 10 mM de histidina, pH 6,0, a cada 2 horas e 15 minutos, ou realize quatro trocas de tampão durante a noite para garantir a remoção completa do sal das amostras.
4. Recolha as amostras, transfira-as para frascos de matriz limpa e armazene a 4 °C até que o ensaio CS-SINS seja realizado.
5. Meça as concentrações da amostra e registre as informações de polidispersão após a diálise. Calcule as concentrações corrigidas dividindo os valores brutos de absorção a 280 nm pela absorvância a 280 nm para uma solução de 1 mg/mL.
6. Prepare o arquivo de entrada do manipulador de líquidos com os endereços e concentrações do poço (μg/mL), incluindo os controles.

3. Troca de buffer de captura mAb (Figura 2, passo 1)

NOTA: Realize essas etapas no Dia 1 da Semana 2 (ensaio).

1. Remova o buffer de armazenamento das colunas de dessalinização de 2 mL centrifugando por 2 min a 1.000 × g em temperatura ambiente. Prepare duas colunas de dessalinização para cada 700 μL de mAb de captura necessário. Descarte o fluxo de fluxo após cada etapa de centrifugação.
2. Lave as colunas três vezes com 1 mL de tampão de acetato de potássio 20 mM, pH 4,3. Centrifuge as colunas por 2 minutos a 1.000 × g em cada lavagem.
3. Adicione 700 μL de captura mAb (anticorpo anti-humano específico de Fcγ) a cada coluna e elua em um tubo fresco de 15 mL, centrifugando por 2 minutos a 1.000 × g.
4. Colete o eluato dessalinizado, aplique em uma segunda coluna de dessalgação equilibrada e centrifuge por mais 2 minutos a 1.000 × g.
5. Combine todas as amostras eluidas.
6. Meça a concentração da solução de mAb capturada após a dessalinização, conforme descrito nos Dias 2–5, passo 2.5.
7. Dilua a solução de captura mAb em 0,8 mg/mL com 20 mM de tampão de acetato de potássio, pH 4,3, e reserve até o uso.

4. Preparação de um estoque de trabalho de poli-L-lisina

1. Dilua uma pequena alíquota da solução de poli-L-lisina em 2,66 mg/mL com água ultrapura.

5. Concentração de nanopartículas de ouro (Figura 2, passo 2)

1. Prepare alíquotas de 1,2 mL da suspensão original em tubos de 1 mL ou alíquotas de 4,8 mL em tubos de 5 mL usando tubos microcentrífugas de polipropileno contendo nanopartículas de ouro de 20 nm. Centrifuge a 21.130 × g por 6 minutos.
2. Remova os supernadantes (~1,1–1,15 mL) sem perturbar os pellets e transfira-os para um tubo cônico separado.
3. Combine os pellets concentrados e os volumes residuais em um tubo de microcentrífuga limpo. Determine o volume de nanopartículas pipeteando e ajuste o volume para (número de tubos de 1 mL × 50 μL) ou (número de tubos de 5 mL × 200 μL) usando o sobrenadante reservado. Por exemplo, após centrifugar 10 alíquotas de 1,2 mL em tubos de 1 mL, ajuste o volume final das nanopartículas concentradas para 500 μL.

6. Montagem de nanopartículas

1. Misture cuidadosamente 1,5 μL da solução de trabalho poli-L-lisina com 48,5 μL do mAb de captura trocado por buffer (Figura 2, passo 3).
2. Prepare uma mistura 1:1 da solução concentrada de nanopartículas do passo 5 e da solução de poli-L-lisina/captura mAb do passo 6.1 (Figura 2, passo 4).
3. Incube a mistura durante a noite em temperatura ambiente (23 °C) (Figura 2, passo 5).

7. Montagem de placas de ensaio para manuseadores de líquidos

NOTA: Execute esses passos no Dia 2.

1. Compile os materiais necessários para o ensaio, incluindo anticorpos diálises, o arquivo de entrada do manuseador de líquidos contendo concentrações pós-diálise, nanopartículas de ouro conjugadas, pontas de manuseio robótica, placas e reservatórios (Figura 3, Automação de Laboratório, passo 1). Pré-carregue as ponteiras, amostras, placas e reservatórios no convés de acordo com o layout mostrado na Figura 3 (Automação de Laboratório, passo 1).
2. Adicione os controles aos poços A12–D12 da placa de amostragem (dois controles positivos e dois controles negativos). Deixe o poço H12 vazio para a amostra tampão preparada pelo manuseador de líquidos.
3. Abra o método de manuseador de líquidos CS-SINS e inicie o programa (Figura 3, Automação de Laboratório, etapas 2–3). Carregue o arquivo de entrada do manipulador de líquidos quando solicitado e insira o número de amostras (Figura 4A). Revise as duas janelas subsequentes de verificação de cálculo (Figuras 4B, C), confirme os valores e prossiga com a execução.
4. Normalize as amostras, incluindo os controles, para 55,5 μg/mL em tampão de histidina de 10 mM, pH 6,0, transferindo-as dos tubos da matriz para a placa de reação em cadeia da polimerase em um volume final de 100 μL (Figura 4D, passo 1). Monitore o progresso, observando que as áreas completas das placas aparecem cinza e os passos ativos são destacados em verde (Figura 4E).
5. Prepare uma diluição em volume maior de cada amostra a 11,1 μg/mL em um tampão de histidina de 10 mM, pH 6,0, transferindo material da placa de reação em cadeia da polimerase para um bloco de poço profundo a volume final de 200 μL (Figura 4D, passo 2).
6. Permita que o sistema pause após a etapa 2. Quando solicitado, misture as nanopartículas de ouro concentradas preparadas no passo 6.3 invertendo o tubo e pipetando para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes.
   1. Distribua as nanopartículas uniformemente entre dois tubos de microcentrífuga de polipropileno e coloque os tubos, com tampas abertas, na localização designada do suporte de tubos no convés (Figura 4D, destacada como "AuNP"). Retome a execução e permita que o manipulador de líquidos dispense 20 μL de nanopartículas em cada poço do segundo bloco de poço profundo, dois poços por vez (Figura 4D, passo 3).
7. Permita que o manipulador de líquidos transfira 192 μL de amostra do bloco de poço profundo contendo as amostras de 11,1 μg/mL (Figura 4D, passo 2) para o segundo bloco de poço profundo e misture completamente. Gerar um mastermix de 4× CS-SINS para cada amostra, resultando em uma concentração final de 10 μg/mL após a adição de 48 μL de nanopartículas de ouro a um volume final de 240 μL (Figura 4D, passo 3). Comece o temporizador de incubação de 4 horas neste ponto.
8. Permita que o manipulador de líquidos dispense 30 μL no poço fonte e depois dispense 60 μL em três dos quatro poços em cada quadrante de uma placa de 384 poços para gerar triplicados técnicos para cada amostra (Figura 4D, passo 4). Retorne os 30 μL restantes à placa fonte.
9. Monitore o layout do convés do manuseador de líquidos conforme a corrida avança. Observe as pontas usadas e os poços de amostra preenchidos mudando de cinza claro para cinza escuro em tempo real, enquanto movimentos ativos são indicados em verde (Figura 4E).
10. Remova a placa após a execução. Sele a placa com uma vedação transparente minimamente adesiva e incube em temperatura ambiente por um total de 4 horas. No ponto de 3,5 horas, inicie o programa dinâmico de espalhamento da luz para equilibrar a câmara a 20 °C usando as configurações mostradas na Figura Suplementar 2.
11. Meça o espectro de absorção de cada poço de 510 a 570 nm em incrementos de 1 nm (30 nm de cada lado do pico) no ponto de tempo de 4 horas.
12. Meça imediatamente a placa usando o leitor de placas de espalhamento dinâmico da luz no ponto de 4,5 h com as configurações mostradas na Figura Suplementar 2.
    NOTA: Use um leitor de placas de alto desempenho para medições espectrais devido à faixa dinâmica limitada. Não use a função de leitura rápida.

8. Análise de dados (Figura 5, Esquema de processamento de dados)

1. Exporte os arquivos brutos da plataforma de espectrofotômetros e salve-os em uma pasta acessível do drive.
2. Acesse o portal web de scripts vinculado ao servidor interno. Insira os parâmetros de entrada necessários do CS-SINS, incluindo: (1) Comprimento de onda inicial; (2) Localização do diretório do arquivo de resultados brutos; (3) Conjunto de placas e identificadores de candidatos; (4) Endereços de poços de controle positivo e negativo para normalização; (5) designação de configuração do método ("Manual" ou "Manipulador de líquidos"); (6) Instrumentos usados para varredura espectral e medições dinâmicas de espalhamento da luz; (7) Identificador de caderno eletrônico de laboratório (ELN); (8) Data de aquisição.
3. Submeta os parâmetros para o portal web e verifique se três arquivos Excel são gerados em uma subpasta do diretório raw-results.
4. Calcule os valores λmax usando o script de ajuste de curvas executado pelo portal web.
5. Revise os dois arquivos de saída contendo valores replicados, resultados normalizados e gráficos representativos para as medições de varredura espectral e espalhamento dinâmico da luz.
6. Use o terceiro arquivo de saída, contendo metadados do ensaio e resultados normalizados, para criar resultados laboratoriais em massa na interface do usuário do banco de dados. Defina atributos de relatórios de acordo com requisitos específicos do grupo e envie os resultados para o banco de dados para permitir o acesso em toda a empresa.

Resultados

A Figura 6 mostra os resultados, a Figura Suplementar 3A mostra um exemplo de pontuação CS-SINS de uma amostra representativa de bruto e purificada, a Figura Suplementar 3B mostra a variabilidade do sinal de poço a poço em diferentes dias, a Figura Suplementar 4 contém os resultados do processo de validação de placas, e a Figura Suplementar 5 descreve o cálculo de normalização para ambas as leituras do CS-SINS.

Importante destacar que amostras foram coletadas com concentrações relatadas de pelo menos 55 μg/mL após a diálise em 10 mM de Histidina, pH 6,0, para viabilidade do ensaio, já que essa é a concentração mínima do estoque (mínimo de 6 μg por amostra) e criaram novos identificadores filhos. No total, havia 70 amostras purificadas e 20 amostras de expressão bruta, cada uma representando tipos de amostra em diferentes pontos de verificação de desenvolvimento (purificada na fase de otimização de chumbo e matéria bruta purificada em 1 ou 2 etapas da etapa de identificação de chumbo destacada na Figura 1A). O material bruto foi gerado a partir de um sistema de expressão mamífero totalmente automatizado, a Plataforma de Expressão e Purificação de Proteínas (PEPP; GNF, San Diego, CA, EUA). Os controles foram derivados de material comercial e anteriormente validados como tendo valores de viscosidade máxima ou mínima, kD-DLS e CS-SINS. Alíquotas frescas são armazenadas a -80°C, e uma nova aliquota é usada para cada ensaio.

As Figuras 6A,B mostram as médias espectrais e DLS plotadas por tipo de amostra, e os gráficos de barras exibem barras de erro (desvio padrão) com códigos de cor correspondentes. A normalização é calculada pelo script dividindo a diferença entre a amostra e os valores de controle negativos (calculado lambda max pelo deslocamento espectral ou média Z, diâmetro hidrodinâmico em nm) pela diferença entre os controles (Figura Suplementar 5). A Figura 6C apresenta as pontuações espectrais em relação às pontuações DLS, mostrando uma correlação clara entre as abordagens analíticas. A Tabela 1 lista os identificadores, endereços de poços, tipo de amostra, escores espectrais e escores DLS junto com seus desvios padrão para referência. O corte para o risco de estabilidade coloidal (independentemente da leitura espectral ou DLS) para um IgG monoespecífico é qualquer valor acima de um valor normalizado de 0,35 (indicado por uma linha pontilhada verde na Figura 6A,B), 6/70 (excluindo controles replicados) amostras purificadas pontuaram alto risco, enquanto 64/70 tiveram pontuação baixa para o material purificado. Importante, esperaríamos que o corte de corte fosse mais alto para formatos multiespecíficos. Para as amostras de expressão bruta, 2/20 amostras tiveram pontuação alta, enquanto 18/20 tiveram pontuação baixa. Dos materiais purificados testados aqui, a expressão bruta de lotes parentais de um subconjunto também foi triada e produziu resultados semelhantes (mostrados na Figura Suplementar 3A), indicando a natureza representativa do ensaio após a ampliação (purificação) de proteínas candidatas de lotes independentes. Apesar dos tamanhos limitantes das amostras, observa-se que o erro padrão pode tender a ser maior para as amostras brutas de PEPP do que para as amostras purificadas. O benefício de realizar o CS-SINS nos estágios finais garante que avaliações ortogonais possam ser realizadas com ensaios que exigem mais proteína para análise, como medições de viscosidade e kD-DLS, enquanto o benefício de realizar o CS-SINS em triagens de desenvolvimento inicial aborda preventivamente os riscos de estabilidade coloidal, podendo influenciar o conjunto final de candidatos a líder (Figura 1B). Candidatos borderline com alto erro podem ser confirmados como alto ou baixo risco com ensaios posteriores.

Devido à pequena natureza dos deslocamentos plasmônicos detectados, uma leitura alternativa foi descrita para incutir confiança no ensaio, o que amplia a faixa dinâmica, o que poderia ser particularmente útil na ausência de um leitor de placas de alta qualidade para detectar pequenas mudanças. A leitura DLS distingue entre agrupamento de nanopartículas e dependência das propriedades espectrais das nanopartículas; no entanto, ambos os descritores possuem faixas de erro padrão semelhantes e são pequenos em relação às suas medições. Parece que amostras mais propensas a leituras de valores atípicos terão erro maior (ou serão "multimodais" e não reportarão resultado pelo DLS), mas valores CS-SINS dentro da faixa de trabalho do ensaio apresentam baixas distribuições de erro. Ao comparar valores DLS com valores espectrais de pontuação, a distribuição de erro é mais precisa para os resultados DLS obtidos de amostras brutas do que para os escores espectrais; no entanto, isso só fez diferença para um candidato que ficou abaixo do corte como pontuação DLS, mas não como pontuação espectral. Isso pode ser útil se os laboratórios tiverem instrumentos diferentes disponíveis.

Para abordar especificamente a confiabilidade do processamento de dados e do próprio método, os tempos de varredura foram modificados de ponta a ponta para ambas as leituras dos controles positivo e negativo no conjunto de dados acima, além de múltiplos controles médios e baixos para servir como pontos de referência intermediários no início e no fim de uma placa de 384 poços. A Figura Suplementar 4 mostra os resultados da validação final da placa, mostrando valores em sua maioria insignificantemente diferentes das amostras colocadas no início versus o final da placa (Figura Suplementar 4A,B) e alta correlação entre ambos os valores da leitura (Figura Suplementar 4C). Por fim, o fator Z e o percentual de CV foram calculados para os controles a partir do conjunto de dados de varredura espectral e DLS na Figura 6. A partir dos dados gerados para os controles e apresentados aqui, a leitura espectral da varredura foi determinada como tendo um fator Z de 0,648, com 0,019% de CV para o controle positivo e 0,012% para o controle negativo. Para a leitura DLS, foi calculado um fator Z de 0,998, com 0,025% de CV para o controle positivo e 0,021% para o controle negativo. No geral, o coeficiente de correlação de Spearman entre os valores da amostra neste ensaio (Figura 6C) foi calculado como fortemente positivo em 0,829. Esses valores representam precisão sólida e reprodutibilidade para ambos os tipos de medição e, como era de se esperar, a nova e vantajosa estratégia de detecção de DLS otimiza o fator Z, mas a varredura espectral fornece uma faixa de separação suficiente para registrar resultados confiáveis (Z > 0,5). É importante notar que a pontuação DLS é uma leitura ortogonal coletada simultaneamente dentro do fluxo de trabalho CS-SINS, não exigindo preparação adicional de amostras. A maior diferença nos valores para as pontuações brutas do DLS explica um fator Z melhorado, mas as "pontuações" são interpretadas da mesma forma porque são normalizadas a partir dos valores brutos. Além disso, as leituras do DLS capturam tamanhos tridimensionais dos aglomerados de nanopartículas versus indicações indiretas de proximidade provenientes de deslocamento plasmônico e informações espectrais, o que pode fortalecer nossa compreensão da dinâmica do ensaio CS-SINS. Considerando a natureza baseada em placas e crítica em tempo de um ensaio HTP, buscamos aumentar a confiabilidade do ensaio com esses métodos.

Figura 1: Paradigma de desenvolvibilidade e coleta de dados CS-SINS. (A) O fluxo de trabalho típico desde uma campanha de descoberta até a seleção de candidatos é representado para anticorpos multiespecíficos neste diagrama. O processo de descoberta resulta em candidatos monoespecíficos para serem avaliados, seguidos pela verificação de vários pacotes de dados para restringir os monoespecíficos de interesse antes de combiná-los em formatos multiespecíficos. Pacotes de dados são repetidos ou expandidos para restringir candidatos principais até que o melhor candidato seja escolhido para desenvolvimento. Ensaios de menor rendimento são realizados no fluxo de trabalho atual quando um pequeno painel de moléculas é selecionado (caixas roxas). Os HTP CS-SINS podem ser realizados em todas as etapas do caminho, adicionando dados valiosos e melhorando o processo de seleção. (B) O resultado hipotético das propriedades coloidais para os 6 principais candidatos é mostrado para 2 possíveis caminhos: seleção de candidatos líderes com ensaios de baixo rendimento e seleção de candidatos líderes com HTP CS-SINS. Candidatos com comportamento desfavorável de solução são representados com um brilho. No primeiro cenário, metade dos candidatos líderes com base nas características ótimas de ligação das telas de descoberta apresentam comportamento pobre em alta concentração. No segundo cenário, apenas 1 candidato com estabilidade coloidal moderadamente baixa é incluído, pois os dados CS-SINS foram considerados em paralelo aos dados de ligação nas telas de descoberta inicial. No segundo cenário, a diversidade de candidatos viáveis é maior do que no primeiro cenário. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Fluxo de trabalho do ensaio SINS. Preparação e conjugação de nanopartículas de ouro: (1) O mAb capturado é trocado em tampão por acetato de potássio de 20 mM, pH 4,3, e diluído para 0,8 mg/mL. (2) Nanopartículas de ouro são concentradas a partir do estoque. (3) A poli-l-lisina é misturada com a captura trocada por buffer mAb. (4) Nanopartículas de ouro são incubadas com a poli-l-lisina e capturam mAb, sendo completamente misturadas. (5) Incubação do complexo CS-SINS durante a noite à temperatura ambiente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Fluxo de trabalho de Automação de Laboratório. Fluxo de trabalho de automação laboratorial: (1) Materiais e amostras são compilados para o método do manuseador de líquidos. Amostras dialisadas em Histidina de 10 mM, pH 6, são coletadas em tubos matriciais ou placas de 96 poços. As concentrações das amostras são formatadas em um arquivo de entrada do manipulador de líquidos. Nanopartículas complexas de ouro CS-SINS conjugadas para capturar mAb, ponteiras robóticas para manuseio de líquidos e plásticos são coletadas em preparação para o ensaio do manuseador de líquidos. (2) A placa de ensaio é preparada no manuseador de líquidos e incubada por 4 horas em temperatura ambiente. 3) No marcador de 4 horas, varreduras espectrais (leitura 1) são coletadas de poços de amostra com duração de 25 minutos; Após a marca de 4,5 horas, o espalhamento dinâmico da luz (leitura 2) coleta informações de tamanho de cada população de poços mais uniformes. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Programa de manuseador de líquidos e configuração de placas. (A) Ao iniciar o programa e após a inicialização do sistema, uma janela/prompt separado será aberto para selecionar o arquivo de entrada com os endereços designados do poço e concentrações da amostra. O número de amostras deve ser especificado a cada vez, mas o volume de 200 μL (o volume final dos reagentes mistos antes da estampagem de placas de 384 poços) permanece o mesmo. (B) Após clicar em continuar da janela anterior em (A), essa segunda janela aparecerá para confirmar as interpretações do arquivo de entrada à esquerda e os valores à direita. (C) Após confirmar as interpretações a partir de (B), essa terceira janela aparece com uma caixa de diálogo que verifica novamente a matemática para a concentração da amostra para normalização (o volume de 100 μL) até a placa final do poço profundo (o volume de 200 μL). (D) Esse layout vem da visão do Editor de Métodos do módulo de software de manipulação de líquidos. À esquerda, pontas padrão de 300 μL estão carregadas, e no centro do palco, 1 caixa de pontas de 50 μL e 3 caixas de pontas slim de 300 μL estão carregadas, compatíveis com robótica de manuseio de líquidos. Um tampão tampão é carregado na frente com 10 mM de Histidina, pH 6 (o tampão no qual as amostras foram diálises). As nanopartículas de ouro são divididas igualmente em 2 tubos de microcentrífuga e carregadas, sem tampas, na parte de trás do suporte de tubos à direita. A placa matricial com tubos de amostra é carregada na parte traseira do suporte na coluna 10. Após as amostras, são indicadas a placa de normalização (1), a placa de poço profundo com amostra de 11,1 μg/mL (2), a placa de poço de 200 μL de profundidade da amostra combinada e nanopartículas (3), e a placa formatada de 384 poços (4). (E) O layout do convés do manuseador de líquidos mostra a recuperação das pontas e a distribuição de amostras em tempo real e marca os poços a cada etapa avança. Aqui, todas as amostras (imagem de 96 poços na parte de trás do portador na^3ª coluna) estão acinzentadas, assim como a placa de normalização subsequente, o que indica que amostras foram adicionadas à placa de normalização a partir das placas matriciais de origem. Em verde, mostramos a cabeça de 8 canais após aspirar o tampão do canal e dispensá-lo na primeira coluna da placa de normalização durante a mistura. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Esquema de processamento de dados. O esquema de processamento de dados: (1) Os arquivos de dados brutos são enviados a um servidor interno. (2) Os arquivos de dados são lidos e processados por um script personalizado para ajustar a curva de varreduras espectrais, calcular o lambda max para réplicas do CS-SINS e avaliar populações multimodais por DLS. (3) Os dados são agrupados por réplicas, depois posteriormente mediados e normalizados para controles especificados; Mapas de placas correspondentes no portal do banco de dados são obtidos para vincular os resultados. (4) Todos os dados são organizados em um modelo pronto para ser enviado ao banco de dados, e gráficos são criados automaticamente para relatórios ELN. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 6: Dados representativos das leituras 1 e 2. (A) As pontuações normalizadas de deslocamento espectral foram plotadas por identificação PPB para amostras purificadas, de expressão bruta, e amostras controle onde indicado e separadas por uma linha pontilhada vertical, em um gráfico de barras para determinar a distribuição de barras de erro entre os tipos de amostras. A linha vermelha sólida indica o limite superior do ensaio, que corresponde ao controle positivo, enquanto a linha verde pontilhada marca o valor de corte para um perfil molecular de baixo risco para CS-SINS. (B) As pontuações DLS normalizadas foram plotadas pelo ID PPB para amostras purificadas, de expressão bruta e amostras controle, quando indicadas e separadas por uma linha pontilhada, em um gráfico de barras para determinar a distribuição de barras de erro entre os tipos de amostras. Alguns valores estão ausentes (como o^{segundo valor em} azul claro com pontuação acima da média em (A)) devido a varreduras multimodais da saída DLS, que o portal web do software de script determinou como inválida. A linha vermelha sólida indica o limite superior do ensaio, que corresponde ao controle positivo, enquanto a linha verde pontilhada marca o valor de corte para um perfil molecular de baixo risco para CS-SINS. (C) As pontuações médias normalizadas para os valores de deslocamento espectral e DLS foram comparadas por um gráfico de pontos de correlação, conforme mostrado (as pontuações de deslocamento espectral correspondem ao eixo Y e as pontuações DLS correspondem ao eixo X). O código de cores é coordenado apenas com as pontuações DLS. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1. Escores de estabilidade coloidal de amostras de anticorpos determinados por CS-SINS. A tabela resume identificadores de amostras, endereços de poços, classificações de amostras, pontuações espectrais normalizadas e pontuações de espalhamento dinâmico da luz (DLS) obtidas a partir do ensaio CS-SINS. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura suplementar 1: PLL melhorou a estabilidade do AuNP em 10 mM do tampão de His, pH 6, para CS-SINSs. Esta figura mostra a sobreposição próxima do mAb controle negativo vinculado ao complexo CS-SINS revestido com PLL e ao controle apenas de buffer, em contraste com nanopartículas de ouro não revestidas com o controle negativo mAb ou buffer isoladamente, que têm picos em faixas totalmente diferentes. Mostrados em azul estão os escaneamentos espectrais incrementais (realizados em incrementos de 1 nm no ponto de tempo de 4 horas) para AuNP conjugado incubado com 10 mM Seu buffer sobreposto com esferas conjugadas incubadas com o controle negativo (PPB-117487) na ausência de pré-incubação de poli-l-lisina. Mostram em vermelho os escaneamentos espectrais incrementais (realizados em incrementos de 1 nm no ponto de tempo de 4 horas) para AuNP conjugado incubado com 10 mM Seu buffer sobreposto com esferas conjugadas incubadas com o controle negativo (PPB-117487) após pré-incubação da poli-l-lisina. Cálculos lambda max para ambos os controles negativos na presença de PLL estão próximos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Configurações para DLS e seleção de placa de poço para o leitor de placas DLS. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Escores CS-SINS de ABS expressos em PEPP vs. purificados a jusante. (A) As pontuações normalizadas de deslocamento espectral foram plotadas por poço e identificação de placa para amostras PEPP (ex.: A1PL1 = poço A1 a partir da placa 1) expressando Ab64 e separadas por uma linha pontilhada vertical a partir do deslocamento espectral normalizado ou das pontuações DLS do Ab64 purificado a jusante, em um gráfico de barras para determinar a distribuição de barras de erro (desvio padrão) entre os tipos de amostras. A linha pontilhada verde marca o valor de corte para um perfil molecular de baixo risco para CS-SINS. (B) O AUC total e a distribuição na placa para todas as amostras dos experimentos realizados em (A) são representados aqui (codificados por cores para experimentos correspondentes). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Validação de placas de controle de ponta a ponta com 384 poços. (A) As pontuações espectrais médias normalizadas para amostras nas colunas iniciais da placa de 384 poços são plotadas e mostradas em vermelho, enquanto valores duplicados escaneados no final da placa de 384 poços são mostrados em verde-limão. Os valores replicados ficam lado a lado, variando do controle positivo (indicado com um sinal de mais ao lado do ID do PPB) até o controle negativo (indicado com um sinal de menos ao lado do ID do PPB). O valor do controle de buffer preparado pelo programa de manipulação de líquidos (independente do prompt de entrada da amostra) é mostrado em um padrão quadriculado. (B) As pontuações DLS médias normalizadas para amostras nas colunas iniciais da placa de 384 poços são plotadas e mostradas em vermelho, enquanto valores duplicados escaneados no final da placa de 384 poços são mostrados em verde-limão. Os valores replicados ficam lado a lado, variando do controle positivo (indicado com um sinal de mais ao lado do ID do PPB) até o controle negativo (indicado com um sinal de menos ao lado do ID do PPB). Não há valor de controle de buffer para a leitura do DLS (devido a leituras multimodais). (C) As pontuações espectrais médias normalizadas são plotadas em relação às pontuações DLS em um gráfico de pontos de correlação para amostras que vão desde as primeiras colunas da placa de 384 poços até o final da placa de 384 poços. A codificação por cores dos pontos de dados corresponde diretamente às médias normalizadas de varreduras espectrais. Como não há valor de controle de buffer para a leitura DLS (devido a leituras multimodais), apenas os 6 controles duplicados são comparados a partir de ambas as leituras neste gráfico. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 5: Os cálculos para a normalização dos escores espectrais ou escores DLS para permitir o relatórios e referenciamento universais entre usuários e dias. Valores positivos de controle são definidos para 1, enquanto controles negativos para 0, e altas pontuações estão associadas a um comportamento coloidal ruim. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo representa várias modificações importantes do método^{original CS-SINS 16}. Importante destacar que a razão otimizada PLL:IgG e o buffer de histidina foram mantidos a partir do estudo^{original 16}. Mais notavelmente, o ensaio foi adaptado para a plataforma robótica manuseadora de líquidos para permitir o processamento HTP (até 352 amostras em 1 dia contra ~20), reduzindo o tempo de trabalho prático e melhorando a reprodutibilidade por meio do manuseio automatizado de líquidos. O sistema robótico é compatível com formatos baseados em placas, incluindo estampagem em novos formatos como a placa de 384 poços, e vários tipos de material de laboratório. Os programas podem rodar de forma independente, e o fluxo de trabalho de ponta a ponta oferece uma leitura de alto volume com maior reprodutibilidade em um ambiente que limita a amostra. As medições DLS também foram incorporadas como uma leitura ortogonal do deslocamento espectral com um fator Z mais ótimo do que as interpretações de deslocamento espectral (0,998 contra 0,648), o que se mostra particularmente valioso para amostras com pontuações espectrais borderline ou desvios padrão altos, e descreve a interpretação do deslocamento do plasmon para aumentar a faixa dinâmica aparente apenas pela saída do leitor de placas. Sugere-se que laboratórios sem leitores de placas multimodo de alta qualidade disponíveis possam usar o DLS para executar CS-SINS de forma confiável. Para abordar a variabilidade potencial dependente do tempo em uma placa de 384 poços, foi realizada uma validação extensa da placa (Figura Suplementar 4) colocando controles tanto no início quanto no fim da placa, confirmando efeitos mínimos no tempo de varredura. Além disso, foi demonstrado que amostras brutas de PEPP produzem resultados comparáveis ao material purificado (Figura 6, Figura Suplementar 3A), expandindo a aplicabilidade do método para estágios anteriores de descoberta onde a proteína purificada não está disponível, o que não havia sido previamente relatado. Os dados na Figura Suplementar 3 apontam para a confiabilidade da amostra entre fontes, mas também indicam uma variabilidade mínima do ensaio de um dia para o outro, já que os dados foram coletados e normalizados a partir de diferentes conjuntos de dados. Mais especificamente, a Figura Suplementar 3B representa a área total sob a curva para todos os poços das respectivas placas experimentais (codificadas por cores para corresponder à placa do mesmo experimento na Figura Suplementar 3A) para demonstrar a variabilidade esperada, porém mínima, dentro do mesmo experimento e em dias diferentes com preparações distintas das contas. No estágio inicial de descoberta, métodos como kD-DLS e abordagens baseadas em colunas (SMAC, CIC) não são viáveis devido aos maiores requisitos de consumo de amostras e à incapacidade de processar material^bruto 12,13,24,25,26,27; O CS-SINS permite de forma única a triagem de estabilidade coloidal nessa etapa com apenas 6 μg por amostra, que pode ser purificada em 1 etapa. Por fim, o script de ajuste de curvas foi atualizado para acomodar o ajuste fino de pequenos deslocamentos lambda max e para permitir melhor tratamento de arquivos e relatórios automatizados de dados para bancos de dados internos.

Cenários comuns de solução de problemas incluem: (1) altos desvios padrão nas pontuações espectrais ou DLS, frequentemente indicando mistura incompleta de nanopartículas (passo 7.6) ou agregação de amostras – nesses casos, recomenda-se realizar uma verificação de controle de qualidade contra as amostras dialisadas pelo DLS para garantir a integridade após a diálise e o uso padrão de escores espectrais como leitura padrão; (2) distribuições multimodais de DLS ou falhas em leituras de DLS, tipicamente causadas por agregação pré-existente de amostras ou contaminação por poeira – filtração por filtros de 0,22 μm antes da diálise pode mitigar isso; (3) discrepâncias entre escores espectrais e DLS, que normalmente são atribuíveis a medições de DLS enviesadas (provavelmente devido à alta polidispersão, que apareceria dentro da faixa normal-alta pela pontuação espectral); (4) valores de controle positivo inconsistentes, geralmente resultantes de armazenamento inadequado de nanopartículas ou degradação do mAb de captura; alíquotas frescas armazenadas a -80 °C devem ser usadas para cada ensaio (não armazenadas a 4 °C por mais de alguns dias).

Algumas limitações do ensaio incluem a necessidade de tempo para diálisar as amostras completamente e preparar as nanopartículas conjugadas semi-manualmente no dia anterior ao ensaio; no entanto, o tempo de diálise é equivalente independentemente do tamanho do conjunto de amostras. No que diz respeito aos riscos de entupimento das pontas, as ponteiras de manuseio de líquidos monitoram as variações de pressão durante a aspiração, e erros relevantes podem aparecer durante a operação. Durante a fase de desenvolvimento do método, verificamos arquivos de log (e continuamos após o serviço) para garantir que os volumes esperados estejam sendo calculados pelo script. As funções de aliquotação foram testadas para as preparações concentradas das contas e não antecipam problemas. Reconhecemos a natureza sensível ao tempo do ensaio, a natureza dominada pelo Fab da avaliação e seu papel como ensaio substituto sem medir diretamente comportamentos coloidais como viscosidade e opalescência. No entanto, essa adaptação permite a caracterização eficiente de conjuntos de dados maiores mais cedo no processo de descoberta de medicamentos, servindo como uma poderosa ferramenta de triagem onde antes não existiam.

Várias etapas críticas desse protocolo exigem atenção cuidadosa para garantir resultados reprodutíveis. Primeiro, o ajuste preciso do pH durante a preparação do tampão (passos 1.1.1 e 1.2.1) é essencial, pois desvios além de ±0,1 unidades de pH podem afetar a estabilidade das nanopartículas e a eficiência da captura de anticorpos. O tampão de pH baixo usado para preparação de anticorpos de captura garante a conjugação ideal, e as condições de tampão especificadas foram otimizadas para estabilização de carga e ampla compatibilidade de anticorpos (tipicamente em contexto de formulação). O tampão de histidina de 10 mM, pH 6,0, proporciona interações eletrostáticas ótimas enquanto mantém a estabilidade proteica. Segundo, diálise completa com remoção completa do sal (passo 2.3) é crucial; Diálise incompleta pode interferir nas interações eletrostáticas durante a montagem de nanopartículas. Terceiro, a etapa de concentração de nanopartículas de ouro (etapas do protocolo 5.1–5.3) deve ser realizada cuidadosamente para evitar perturbar o pellet, pois concentrações inconsistentes das nanopartículas impactam diretamente a sensibilidade do ensaio. Quarto, a razão PLL:captura mAb de 0,03 (passo 4,1) é otimizada para a máxima cobertura superficial, mantendo uma janela de deslocamento plasmônica suficiente, conforme estabelecido^{anteriormente 16}. Com relação à dinâmica do manuseio de líquidos, pontas de detecção de líquidos foram utilizadas para realizar normalizações e mistura de placas até que as nanopartículas de ouro sejam introduzidas, que não são medidas de forma confiável em solução (e, portanto, ajustam os volumes de dispensação para quantidades padrão). A detecção de líquidos a montante permite que o operador identifique problemas de desalinhamento das placas ou amostras ausentes, enquanto a etapa de estampagem de 384 poços identifica problemas de alinhamento Z. Por fim, a observância rigorosa do tempo de incubação de 4 horas (passos do protocolo 7.10–7.12) e a leitura consistente da placa do início ao fim (independentemente de uma placa incompleta) é crítica, pois o deslocamento plasmônico e o agrupamento de nanopartículas são fenômenos dependentes do tempo; atrasos ou leituras precoces podem levar a escores CS-SINS imprecisos, enquanto a leitura completa da placa garante consistência dos escores ao longo dos dias no formato HTP.

À medida que a estabilidade coloidal de anticorpos multiespecíficos é cada vez mais investigada, os grandes conjuntos de dados fornecidos por ensaios biofísicos HTP como o CS-SINS têm potencial para alimentar modelos de IA/ML para melhor compreender os efeitos combinatórios na estabilidade molecular. Estudos mostraram que, à medida que a diversidade de sequências aumenta, a necessidade de conjuntos de dados maiores aumenta para melhorar a precisão dos resultados de IA/^ML 41,42,43. Propriedades e descritores moleculares para monoespecíficos podem mudar quando reformatados para biespecíficos ou triespecíficos, considerando toda a distribuição e equilíbrio de carga molecular em vez de considerações específicas de sequência ou motivo para atributos como passividades de degradação^química 17,18,19,20,21,22 . Notavelmente, características estruturais como áreas eletrostáticas previstas, hidrofobicidade e área superficial acessível por solvente podem melhorar as previsões de agregação e estabilidade independentemente das características específicas de sequência, tornando vários conjuntos de dados menores compatíveis com a preparação da previsão 17,18,19,20,21,22. A simplicidade da pontuação CS-SINS como referência à culminação representativa do perfil biofísico de uma molécula torna o ensaio adequado para o treinamento de modelos de IA/ML.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5.0 mL, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Goat antihuman Fcγ-specific antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Gold nanoparticles (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 mL Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidine hydrochloride buffer sample (10 mM, pH = 6.0, sample and assay buffer)	Sigma	H8125; H6034	Prepare final concentration of 5 mM per reagent in ultra-pure water, adjust pH to 6.0, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Matrix ScrewTop Tubes sample (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 or MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 kDa, 96 pcs. in deep well plate (12 cartridges), sealing sheet) and dialysis reservoir/box (low volume dialysis cassettes)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Microcentrifuge tubes pure polypropylene (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	Prepare a 5 mg/mL stock solution in ultra-pure water
Positive and negative Controls (1 mg/mL dialyzed into 10 mM Histidine, pH 6)	Internally-produced commercial antibodies	N/A	~2 nm spectral shift and DLS size of 250-300 nm for positive control; negligible spectral shift and DLS size comparable to buffer only control
Potassium acetate buffer capture (20 mM, pH = 4.3, mAb conjugation buffer)	Fisher Scientific	P171-500	Prepare final concentration of 10 mM reagent in ultra-pure water, adjust pH to 4.3 with acetic acid, adjust final volume with ultra-pure water, and filter with 0.22 μm filter
Zeba desalting columns (2 mL, 5 mL, or 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893