Análise Comparativa da Estrutura de RNA de Transcritos Nascentes e Maduros em Saccharomyces cerevisiae

Summary

A estrutura secundária do RNA tem sido observada principalmente em RNA maduro com métodos de sondagem estrutural. O sequenciamento co-transcricional de Rastreamento de Estruturas (CoSTseq) unifica o funcionamento nuclear, que tem sido usado para estudar a posição da polimerase em RNA nascente, com sondagem estrutural. Assim, o CoSTseq permite a observação da estrutura secundária do RNA em RNA sob transcrição ativa.

Abstract

Durante a transcrição, o RNA nascente começa a se formar em pareamento de bases ao sair das RNA polimerases (Pols). Esse pareamento de bases permite a formação de estruturas de RNA que influenciam criticamente a expressão gênica no nível do processamento, tradução e estabilidade do RNA. Métodos estabelecidos para estudar a estrutura secundária do RNA são limitados a transcritos maduros, enquanto pouco se sabe sobre estados de dobramento. Além disso, a abundância relativamente menor (< 1%) e a natureza transitória do RNA nascente complicam seu isolamento e caracterização. O Acompanhamento de Estrutura Co-Transcricional (CoSTseq) utiliza o processo transcricional contínuo com sondagem biotina-NTP e sulfato de dimetil (DMS) para adquirir simultaneamente a posição Pol e o status de pareamento de bases de transcritos nascentes. Em Saccharomyces cerevisiae, o CoSTseq fornece a sequência e informações estruturais próximas à extremidade 3' dos RNAs nascentes transcritos por qualquer um dos três polos de RNA. Durante o episódio transcricional, a biotina-NTP incorporada no local ativo efetivamente trava os Pols. Depois, o tratamento com DMS metila nucleotídeos A, C e U desparelhados. O enriquecimento subsequente de biotina e a síntese de cDNA com uma transcriptase reversa com troca de template permitem o sequenciamento de extremidades pareadas e o cálculo das reatividades do DMS em função da posição Pol. O CoSTseq é facilmente realizado lado a lado com a sondagem DMS (DMS-MaPseq), permitindo também a captura do transcrito maduro dobrado. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para CoSTseq paralelo e DMS-MaPseq, incluindo o processo transcricional, preparação de bibliotecas e análise de dados.

Introduction

O RNA pode se dobrar em estruturas secundárias e terciárias devido ao pareamento de bases dentro das moléculas de RNA, e essas estruturas podem ainda ser influenciadas por proteínas que atuam como chaperonas para guiar o dobramento do^{RNA 1}. A estrutura do RNA pode ser altamente dinâmica, onde os RNAs celulares podem se conformar a uma variedade de estruturas definidas pela paisagem termodinâmica para gerar conjuntos de possíveis conformações^{de RNA 2}. Mudanças conformacionais dinâmicas têm potencial para afetar a regulação e expressão^{gênica 3,4}. Por outro lado, o RNA também pode adotar estruturas altamente favorecidas que estão intimamente relacionadas à sua função, como tRNAs, pequenos RNAs nucleares e rRNA. Embora esses exemplos destaquem RNAs maduros com fortes papéis regulatórios, etapas de processamento de RNA eucariótico frequentemente ocorrem em conjunto com a transcrição, incluindo o pré-spalming de mRNA, clivagem na extremidade 3' e modificação de RNA. Da mesma forma, o dobramento do RNA pode ocorrer antes da maturação do transcrito, como discutido em outro^{lugar 5}.

Embora a sequência de RNA possa codificar a estrutura secundária, a determinação precisa frequentemente requer validação experimental in vitro ou in vivo. O advento de técnicas específicas de modificação química estrutural, como DMS-MaPseq (perfil mutacional de sulfato de dimetil com sequenciamento), abriu caminho para determinar a estrutura secundária do RNA celular a partir de células^{vivas 6}. O DMS é introduzido nas células e metila especificamente as faces de pareamento de bases Watson-Crick da adenosina, citosina e, em menor grau, uridina, que são acessíveis apenas quando não emparelhadas. Após modificação por DMS, uma transcriptase reversa de alta fidelidade e altamente processiva, como a Transcriptase Reversa de Introns do Grupo II Termostable (TGIRT⁾⁷, pode ser usada para recodificar bases modificadas como mutações na biblioteca final preparada de cDNA. Essas mutações podem então ser usadas para inferir a acessibilidade do RNA no nível dos nucleotídeos. Embora seja uma técnica poderosa, o DMS-MaPseq e métodos relacionados têm sido usados principalmente para estudar RNA maduro que já está totalmente^{dobrado 6}.

Diversos métodos foram desenvolvidos para estudar a regulação e o processamento de RNA nascente. O sequenciamento global de run-on (GROseq) foi desenvolvido para superar as limitações do RNA-seq, que permite a medição em estado estacionário dos níveis de RNA nas células e, assim, fornece informações que fazem a média entre processos de transcrição, processamento de RNA e degradação que afetam os níveis de RNA. O GROseq utilizou bromouridina para o uso de núcleo contínuo, onde uma RNA Polimerase (Pol) poderia adicionar nucleotídeos ao RNA nascente com resolução de dezenas de bases⁸. O sequenciamento de precisão com execução (PROseq) foi construído com base nessa metodologia para mapear pols de RNA em RNA nascente com resolução de par de bases, utilizando biotin-NTPs. Aqui, um NTP biotinilado é adicionado onde Pol foi detectado pela última vez na extremidade 3' do^{RNA 9} recém-sintetizado.

Recentemente, Schärfen et al. desenvolveram e utilizaram o Co-transcriptional Structure Tracking (CoSTseq), que utiliza e adapta o run-on da biotina e a sondagem DMS para permitir a determinação da estrutura de RNA de transcritos nascentes em S. cerevisiae¹⁰. O CoSTseq permite a determinação da estrutura secundária do RNA durante a transcrição ativa; esse protocolo detalha como o funcionamento nuclear é combinado com a sondagem DMS durante os experimentos CoSTseq. Considerando que o CoSTseq exige manuseio cuidadoso durante a preparação da amostra, bem como atenção cuidadosa à qualidade dos dados ao prosseguir com a análise CoSTseq, este protocolo detalha as melhores práticas para gerar bibliotecas adequadas para sequenciamento pareado na plataforma Illumina. O protocolo CoSTseq simultaneamente produz RNA nascente e maduro, sendo este último analisado como um conjunto de dados DMS-MaPseq para proporcionar uma comparação rigorosa entre RNA nascente e maduro (Figura 1). Experimentalmente, é necessário acesso a reagentes necessários para manter culturas de levedura e conduzir o processo de continuação nuclear e sondagem DMS, conforme detalhado no protocolo abaixo. O rendimento de RNA nascente é fundamental para o sucesso da preparação de bibliotecas e análise de dados do CoSTseq; assim, condições de crescimento estabelecidas por incubadoras e meios de cultivo adequados são críticas para garantir material inicial suficiente. Por fim, para realizar uma análise computacional dos dados CoSTseq, o acesso a um cluster de Computação de Alto Desempenho (HPC) é ideal.

Figura 1: Visão geral da preparação combinada de bibliotecas CoSTseq e DMS-MaPseq a partir da mesma amostra biológica. (A) A permeabilização da parede celular da levedura e da membrana nuclear com sarcosil permite a incorporação de biotina-NTP na extremidade 3' do RNA nascente durante uma reação nuclear de continuação. (B) O DMS metila resíduos A e C despareados (às vezes U) em RNA nascente e maduro na célula permeabilizada, e o RNA total é obtido por extração de fenol/clorofórmio. O RNA nascente é então purificado do RNA total por esferas magnéticas conjugadas com estreptavidina; A extração com TRIzol libera o RNA nascente das esferas. Paralelamente, o sobrenadante de esferas contendo mRNAs poliadenilados pode ser precipitado por EtOH; a partir desse material, o mRNA pode ser isolado por pulldown da esfera oligo(dT). Os mRNAs Poly A+ são fragmentados antes da preparação da biblioteca. (C) Uma transcriptase reversa com troca de template é usada para gerar separadamente cDNA a partir de RNA nascente ou maduro, seguida pela ligação de adaptadores 5' e 3' para introduzir um UMI N₇ e códigos de barras ( veja a Figura 2 para detalhes do CoSTseq). Note que as etapas de transcrição reversa DMS-MaPseq e CoSTseq usarão adaptadores heteroduplex distintos com saliências complementares à biotina-NTP usada em CoSTseq e saliências N usadas em DMS-MaPseq. Ciclos mínimos de PCR são usados para amplificação para limitar o viés na biblioteca, e a seleção de tamanho é aplicada para remover dímeros adaptadores. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Protocol

NOTA: Antes de começar, certifique-se de que todos os buffers listados na Tabela 1 estejam preparados. Todos os reagentes devem ser preparados em água sem nuclease. A esterilização por filtro dos tampões é recomendada ao usar produtos químicos/reagentes de grau não biologico molecular para preparação do tampão. Para as seções 1 a 4, prepare o seguinte com antecedência:

1. Preparação de materiais e reagentes

1. Prepare uma solução de sarkosyl (v/v) a 10% com pelo menos 1 dia de antecedência para permitir tempo suficiente para a dissolução completa. Esterilize a solução homogênea com filtro de 0,22 μm. No dia do experimento, use o sarkosil a 10% para fazer uma solução de sarkosil a 0,5% e deixe no gelo até o uso.
2. Pré-resfrie as ultracentrífugas a 4 °C. Na exaustor, ajuste o termomisturador para 30 °C e pré-aqueça uma alíquota de 2,5x do buffer de sondagem estrutural. Esse termomisturador será usado posteriormente para tratamento com DMS.
3. Na exaustor, ajuste um bloco de calor para 65 °C e aqueça 650 μL de fenol ácido: clorofórmio por reação para extração de RNA.
4. Misture DTT com buffer de transcrição 2,5x até uma concentração final de 2 mM. Prepare e pré-resfrie frescamente as soluções de têmpera e lave para uso imediato após o tratamento DMS (veja a Tabela 1).
5. Aliquota 40 μL de SDS 20% em tubos para lise de levedura antes da extração de RNA. Prepare uma solução de 100 mM de Cloreto de Zinco (ZnCl2) e esterilize com filtro antes do uso.
6. Gerar cepas de levedura de deleção, depleção ou knock-in que possam ser necessárias para responder a quaisquer questões específicas de pesquisa sobre o emparelhamento de bases de RNA nascente em comparação com a cepa selvagem de levedura geminga. Sempre reviva as cepas frescas fazendo estrias em uma placa de ágar de levedura apropriada (DPY, dropout ou placas antibióticas). Comece uma cultura líquida a partir de uma única colônia no dia anterior ao início do experimento. Para mais instruções sobre crescimento e manipulação de cepas de levedura, consulte Schärfen et al., 2025.

2. Preparação de células de levedura para CoSTseq

1. Montagem de uma pré-cultura: Cultive a cepa BY4741 de S. cerevisiae em 50 mL de meio YPAD até que as células atinjam a fase logaritarithípica média (Densidade Óptica (OD) a 600 nm = 0,6) a 30 °C com agitação a 200 rpm. Se necessário, dilua a cultura para 0,2-0,3 e permita que a levedura atinja 0,6 OD.
2. Colheita de levedura: Colete e centrifuge 1,8 OD (~3 mL) de fermento a 2.500 x g por 3 minutos em uma centrífuga pré-resfriada (4 °C). Descarte o sobrenadante em um recipiente de resíduos. Lave o pellet ressuspendendo 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a frio. Gire novamente a 2.500 x g por 3 minutos a 4 °C. Descarte o sobrenadante e mantenha o pellet de levedura no gelo.
3. Permeabilização das células de levedura: Suspenda cuidadosamente o pellet de levedura em 10 mL de sarcosil frio 0,5%. Use um pipetador P1000 para resuspender as células e evite criar bolhas. Incube no gelo por 20 minutos para promover a permeabilização. Faça pellets nas células permeáveis do fermento a 400 x g por 5 minutos a 4 °C. Resuspenda as células permeabilizadas da levedura em 100 μL de água livre de nuclease.

NOTA: Embora a marcação de DMS não exija permeabilização da parede celular, a reação nuclear contínua exige permeabilização para que nucleotídeos biotinilados alcancem o local da transcrição. Isso é alcançado por meio do tratamento com sarkosil, que permeabiliza tanto a parede celular da levedura quanto sua membrana nuclear. Além disso, o tratamento com sarkosil facilita o ensaio contínuo ao prevenir novos eventos de iniciação de transcrição e desalojar fatores negativos de alongamento do Pol II e da^{cromatina 11,12}. Manuseie delicadamente as amostras e mantenha uma baixa velocidade centrífuga (400 x g) para evitar a ruptura celular e promover a incorporação bem-sucedida da biotina em transcritos nascentes^{alongados 13}.

3. Operação nuclear e sondagem DMS

NOTA: O uso de resíduos nucleares com biotina-NTP introduz impedimentos estéricos que impedem os pols de RNA em seu local ativo e fornecem um controle de biotina para o enriquecimento seletivo do RNA nascente. Dependendo da resolução desejada, um run-on nuclear pode ser realizado usando um, dois ou todos os quatro ribonucleotídeos biotinilados⁹. Para maior custo-benefício, o fluxo de trabalho descrito aqui utiliza apenas um nucleotídeo biotinilado (ou seja, biotina-CTP).

1. Preparando a reação nuclear de corrida
   1. Prepare solução de trabalho para buffer de transcrição 2,5x com 5 mM de DTT recém-adicionado e pré-aqueça o buffer de sondagem estrutural 2,5x a 30 °C (veja a Tabela 1).
   2. Em um tubo limpo de 2 mL, adicione 120 μL de buffer de transcrição 2,5x, 3,75 μL de 10 mM ATP, 3,75 μL de 10 mM GTP, 3,75 μL de 10 mM UTP, 7,5 μL de 1 mM Bio-CTP, 15 μL de 10% sarcosil e eleve o volume para 200 μL com 46,25 μL de água livre de nuclease.
   3. Adicione 100 μL de células ao tubo e incube em um termomisturador ajustado a 30 °C por 2 minutos, agitando a 500 rpm.
      NOTA: Esta etapa é altamente urgente. Tente limitar o número de amostras para gerar dados confiáveis. É boa prática escalonar o tempo entre as amostras para garantir consistência.
2. Tratamento DMS: Após a incubação concluída, adicione rapidamente 200 μL de buffer de sondagem estrutural 2,5x pré-aquecido e 25 μL de reagente DMS ao tubo simultaneamente. Faça vórtice suavemente em duas pulsações e continue incubando no termomisturador por 4 minutos a 30 °C enquanto agita a 500 rpm. Espaça 30 segundos entre as amostras para ser consistente.
   NOTA: A sondagem DMS é uma reação instantânea que permite alta resolução^{temporal 14} do status de pareamento de bases de RNA. Para evitar modificações contínuas do DMS, é fundamental temperar prontamente a rotulagem do DMS usando o agente redutor forte β-mercaptoetanol. Além disso, qualquer DMS remanescente dificultará a recuperação do RNA na extração. A adição de álcool isoamílico saturado em água antes da centrifugação pode remover DMS insolúvel residual na célula¹⁵. Essa etapa é altamente urgente. É essencial trabalhar com um número limitado de amostras para gerar dados confiáveis.
   ATENÇÃO: DMS é um líquido altamente tóxico e incolor, com um leve odor semelhante ao de cebola. Precauções extremas são necessárias ao trabalhar com o DMS. O contato direto e/ou a inalação de vapores pode causar necrose nos olhos, na boca e nas vias respiratórias, incluindo danos severos aos órgãos. Use óculos de proteção, jaleco e luvas adequadas. Use luvas duplas sempre que possível e troque as luvas imediatamente após a exposição ou após o uso do DMS. Realize etapas envolvendo DMS sob uma exaustão. Use recipientes dedicados para resíduos para descarte por DMS.
3. Têmpera e lavagem
   1. Prepare os buffers de parada e lavagem com antecedência, conforme mencionado na Tabela 1 , e coloque no gelo até o uso. Pare a metilação do DMS adicionando 1 mL de buffer de parada.
   2. Centrifuge as amostras marcadas com DMS por 5 minutos a 3.500 x g em uma centrífuga pré-resfriada. Descarte o lixo em um recipiente apropriado.
   3. Adicione 1 mL de buffer de lavagem ao pellet e resuspenda. Repita o passo 3.3.2. Prossiga imediatamente para a extração de RNA. Não congele o pellet de levedura.
4. Extração de fenol clorofórmio
   1. Ressuspenda a levedura marcada com DMS em 600 μL de tampão de lise de RNA, depois transfira a suspensão para tubos contendo 40 μL de 20% de SDS. Incube a 65 °C por 30 segundos com tremores a 950 rpm.
   2. Adicione 650 μL de fenol:clorofórmio ácido pré-aquecido ao lisado de levedura e continue aquecendo no termomisturador por 2 minutos a 65 °C, agitando a 950 rpm. Deixe as amostras no gelo por 5 minutos.
      NOTA: Enquanto isso, troque o bloco de aquecimento ou termomisturador para temperatura ambiente (RT).
   3. Centrifuge a 20.000 x g por 3 minutos em RT.
   4. Mova a camada superior para um novo tubo e adicione 650 μL de clorofórmio. Vórtice brevemente. Centrifuge novamente e colete a camada superior em um novo tubo contendo 700 μL de isopropanol.
   5. Inverta para misturar e incubar no freezer a -20 °C por 30 minutos, permitindo que o RNA precipite. Centrifuge a 20.000 x g por 45 min a 4 °C. Descarte o supernadante. Lave o pellet com 750 μL de etanol a 75% (EtOH).
      NOTA: Este é um ponto de parada/pausa no protocolo. As amostras podem ser deixadas em 75% de EtOH durante a noite a -80 °C.
   6. Gire por 3 minutos a 20.000 x g e descarte o sobrenadante. Seque o pellet de RNA ao ar e dissolva-o em 81 μL de água sem nuclease. Quantifique o rendimento do RNA usando um espectrofotômetro ajustado para um comprimento de onda de 260 nm. Aplique 1 μL da ressuspensão acima para medir. Dilua a amostra de RNA se necessário. Pelo menos 80 μg de RNA total devem estar presentes para prosseguir para a próxima etapa.
      NOTA: Se necessário, o RNA marcado por DMS pode ser armazenado a -80 °C por até 2 semanas.

4. RNA Nascente (CoSTseq)

NOTA: O RNA total obtido da extração de fenol: clorofórmio contém RNAs maduros marcados com DMS, bem como RNAs biotinilados emergentes marcados por DMS provenientes das três polimerases. Para purificar os RNAs nascentes do RNA total, os seguintes passos usarão esferas de estreptavidina para enriquecer o RNA biotinilado nascente. Devido à forte afinidade da biotina com a estreptavidina (K_d = ^10-14 - ^10-15 M), duas extrações consecutivas de reagentes de RNA (ver Tabela de Materiais) são realizadas para eluir o RNA das esferas de estreptavidina. Note que menos de 1% do RNA da levedura é RNA nascente, dependendo da condição^{de crescimento 16}.

1. Puxão de biotina
   1. Preparação de esferas magnéticas de estreptavidina
      1. Prepare o tampão de pré-lavagem A e o tampão de pré-lavagem B, conforme mostrado na Tabela 1 , para composição. Homogeneize esferas magnéticas de estreptavidina por meio de vórtice. Obtenha 44 μL de esferas magnéticas homogeneizadas por amostra de 80 μg de RNA total.
         NOTA: Aumente a escala multiplicando o volume pelo número de amostras.
      2. Coloque as esferas magnéticas no suporte magnético e remova a solução de armazenamento. Ressuspenda as esferas magnéticas em 1 mL de buffer pré-lavado A.
      3. Incube por 2 minutos em temperatura ambiente. Magnetize e remova o sobrenadante. Repita a lavagem. Lave 1x com 1 mL de pré-lavagem B. Magnetize e remova o sobrenadante, e rapidamente prossiga para a etapa de fixação e lavagem.
   2. Encadernação e lavagem
      1. Prepare os buffers de lavagem de 2x binding buffer, 1x binding buffer, high salt e low salt wash como mostrado na Tabela 1.
      2. Resuspenda as esferas pré-lavadas adicionando o dobro do volume original (88 μL) do buffer de ligação 2x. Transfira 80 μL de esferas para um tubo estéril de 1,5 mL contendo 80 μL da amostra de RNA biotinilada.
      3. Gire a mistura de esferas e amostra em um rotador por 20 minutos em temperatura ambiente. Colete o RNA maduro contendo fluxo contínuo pelo estágio magnético (prossiga para a etapa de precipitação).
      4. Enxágue o complexo de RNA esfero-nascente com 500 μL de tampão de alto teor de sal 2x. Realize um enxágue com 500 μL de ligação 1x, seguido de um enxágue com 500 μL de tampão com baixo teor de sal.
2. Elução por meio da extração de reagentes de RNA
   1. Pré-aqueça um termomisturador a 60 °C. Resfrie uma centrífuga capaz de atingir uma velocidade de 20.000 x g a 4 °C.
   2. Adicione 300 μL de reagente de RNA (veja Tabela de Materiais) ao complexo de RNA esfera-nascente e resuspenda-se. Incube em um termomisturador por 5 minutos ajustado a 60 °C.
   3. Adicione 60 μL de clorofórmio, vórtice e incube por 3 minutos em RT. Centrifuge a 14.000 x g por 5 minutos em uma centrífuga pré-resfriada.
   4. Mova a fase aquosa superior para um novo tubo de coleta (~180 μL). Descarte a fase orgânica, deixando para trás as contas e a fase aquosa restante.
   5. Repita a extração para alcançar um volume final de 360 μL de fase aquosa no tubo de coleta.
   6. Adicione 360 μL de clorofórmio ao tubo de coleta e ao vórtice brevemente. Gire a 14.000 x g por 5 minutos em uma centrífuga pré-resfriada.
   7. Transferir (aproximadamente 350 μL) da camada superior para um tubo novo. Precipite o RNA adicionando 900 μL de EtOH absoluto e 1 μL de coprecipitante.
   8. Vórtice brevemente e permite que a precipitação ocorra a -20 °C por 20 minutos ou -80 °C durante a noite.
   9. Na centrífuga pré-resfriada, centrifuge a 20.000 x g por 20 minutos. Descarte cuidadosamente o sobrenadante.
   10. Lave o pellet com 750 μL de 75% de EtOH, seguido de outra centrifugação a frio a 20.000 x g por 5 minutos.
   11. Seque o pellet para remover o EtOH residual por 10 minutos. Dissolva o pellet de RNA em 3,75 μL de_H2O.
       NOTA: A aplicação por borrão do RNA eluido, seguida de sondagem com o conjugado estreptavidina-HRP, é o método mais eficaz para avaliar a redução da biotina. No entanto, essa abordagem consome uma quantidade substancial do material de amostra, deixando material insuficiente para a preparação da biblioteca.
3. Precipitação do sobrenadante
   1. Precipite o sobrenadante contendo RNAs maduros adicionando 2,5-3 volumes de EtOH. Permitir que a precipitação ocorra a -20 °C por 1 hora.
   2. Em uma centrífuga pré-resfriada, gire por 45 minutos a 20.000 x g. Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
   3. Lave o pellet de RNA com 0,5 mL de 75% de EtOH. Seque e dissolva o pellet em 50 μL de água sem nuclease. Coloque o tubo sobre um bloco térmico a 65 °C para melhorar a dissolução do pellet de RNA.
   4. Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro para as etapas seguintes.

5. RNA maduro (DMS-MaPseq)

1. Seleção Poly A
   NOTA: Os RNAs maduros poliadenilados são purificados usando captura de afinidade baseada em esferas oligo(dT). Este protocolo é otimizado para usar o Kit de Purificação mRNA DIRECT da Dynabeads (veja Tabela de Materiais). Como preparação inicial, pré-aqueça 1 mL de água sem nuclease a 80 °C para elução e ajuste um bloco de calor a 70 °C.
   1. Preparação de RNA para pulldown de poli A: Transfira 50 μg de RNA precipitado e eleve-o até um volume final de 300 μL com água livre de nuclease. Aqueça o RNA a 70 °C por 2 minutos para desorganizar estruturas secundárias e coloque-o imediatamente no gelo. Misture o RNA com 300 μL de tampão de lise/ligação e vórtice brevemente.
   2. Preparação das esferas magnéticas: Coloque as esferas magnéticas em suspensão por meio de vórtices por pelo menos 30 segundos. Transfira 100 μL de esferas suspensas por amostra para um tubo estéril de 1,5 mL. Magnetize para descartar o buffer de armazenamento. Enxágue as esferas magnéticas em volume igual de tampão de lise/ligação, magnetize e descarte o sobrenadante.
   3. Encadernação e lavagem
      1. Adicione os 100 μL de esferas pré-lavadas aos 600 μL de RNA da amostra preparada. Gire continuamente em um rotador por 5 minutos em temperatura ambiente.
      2. Recolha as contas colocando-as em um suporte magnético e descarte o fluxo de água. Lave as esferas com 600 μL de buffer de lavagem A. Pipete para misturar.
      3. Recolha as contas novamente para descartar a lavagem. Lave as esferas com 300 μL de buffer de lavagem B. Pipete para misturar.
      4. Recolha as contas novamente para descartar a lavagem. Misture as esferas com 90 μL de água morna (80 °C) e permita a ligação adicionando 90 μL de tampão de lise/ligação. Repita o passo 5.1.3.1-5.1.3.3.
   4. Elução: Resuspenda as esferas em 30 μL de água morna (80 °C) livre de nuclease. Incube entre 75 °C e 80 °C por 2 minutos. Submeta as esferas rapidamente a um campo magnético e colete o eluato em um tubo livre de RNase. Repita a elução e colete o RNA eluído.
2. Fragmentação
   NOTA: A fragmentação dos mRNAs pode ser alcançada por meios enzimáticos ou químicos. Aqui, cloreto de zinco e calor são usados para fragmentação. Ao contrário das enzimas que requerem uma sequência específica ou elementos estruturais, íons de zinco atuam como um ácido de Lewis para ativar o oxigênio 2' (um nucleófilo) e clivar a espinha dorsal fosfodièster. Isso resulta na formação dos ésteres fosfatados cíclicos 5' OH e 2',3' nas cadeias de^{RNA 17} do produto.
   1. Pré-aqueça o termociclador com a temperatura do bloco ajustada a 94 °C e a tampa ajustada a 105 °C. Coloque 54 μL de mRNA eluído em um tubo de PCR.
   2. Adicione 6 μL de solução de cloreto de zinco de 100 mM (concentração final de 10 mM), o vórtice por 2 s e imediatamente incube a 94 °C por 55 s no termociclador pré-aquecido.
   3. Ao final da incubação, tempere a reação de fragmentação com 6,6 μL de 0,5 M EDTA (concentração final de 50 mM), pipete para cima e para baixo para misturar e coloque rapidamente os tubos no gelo. Transfira o conteúdo para tubos estéreis de 1,5 mL.
   4. Permitir a precipitação dos mRNAs fragmentados com a adição de 150 μL de isopropanol, 15 μL de acetato de sódio 3M, pH 5,2 e 1 μL de co-precipitante.
   5. Coloque a -20 °C por 30 minutos. Gire a 20.000 x g por 45 minutos em uma centrífuga pré-resfriada. Lave o pellet com 75% de EtOH e dissolva-o em 15 μL de água sem nuclease.
3. Tratamento PNK
   NOTA: A fragmentação química com_{ZnCl 2} gera extremidades 5' e 3' inadequadas para a ligação¹⁷. Assim, após a fragmentação química, os RNAs são submetidos ao tratamento com Polinucleotídeo Quinase (PNK), que fosforila as extremidades 5' OH e desfosforila as extremidades fosfato 3', que podem então ser ligadas aos adaptadores¹⁸.
   1. Adicione 1 μL de inibidor de ribonuclease, 2 μL de 10x PNK Buffer e 2 μL de T4 PNK. Incube a 37 °C por 60 minutos. Interrompa a reação adicionando 30 μL de água livre de nuclease, 50 μL de tampão de ligação ao RNA e 50 μL de EtOH.
   2. Use um método de purificação de RNA baseado em coluna de spin para remover contaminantes e concentrar o RNA. Isso pode ser feito usando um kit comercialmente disponível (kit de limpeza e concentrador de RNA, veja Tabela de Materiais). Resumindo, misture dois volumes de buffer de ligação de RNA com 1 volume de amostra, misture um volume igual dessa mistura com 100% de EtOH e coloque na coluna de spin com um tubo de coleta novo. Gire essa amostra e descarte o fluxo. Lave a coluna de spin com 700 μL de tampão de lavagem de RNA e uma vez com 400 μL de tampão de lavagem de RNA. Descarte o fluxo de fluxo. Gire a coluna vazia por 1 minuto para garantir a remoção completa do buffer de lavagem.
   3. Eluva o RNA em 10 μL de água morna sem nuclease.
      NOTA: Execute todos os passos de centrifugação a 10.000 - 16.000 x g em RT por 30 segundos.

6. Reação de transcrição reversa com troca de template

NOTA: Os RNAs nascentes provenientes da redução da biotina (passo 4.2) e do mRNA fragmentado após o tratamento com PNK (passo 5.3) são submetidos às seguintes etapas para preparação da biblioteca ( Ver Figura 1 e Figura 2). Resumidamente, será preparado um molde sintético de RNA/duplex inicial de estridente de DNA (adaptador heteroduplex R2 RNA/DNA) no qual a troca de molde pode ocorrer. Esse heteroduplex fornece uma sequência complementar curta que permite a troca de templates pela transcriptase reversa (RT) para trocar de fias, quando a RT troca as fitas do RNA para o primer de DNA, possibilitando assim a síntese contínua de cDNA do RNA para a sequência adaptadora. A transcriptase reversa induro é usada aqui, que foi testada e otimizada para esse protocolo. Outras transcriptases reversas com troca de template podem ser usadas para a preparação da biblioteca CoSTseq, se desejado, mas exigem otimização pelo usuário.

1. Sequências adaptadoras heteroduplex de DNA/RNA
   NOTA: Os adaptadores heteroduplex de DNA/RNA usados para transcrição reversa da amostra DMS-MaPseq são os mesmos listados em Xu et ^al.7 e referenciados por Schärfen et ^al.10.
   1. Para o adaptador heteroduplex DNA/RNA que será usado para transcrição reversa da amostra CoSTseq, use um adaptador com um 'G' na região de saliência. Isso permitirá que G capture a biotina-C na extremidade 3' do RNA. Se estiver usando um NTP biotinilado diferente, edite o primer de DNA heteroduplex para ter o nucleotídeo de pareamento apropriado como saliência (Veja a Tabela 2).
   2. Para o adaptador DMS-MaPseq, certifique-se de que haja um único N sobressalto, dado que a extremidade 3' será aleatória após fragmentação. Para uma visão geral das seguintes etapas de preparação da biblioteca, veja a Figura 2.
2. Preparação do híbrido DNA/RNA para troca de molhetes: Prepare 1 μM de espolvadores de RNA R2 e DNA R2R em um tampão composto por 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 e 1 mM de EDTA. Incube a mistura do primer a 82 °C por 2 minutos, depois esfrie até 25 °C a uma taxa de 0,1 °C/s. Aliquota a mistura e congele para uso posterior.
3. Transcrição reversa por comutação de template
   1. Adicione os seguintes reagentes e incube por 30 min em temperatura ambiente: 2 μL de 5x tampão de reação, 1 μL de 1 μM DNA/RNA heteroduplex (use heteroduplex contendo um único saliência de G para a amostra CoSTseq; use heteroduplex contendo um saliente aleatório de N para a amostra DMS-MaPseq), 0,5 μL de enzima, 0,5 μL inibidor de RNase, 3,75 μL de amostra de RNA (ou adicione água para alcançar 7,75 μL de volume total).
   2. Incube essa mistura (sem dNTPs) por 30 minutos em tempo de descanso. Depois, adicione 1,25 μL de 10 mM dNTPs à reação e aplique as seguintes condições de ciclo em um termociclador: 25 °C por 10 minutos, 42 °C por 10 minutos, 50 °C por 10 minutos, 55 °C por 10 minutos, 60 °C por 30 minutos, 65 °C por 20 minutos, 75 °C por 15 minutos.
   3. Adicione 1 μL de RNase H e incube a 37 °C por 20 minutos. Purifique a reação PCR usando um método de purificação de DNA baseado em colunas para remover primers, nucleotídeos e enzimas restantes. Elute em um volume final de 20 μL.

Figura 2: Representação esquemática detalhada da preparação da biblioteca CoSTseq. RNA nascente com uma extremidade biotinilada de 3' é incubado com um adaptador de comutação de molde contendo uma saliência G que é complementar à biotina-CTP. Para RNA maduro fragmentado (DMS-MaPseq), um adaptador com saliência de N é utilizado (ver Figura 1). A síntese de cDNA é realizada usando uma transcriptase reversa altamente processiva, como a transcriptase reversa de introns do grupo II termoestável (TGIRT), seguida pelo tratamento com RNase H para degradar a fita de RNA. Subsequentemente, a ligase de DNA/RNA de aplicação 5' liga a extremidade 5' (rA^pp) adenilada por ribose do ligador UMI N₇ ao 3' OH do cDNA de fita simples. O adaptador UMI N₇ inclui uma extremidade bloqueada de 3′, impedindo a autoligação entre adaptadores. Por fim, a amplificação por PCR é realizada usando primers que incluem regiões sobrepostas e saliências de 5′ com códigos de barras únicos Illumina i5 e i7 atribuídos a cada amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

7. Ligação de adaptador 5' para preparação das bibliotecas finais de cDNA para sequenciamento de etiquetas de extremidade pareada

1. Preparação do adaptador de extremidade 5'
   1. Adenilato o adaptador da extremidade 5' usando uma reação baseada em ligase de RNA (por exemplo, ligase de RNA M, listada na Tabela de Materiais) com os seguintes componentes de reação: 8 μL de buffer de reação de adenilação de DNA 10x 5', 8 μL de 1 mM ATP, 100 μM de DNA R1R (este é o primer TruSeq contendo um identificador molecular único ou UMI), 8 μL de ligase de RNA M, 52 μL de água livre de nuclease.
      NOTA: Para detalhes relacionados ao design do adaptador_{UMI N 7} , veja a Tabela 2 e a Figura 2.
   2. Incube essa reação a 65 °C por 1 hora, depois a 85 °C por 5 minutos. Prossiga para purificar o produto usando precipitação de EtOH ou por um método de limpeza de DNA baseado em coluna de spin de membrana de sílica para isolar o cDNA, conforme as instruções do fabricante.
   3. Para a precipitação de EtOH, o DNA pode ser precipitado a -20 °C (mínimo 20 min) usando acetato de sódio (pH 5,2) em concentração final de 0,3 M e 2x-2,5x de 95%-100% de EtOH frio. Centrifuge a reação precipitada por EtOH por 15 minutos na velocidade máxima em uma centrífuga pré-resfriada (4 °C), lave o pellet usando 70% de EtOH, recentrifuge e seque o pellet ao ar. Resuspenda (ou elute, se usar uma coluna de spin) o pellet em 40 μL de água sem nuclease. Armazene a -20 °C por muito tempo.
2. Ligação de adaptador 5'
   1. Para um único volume de reação de 20 μL, adicione os seguintes componentes a 10 μL de cDNA: 2 μL de 10x NE Buffer 1, 2 μL de 50 mM_{MnCl 2,} 2 μL de ligase 5' AppDNA/RNA, 4 μL de 10 μM (100 ng/μL) do adaptador adenilado do passo 7.1.
   2. Incube essa reação a 65 °C por 1 hora, depois 3 minutos a 90 °C. Limpe a reação usando o kit de purificação por PCR minElute e elute em um volume final de 20 μL de água livre de nuclease.
3. Amplificação mínima por PCR das bibliotecas de cDNA com teste piloto
   1. Antes de prosseguir, prepare um estoque de 10 μM de primers de índice contendo códigos de barras únicos. Cada amostra única de CoSTseq ou DMS-MaPseq deve ter um código de barras único associado para uma análise a jusante suave. Veja as sequências de primers na Tabela 2. Os primers individuais contendo códigos de barras diretos e reversos podem ser combinados em uma mistura 1:1 e armazenados como um pré-misturado de código de barras.
   2. Usando 2 μL do produto PCR do passo 7.2, adicione 2,5 μL de buffer de PCR de alta fidelidade (por exemplo, um buffer comercial de HiFi), 0,375 μL de dNTP (10 mM), 0,75 μL de pré-mistura de código de barras (ou 0,375 μL de primers únicos de código de barras i5 e i7), 0,25 μL de DNA polimerase de arranque a quente de alta fidelidade (por exemplo, enzima comercial HiFi hot-start), 6,625 μL de água livre de nuclease.
   3. Incube essa reação a 95 °C e repita [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] por 23 ciclos, terminando com 1 minuto de incubação a 72 °C. Faça um gel de agarose a 1% para decidir o número ideal de ciclagem.
      NOTA: Para testar condições de ciclo mais baixas, uma amostra pode ser preparada ao final de um ciclo inferior (por exemplo, ao final de 15 ou 16 ciclos) e aplicada em um gel de agarose para comparar a intensidade do esfregaço da biblioteca de cDNA em um gel de agarose entre os comprimentos de ciclo.
4. PCR final para amplificação de bibliotecas
   1. Usando 18 μL do produto PCR do passo 7.2, adicione o seguinte do Kit de PCR KAPA HiFi: 22,5 μL de tampão de PCR de alta fidelidade, 3,375 μL de dNTP (10 mM), 6,75 μL de pré-mistura de código de barras (ou 3,375 μL de primers únicos de código de barras i5 e i7), 2,25 μL de DNA polimerase de arranque quente de alta fidelidade e 59,625 μL de água livre de nuclease.
   2. Incube essa reação a 95 °C e repita [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] pelo número de ciclos determinado no passo 7.3. Termine com 1 minuto de incubação a 72 °C.
5. Seleção de tamanhos
   1. Realize a seleção de tamanho no produto PCR usando purificação à base de esferas paramagnéticas (por exemplo, AMPure XP ou equivalente). Use 1,3x o volume de esferas (por exemplo, para uma reação PCR de 50 μL, use 65 μL de pasta de contas) e misture bem até ficar homogêneo. Deixe as esferas unirem a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente.
      NOTA: Essa proporção 1:1,3x entre amostra e esferas permite a remoção de dímeros adaptadores de primer e garante que fragmentos de DNA retidos não sejam menores que 150 bp e não maiores que 800 bp.
   2. Remova o sobrenadante sem mexer nas esferas e prossiga lavando as esferas com 80% de EtOH conforme o protocolo do fabricante.
   3. Elute o produto final em 11 μL. Execute 1 μL em um gel de agarose para verificar as bibliotecas. Submeta o produto final para sequenciamento.

8. Análise de dados

NOTA: O pacote completo do CoSTseq e o código de análise estão disponíveis no GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq), e o fluxo de trabalho para análise é mostrado na Figura 3. Este pipeline foi projetado para lidar tanto com dados de sequenciamento CoSTseq quanto DMS-MaPseq. O CoSTseq utiliza o Snakemake, um fluxo de trabalho de bioinformática que paraleliza facilmente a análise ao otimizar o número de núcleos de CPU^{disponíveis 19}. O fluxo de trabalho é definido por um Snakefile, que consiste em um conjunto de regras que estabelecem as análises que serão executadas. Não há necessidade de alterar o Snakefile disponível ao instalar o pacote GitHub.

1. Ajuste o arquivo de configuração (arquivo .yaml) com os caminhos corretos para onde os dados brutos são armazenados. Nessas configurações deve estar incluído um caminho para as sequências dos adaptadores e os nomes de amostras associados. Altere o arquivo de configuração para executar análises específicas definidas no Snakefile.
2. Para iniciar a análise, baixe as leituras finais paradas brutas em formato fastq.gz. Processa leituras usando fastp²⁰ para cortar sequências de adaptadores e filtro de qualidade para leituras com pontuações Phred de pelo menos 20. Alinhe essas leituras ao genoma de referência usando STAR²¹ para gerar arquivos BAM.
3. Como confirmação adicional, visualize os arquivos BAM gerados após executar o pipeline de análise CoSTseq no navegador Integrated Genome Viewer (IGV). Usando IGV, os arquivos BAM devem ser facilmente interpretáveis para mostrar leituras ao longo de todas as partes dos genes de interesse, indicando que as leituras representam RNA nascente. Como esperado, leituras de RNA maduro devem apresentar cobertura mínima em regiões intrônicas, dado que essas leituras devem ser derivadas de transcritos maduros e provavelmente eficientemente emendados.
4. Use a saída fastp (um arquivo .html que pode ser aberto em um navegador web) para uma estimativa de porcentagem de leituras duplicadas. Note que as leituras do CoSTseq podem ser altamente duplicadas, destacando a criticidade da próxima etapa.
5. Usando o UMICollapse²², deduplice leituras para colapsar leituras com UMIs e alinhamentos idênticos, permitindo a preservação apenas de leituras únicas e mitigando o viés de PCR. Os arquivos resultantes devem estar livres de leituras duplicadas e no formato BAM, onde leituras alinhadas ao rRNA serão separadas daquelas associadas a genes não-rRNA.
6. Para o componente principal final do pipeline modular CoSTseq, use uma implementação personalizada em Python para calcular as contagens de mutações e a cobertura de leitura de cada nucleótido. As funções que descrevem essa implementação podem ser encontradas no código-fonte do GitHub, e o Snakefile detalha a entrada, saída, parâmetros e funções para gerar esses dados que são armazenados em formato .pkl.
   NOTA: Existem uma infinidade de outras análises que podem ser realizadas usando o pipeline de análise CoSTseq, embora os parâmetros possam exigir otimização para necessidades de análise personalizadas. Um método valioso adaptado para o CoSTseq é o HDProbe, um pacote R que permite comparações genômicas de taxas^{de mutação 10}. Resumidamente, o HDProbe requer dados de todos os replicados e pode categorizar metodicamente diferenças significativas nas taxas de mutação em comparação com o controle. Outros tipos de análises que se podem desejar realizar incluem a previsão estrutural baseada nas reatividades experimentais do DMS. Isso pode ser realizado usando o pacote^{RNAstructure 23}.

Figura 3: Etapas da análise e resultados esperados do pipeline modular de análise CoSTseq. Etapas da análise, indicando o uso recomendado de ferramentas existentes, além do pipeline de análise CoSTseq pronto a usar, com os arquivos de saída e o conteúdo esperados. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Results

Esta seção apresenta os resultados reais gerados pela implementação do fluxo de trabalho e análise do CoSTseq, conforme descrito neste protocolo. Primeiramente, esta seção descreve os resultados esperados após a avaliação de qualidade das preparações bem-sucedidas da biblioteca antes e depois do sequenciamento. Antes do sequenciamento, os pesquisadores podem usar um teste de PCR e análise TapeStation para confirmar a presença de RNA após o enriquecimento de biotina. Isso indica isolament...

Discussion

O RNA começa a se dobrar co-transcricionalmente devido à cinética mais rápida do pareamento de bases em comparação com a taxa de^síntese 24,25,26,27. Nosso conhecimento atual sobre o dobramento de RNA nascente vem de estudos de moléculas únicas de RNAs procarióticos, sondagens in vitro ou abordagens in silico. Neste protocolo, é apresentado um ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	Invitrogen	18330019
10mM Biotina-11-CTP	Biociências de Jena	NU-831-BIOX
10mM GTP	Invitrogen	18332015
10mM UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	B7001S	Usado no passo 7.2.1
Soro Tamponado 10X (PBS)	Gibco	70011-044
20% SDS	RPI	L23100-500
Fenol:clorofórmio ácido	Ambion	AM9722
Contas AMPure XP para seleção de tamanho	Beckman Coulter	A63880	Usado para Seleção de Tamanho no passo 7.5.1
Bacto Peptone	Gibco	211677
Extrato de Levedura Bacto	Gibco	212750
Bicicleta	Sigma Aldrich	B3876-100G
Clorofórmio	Sigma Aldrich	319988
D-(+)-GLICOSE	Sigma Aldrich	G5767-500G
DIFCO AGAR	BD DIFCO	214010
Dimetil sulfato	Sigma Aldrich	D186309-5ML
Dinabeads e comércio; MyOne Estalunas C1 de Streptavidina	Invitrogen	65001	Usado para Pulldown de Biotina na Seção 4.1
Dinabeads e comércio; mRNA DIRETO & TRADE; Kit de Purificação	Invitrogen	61011	Usado para a seleção Poly A na Seção 5.1
EDTA, pH 8, 0,5M	Sigma Aldrich & nbsp;	03690-100ML
Etanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	Co-precipitante usado nos passos 4.2.7 e 5.2.4
Induro®   Transcriptase Reversa	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	M0681S	Enzima RT usada no passo 6.3.1
Álcool isoamílico	Sigma Aldrich & nbsp;	W205710-1KG-K
Isopropanol	JT-BAKER	9084-05-01
Kit de PCR KAPA HiFi HotStart	Roche	07958889001	DNA Pol de alta fidelidade usado em 7.3.2 e 7.4.1 para reações de PCR
Cloreto de Magnésio	Sigma Aldrich	SLCM2154
Kit de Purificação de PCR MinElute	Qiagen	28004	Usado para limpeza de DNA nos passos 6.3.3 e 7.2.2
Ligase de RNA M-ésima	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	M2611A
Oligo Clean & Concentrador	Zymo Research	D4060	Sugerido para limpeza de DNA Oligo no passo 7.1.2
Acetato de potássio	Sigma Aldrich	236497-500G
Cloreto de potássio	JT Baker	3040-01
Hidróxido de potássio	Avantor	6984-04-01
RNA Limpo & Concentrador-5	Zymo Research	R1014	Kit de limpeza de RNA usado no passo 5.3.2 após o tratamento com PNK
RNaseOUT™ Inibidor de Ribonuclease Recombinante	Thermo Fisher Scientific	10777019	Inibidor de RNase usado na etapa 5.3.1 durante o tratamento com PNK
Sarkosyl	IBI Scientific	IB07080
Acetato de sódio	Qualidade Biológico	351-035-721
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S5150-1L
Hidróxido de Sódio	Macron	7708-10
SUPERase· In™ Inibidor de RNase (20 U/μ L)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	Inibidor de RNase usado no passo 6.3.1
Polinucleotídeo quinase T4	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	M0201S
Termoestável 5' DNA do aplicativo/RNA Ligase	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	M0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1M	Termo Científica	J60202. K2
Triton X-100	TEKNOVA	T1105
TRIzol™ Reagente	Invitrogen	15596-026	Para a elução de RNA nascente na Seção 4.2; também referido como "reagente de RNA" na Seção 4
β-mercaptoetanol	Sigma Aldrich	M6250-1L