Análise Comparativa da Estrutura de RNA de Transcritos Nascentes e Maduros em Saccharomyces cerevisiae

Summary

A estrutura secundária do RNA tem sido observada principalmente em RNA maduro com métodos de sondagem estrutural. O sequenciamento co-transcricional de Rastreamento de Estruturas (CoSTseq) unifica o funcionamento nuclear, que tem sido usado para estudar a posição da polimerase em RNA nascente, com sondagem estrutural. Assim, o CoSTseq permite a observação da estrutura secundária do RNA em RNA sob transcrição ativa.

Abstract

Durante a transcrição, o RNA nascente começa a se formar em pareamento de bases ao sair das RNA polimerases (Pols). Esse pareamento de bases permite a formação de estruturas de RNA que influenciam criticamente a expressão gênica no nível do processamento, tradução e estabilidade do RNA. Métodos estabelecidos para estudar a estrutura secundária do RNA são limitados a transcritos maduros, enquanto pouco se sabe sobre estados de dobramento. Além disso, a abundância relativamente menor (< 1%) e a natureza transitória do RNA nascente complicam seu isolamento e caracterização. O Acompanhamento de Estrutura Co-Transcricional (CoSTseq) utiliza o processo transcricional contínuo com sondagem biotina-NTP e sulfato de dimetil (DMS) para adquirir simultaneamente a posição Pol e o status de pareamento de bases de transcritos nascentes. Em Saccharomyces cerevisiae, o CoSTseq fornece a sequência e informações estruturais próximas à extremidade 3' dos RNAs nascentes transcritos por qualquer um dos três polos de RNA. Durante o episódio transcricional, a biotina-NTP incorporada no local ativo efetivamente trava os Pols. Depois, o tratamento com DMS metila nucleotídeos A, C e U desparelhados. O enriquecimento subsequente de biotina e a síntese de cDNA com uma transcriptase reversa com troca de template permitem o sequenciamento de extremidades pareadas e o cálculo das reatividades do DMS em função da posição Pol. O CoSTseq é facilmente realizado lado a lado com a sondagem DMS (DMS-MaPseq), permitindo também a captura do transcrito maduro dobrado. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para CoSTseq paralelo e DMS-MaPseq, incluindo o processo transcricional, preparação de bibliotecas e análise de dados.

Introduction

O RNA pode se dobrar em estruturas secundárias e terciárias devido ao pareamento de bases dentro das moléculas de RNA, e essas estruturas podem ainda ser influenciadas por proteínas que atuam como chaperonas para guiar o dobramento do^{RNA 1}. A estrutura do RNA pode ser altamente dinâmica, onde os RNAs celulares podem se conformar a uma variedade de estruturas definidas pela paisagem termodinâmica para gerar conjuntos de possíveis conformações^{de RNA 2}. Mudanças conformacionais dinâmicas têm potencial para afetar a regulação e expressão^{gênica 3,4}

Protocol

NOTA: Antes de começar, certifique-se de que todos os buffers listados na Tabela 1 estejam preparados. Todos os reagentes devem ser preparados em água sem nuclease. A esterilização por filtro dos tampões é recomendada ao usar produtos químicos/reagentes de grau não biologico molecular para preparação do tampão. Para as seções 1 a 4, prepare o seguinte com antecedência:

1. Preparação de materiais e reagentes

1. Prepare uma solução de sarkosyl (v/v) a 10% com pelo menos 1 dia de antecedência para permitir tempo suficiente para a dissolução completa. Esterilize a solu....

Results

Esta seção apresenta os resultados reais gerados pela implementação do fluxo de trabalho e análise do CoSTseq, conforme descrito neste protocolo. Primeiramente, esta seção descreve os resultados esperados após a avaliação de qualidade das preparações bem-sucedidas da biblioteca antes e depois do sequenciamento. Antes do sequenciamento, os pesquisadores podem usar um teste de PCR e análise TapeStation para confirmar a presença de RNA após o enriquecimento de biotina. Isso indica isolament.......

Discussion

O RNA começa a se dobrar co-transcricionalmente devido à cinética mais rápida do pareamento de bases em comparação com a taxa de^síntese 24,25,26,27. Nosso conhecimento atual sobre o dobramento de RNA nascente vem de estudos de moléculas únicas de RNAs procarióticos, sondagens in vitro ou abordagens in silico. Neste protocolo, é apresentado um .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	Invitrogen	18330019
10mM Biotina-11-CTP	Biociências de Jena	NU-831-BIOX
10mM GTP	Invitrogen	18332015
10mM UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	B7001S	Usado no passo 7.2.1
Soro Tamponado 10X (PBS)	Gibco	70011-044
20% SDS	RPI	L23100-500
Fenol:clorofórmio ácido	Ambion	AM9722
Contas AMPure XP para seleção de tamanho	Beckman Coulter	A63880	Usado para Seleção de Tamanho no passo 7.5.1
Bacto Peptone	Gibco	211677
Extrato de Levedura Bacto	Gibco	212750
Bicicleta	Sigma Aldrich	B3876-100G
Clorofórmio	Sigma Aldrich	319988
D-(+)-GLICOSE	Sigma Aldrich	G5767-500G
DIFCO AGAR	BD DIFCO	214010
Dimetil sulfato	Sigma Aldrich	D186309-5ML
Dinabeads e comércio; MyOne Estalunas C1 de Streptavidina	Invitrogen	65001	Usado para Pulldown de Biotina na Seção 4.1
Dinabeads e comércio; mRNA DIRETO & TRADE; Kit de Purificação	Invitrogen	61011	Usado para a seleção Poly A na Seção 5.1
EDTA, pH 8, 0,5M	Sigma Aldrich & nbsp;	03690-100ML
Etanol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	Co-precipitante usado nos passos 4.2.7 e 5.2.4
Induro®   Transcriptase Reversa	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	M0681S	Enzima RT usada no passo 6.3.1
Álcool isoamílico	Sigma Aldrich & nbsp;	W205710-1KG-K
Isopropanol	JT-BAKER	9084-05-01
Kit de PCR KAPA HiFi HotStart	Roche	07958889001	DNA Pol de alta fidelidade usado em 7.3.2 e 7.4.1 para reações de PCR
Cloreto de Magnésio	Sigma Aldrich	SLCM2154
Kit de Purificação de PCR MinElute	Qiagen	28004	Usado para limpeza de DNA nos passos 6.3.3 e 7.2.2
Ligase de RNA M-ésima	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	M2611A
Oligo Clean & Concentrador	Zymo Research	D4060	Sugerido para limpeza de DNA Oligo no passo 7.1.2
Acetato de potássio	Sigma Aldrich	236497-500G
Cloreto de potássio	JT Baker	3040-01
Hidróxido de potássio	Avantor	6984-04-01
RNA Limpo & Concentrador-5	Zymo Research	R1014	Kit de limpeza de RNA usado no passo 5.3.2 após o tratamento com PNK
RNaseOUT™ Inibidor de Ribonuclease Recombinante	Thermo Fisher Scientific	10777019	Inibidor de RNase usado na etapa 5.3.1 durante o tratamento com PNK
Sarkosyl	IBI Scientific	IB07080
Acetato de sódio	Qualidade Biológico	351-035-721
Cloreto de sódio	Sigma Aldrich	S5150-1L
Hidróxido de Sódio	Macron	7708-10
SUPERase· In™ Inibidor de RNase (20 U/μ L)	Thermo Fisher Scientific	AM2696	Inibidor de RNase usado no passo 6.3.1
Polinucleotídeo quinase T4	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	M0201S
Termoestável 5' DNA do aplicativo/RNA Ligase	Biolaboratórios da Nova Inglaterra	M0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1M	Termo Científica	J60202. K2
Triton X-100	TEKNOVA	T1105
TRIzol™ Reagente	Invitrogen	15596-026	Para a elução de RNA nascente na Seção 4.2; também referido como "reagente de RNA" na Seção 4
β-mercaptoetanol	Sigma Aldrich	M6250-1L