Novo modelo de rato para trombose sinusal venosa cerebral grave estabelecido por combinação de semi-ligadura, cloreto férrico e trombina

Resumo

O novo modelo de rato para trombose severa do seio venoso cerebral (CVST), construído por semi-ligadura combinada com cloreto férrico e trombina, pode imitar de forma mais eficaz o mecanismo fisiopatológico da CVST grave em humanos.

Resumo

A trombose do seio venoso cerebral (CVST) é um tipo distinto de AVC que afeta predominantemente jovens e mulheres grávidas. Aproximadamente 60% dos pacientes com CVST desenvolvem infarto ou hemorragia cerebral venosa, definida como CVST grave. Atualmente, diversos métodos são empregados tanto nacional quanto internacionalmente para induzir CVST em modelos animais. No entanto, esses modelos não conseguem replicar totalmente os mecanismos fisiopatológicos subjacentes ao CVST grave, limitando assim a pesquisa básica sobre essa condição. Um modelo inovador de CVST grave em ratos pode ser estabelecido por semi-ligadura em combinação com cloreto férrico e trombina. A semi-ligadura foi alcançada medindo o fluxo sanguíneo cerebral (CBF) na região de interesse (ROI) antes e depois da ligadura do seio sagital superior (SSS) usando um Imager de Perfusão Speckle (PSI). A semi-ligadura do SSS induz estase sanguínea dentro do seio venoso. A aplicação tópica de cloreto férrico na superfície do SSS leva a lesão endotelial, enquanto a injeção direta de trombomba no seio cria um estado hipercoagulável localizado. Essa abordagem imita efetivamente os três componentes principais da formação da trombose: estase, dano endotelial e hipercoagulabilidade. O modelo resultante apresenta uma carga trombótica substancial envolvendo múltiplos seios venosos simultaneamente. O trombo induzido permanece estável por pelo menos 1 semana. A coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) demonstra que esse modelo pode produzir consistentemente infarto venoso cerebral de grande área, que persiste por até 7 dias. Esse modelo pode até induzir convulsões epilépticas em ratos, uma capacidade que modelos anteriores não conseguiram alcançar. A ruptura da barreira hematoencefálica foi observada usando coloração de azul de Evans (EB). Portanto, o modelo de CVST severo estabelecido por semi-ligadura combinada com administração de cloreto férrico e trombocina replica com maior precisão a progressão fisiopatológica do CVST severo em humanos, demonstrando estabilidade e confiabilidade.

Introdução

A trombose do seio venoso cerebral (CVST) é uma forma distinta de distúrbio cerebrovascular que difere do AVC arterial. Ocorre com mais frequência em indivíduos mais^{jovens 1,2}, especialmente em^{gestantes 3}, e sua incidência tem aumentado de forma constante nos últimos anos. Um estudo epidemiológico realizado na Austrália indica que a incidência anual de CVST varia de 13,0 a 15,7 casos por milhão^{de pessoas 4}. Nos Estados Unidos, a incidência de CVST apresenta uma tendência de alta com a idade. No entanto, a idade máxima de início para mulheres é menor em comparação com a dos^{homens de 5} anos. Entre 2021 e 2023, 43 por milhão de pacientes que visitaram os pronto-socorros nos Estados Unidos foram diagnosticados com^{CVST 6}. Em ambientes clínicos, a trombose múltipla sinusal é a forma mais comumente observada, representando aproximadamente 57,14% de todos os casos. Em seguida, há envolvimento do seio sagital superior (SSS; 16,19%), do seio transverso (11,43%) e do seio sigmoide (8,57%)⁴. As principais manifestações clínicas incluem cefaleia, que pode ser acompanhada de epilepsia, distúrbios da consciência e sintomas neurológicos ^{focais 7,8,9}. No entanto, essas manifestações não são específicas. Aproximadamente 60% dos pacientes com CVST desenvolvem infarto venoso cerebral ou hemorragia, classificada como CVST^{grave 10,11}. Embora o tratamento da CVST inclua terapia anticoagulante e intervenção cirúrgica, a taxa de mortalidade da CVST grave permanece em 34,2^%. Essa alta mortalidade pode ser atribuída ao fato de que os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à CVST grave ainda não são totalmente compreendidos. Um modelo animal adequado para CVST grave é, portanto, uma ferramenta experimental essencial para investigar sua patogênese, progressão fisiopatológica e potenciais estratégias terapêuticas¹².

Atualmente, os métodos para induzir modelos animais CVST geralmente podem ser categorizados nos seguintes tipos: ligadura^{permanente 13,14}, indução química 15,16,17, abordagens ^{intervencionistas 18,19}, implantação de enxertos^{auto-fabricados} 20,21,22 e eletrocoagulação bipolar ^23,24. O trombo induzido por modelos animais anteriores teve curta duração e não conseguiu induzir simultaneamente múltiplos trombos venosos e infarto cerebral venoso de grande área. Portanto, o desenvolvimento de um modelo de CVST severo que envolva múltiplos seios venosos simultaneamente tornou-se uma prioridade urgente. O método de semi-ligadura combinado com cloreto férrico e trombomba pode estabelecer um modelo novo de rato para CVST grave. Além disso, o novo modelo de CVST grave simula com mais precisão o processo fisiopatológico humano da CVST grave por meio de três aspectos principais: carga de trombo do seio venoso, infarto cerebral venoso e ruptura da barreira hematoencefálica. Esse modelo é aplicável à pesquisa sobre mecanismos fisiopatológicos e estratégias de tratamento para CVSTs graves. Esse novo modelo de rato pode ser utilizado no futuro para investigar o mecanismo fisiopatológico do TSVC grave.

Protocolo

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Experimentos e Bem-Estar Animal Experimental da Capital Medical University (AEEI-2020-119) em Pequim, China, e foi realizado em conformidade com os regulamentos do Comitê de Cuidado e Uso Animal da instituição.

1. Preparação animal

1. Atribuir aleatoriamente ratos machos saudáveis de Sprague-Dawley (SD), com peso corporal médio de 300 ± 10 g, ao grupo experimental ou ao grupo de simulação de operação. Todos os animais eram mantidos em um ciclo alternado de 12 horas de luz/escuridão, com acesso a comida e água ad libitum.

2. Aplicação da PSI

1. Use a PSI para monitorar continuamente alterações no fluxo sanguíneo cerebral (CBF) dentro do SSS dos ratos durante todo o processo de modelagem. Selecione uma área circular fixa dentro do SSS como a região de interesse (ROI). Ao monitorar as mudanças no CBF do ROI durante a cirurgia, determine a conclusão da semi-ligadura e o sucesso da indução por trombo.

3. Estabelecimento do modelo de rato severo CVST

1. Anestesiamos ratos usando 5% de enflurano, com uma mistura gasosa composta por 70% de óxido nitroso e 30% de oxigênio por meio de uma máscara anestésica. Mantenha a concentração de enflurano na faixa de 1% a 2% durante todo o procedimento cirúrgico. Coloque os ratos anestesiados na posição deitado com as cabeças fixas na linha média, usando um quadro estereotáxico. Mantenha a temperatura corporal em 37 ± 0,5 °C durante toda a cirurgia usando uma almofada térmica térmica.
2. Faça uma incisão longitudinal de 1,5 cm ao longo da linha média da região craniana do rato. Dissecar o tecido subcutâneo para expor o crânio subjacente.
3. Sob visualização microscópica, crie uma janela craniana longitudinal (10 x 4 mm) entre a brema e o lambda usando uma broca dentária de alta velocidade. Expor a SSS e o córtex cerebral bilateral preservando a integridade da dura-máter. Durante o processo de perfuração craniana, resfrie a broca continuamente com soro fisiológico normal para evitar danos térmicos na dura-mãe e no córtex.
4. Após a exposição ao SSS, avalie o CBF do ROI no SSS usando o PSI e registre os dados correspondentes. Semi-liga o SSS rostral e caudal usando um 8-0 pontos de poliamida sob observação microscópica.
   NOTA: Ao ligar o SSS, a força deve ser moderada e não excessiva. Caso contrário, um efeito de semi-ligação não pode ser alcançado. A ligadura deve idealmente ser realizada em um único procedimento contínuo. Tentativas repetidas de ligação podem resultar na perfuração do SSS, comprometendo assim o sucesso da fabricação do modelo.
5. Utilize o PSI para avaliar o CBF do ROI localizado no segmento ligado do SSS, confirmando que o CBF havia diminuído para aproximadamente 50% disso antes da semi-ligação. Registre os resultados sistematicamente.
6. Em condições protegidas à luz, mergulhe um fio de seda 3-0 de 7 mm de comprimento em cloreto férrico a 40% e utilize-o para cobrir a superfície do local de ligação SSS por uma duração de 5 minutos. Lave o campo com soro normal depois que o fio de seda for removido.
7. Injete 0,1 mL de solução de trombina (500 U/mL) na cavidade sinusal do segmento ligado usando um microinjetor em até 1 minuto. Repetir a injeção mais duas vezes consecutivas, para uma dose total de trombina de 150 U. O refluxo de trombona para o espaço epidural não causou trombose ruim.
   1. Para facilitar a injeção de trombocina no SSS, dobre suavemente a agulha do microinjetor antes da inserção. Esse ajuste permite um melhor controle do ângulo da agulha durante a perfuração e ajuda a evitar penetração não intencional através do SSS.
8. Reavalie o CBF do ROI usando o PSI após a injeção de trombona. Certifique-se de que os resultados confirmem uma diminuição significativa da CBF em comparação com a semi-ligadura seguinte, indicando indução bem-sucedida da trombose. Registre os dados sistematicamente para análise posterior.
9. Fele a janela óssea com cera óssea, seguida de sutura da incisão. Após o procedimento cirúrgico, administre cetoprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea a cada rato para aliviar a dor pós-operatória.
10. No grupo de cirurgia simulada, realize apenas a craniotomia, sem intervenções cirúrgicas adicionais.

4. Carga de trombose do seio venoso e infarto cerebral

1. Avalie a carga da trombose do seio venoso em três momentos: 1 dia, 2 dias e 7 dias após o estabelecimento do modelo. Sacrificar ratos e realizar perfusão cardíaca com soro fisiológico normal em diferentes momentos.
2. Realize uma craniotomia para avaliar visualmente a extensão do envolvimento da trombose do seio venoso. Isole o trombo e sujeite à análise quantitativa. Retire o tecido cerebral e o divida em fatias coronais de 2 mm de espessura.
3. Imerga as fatias em uma solução de 2% para tentar fazer e incube em um banho-maria a 37 °C por 20 minutos para facilitar a coloração. Em seguida, avalie visualmente o infarto venoso cerebral e quantifique o volume do infarto usando o software ImageJ para análise estatística subsequente.
   Volume do infarto = área do infarto em mm quadrados x espessura [2 mm]

5. Perturbação da permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB)

1. No segundo dia após a cirurgia, selecione aleatoriamente ratos tanto do grupo modelo quanto do grupo simulado de cirurgia e administre uma injeção intravenosa de 2% de Evans blue (EB) através da veia caudal.
2. Após 2 horas de administração bem-sucedida da injeção, eutanasie os ratos e perfunde com soro sorológico tamponado com fosfato (PBS) através do ventrículo esquerdo. Colhe os tecidos cerebrais e secione-os em fatias de 2 mm de espessura para avaliar a extensão da penetração do EB.

6. Análise estatística

1. Realize análises estatísticas usando o software SPSS 17.0. Apresente os dados de medição como média ± desvio padrão. Use análise unidirecional da variância (ANOVA) ou um teste t de amostras independentes para comparações de grupos.
2. Para a análise de variáveis contínuas medidas em múltiplos pontos de tempo dentro do mesmo grupo, use medidas repetidas ANOVA para avaliar diferenças entre grupos entre os tempos. Um valor-p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Processo de modelagem
A Figura 1A mostra o SSS do rato, conforme indicado pela seta. O rostral e o caudal do SSS foram semiligados (Figura 1B), seguidos pela aplicação de fio embebido em cloreto férrico na superfície das regiões ligadas (Figura 1C). A trombina foi posteriormente injetada nos segmentos ligados para induzir trombose. A área denotada pela seta, onde a trombina foi ...

Discussão

Um modelo inovador de CVST severo construído por semi-ligadura combinada com cloreto férrico e trombona não pode apenas simular estase sanguínea e lesão endotelial, mas também o estado hipercoagulável do sangue, ou seja, simula os três elementos da formação da^{trombose 25}. O que é ainda mais empolgante é que o modelo de rato desenvolvido com esse método é capaz de apresentar convulsões epilépticas. Convulsões epilépticas representam uma manifestação clínica notável...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,3,5-cloreto de trifeniltetrazólio	Sigma-Aldrich
40% cloreto férrico	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., China
Evans blue	Sigma-Aldrich
Bolsa térmica	Aparelho de Harvard Holliston, MA, EUA	50-7061-f,
Broca dentária de alta velocidade	Saeshin, Busan, Coreia do Sul	Strong-207B
Medidor de speckle a laser	Sistema PSI PeriCam, Suécia
Microscópio	Carl Zeiss, Inc., Berlim, Alemanha
Sutura de poliamida	Fábrica de Microaparelhos Ningbo Chenghe, China
Quadro estereotáxico	David Kopf Instruments, Tujunga, Califórnia, EUA
Trombona	Chang Chun Lei Yunshang Pharmaceutical Co., Ltd., China