Criossecção de implantes sintéticos biocompatíveis usando resina curável por UV para análise aprimorada de imunofluorescência

Summary

Este trabalho apresenta um protocolo de criossecção que utiliza estabilização por resina curável por UV para manter a integridade da interface implante-tecido, preservando a acessibilidade do antígeno, possibilitando uma análise confiável e de alta resolução de imunofluorescência de implantes de polímeros sintéticos.

Abstract

A avaliação histológica de implantes sintéticos e biocompatíveis apresenta desafios técnicos significativos devido à incompatibilidade entre os métodos convencionais de processamento de tecidos e as propriedades fisicoquímicas desses materiais. As abordagens atuais que utilizam embedding completo em resina proporcionam preservação estrutural adequada, mas comprometem severamente a acessibilidade do epítopo, limitando assim as aplicações imunohistoquímicas essenciais para caracterizar as respostas imunes do hospedeiro. Por outro lado, a incorporação convencional de parafina apresenta baixa adesão a substratos sintéticos e limita a seleção de anticorpos para um perfil imunológico abrangente. Protocolos padrão de criossecção aumentam a compatibilidade imuno-histoquímica ao melhorar a preservação do antígeno; no entanto, esses métodos frequentemente resultam em integridade estrutural inadequada dos espécimes contendo implantes, comprometendo a avaliação morfológica e a qualidade da secção. Para resolver essas limitações, foi desenvolvido um novo protocolo de processamento que incorpora uma resina curável por UV para estabilização seletiva de construções de tecido implante antes da criossecção. Essa metodologia emprega uma resina fotopolimerizável para fornecer suporte mecânico enquanto preserva a acessibilidade do epítopo e os determinantes antigênicos, que normalmente são comprometidos pela polimerização total da resina. O protocolo permite a geração reprodutível de seções de alta qualidade com espessura ideal para avaliação de imunofluorescência, alcançando uma preservação estrutural superior em comparação à seção congelada padrão, sem a extensa reticulação que limita a penetração de anticorpos em amostras convencionais embutidas em resina. Essa abordagem representa uma solução prática e econômica para o processamento histológico de implantes sintéticos, oferecendo capacidades analíticas aprimoradas para avaliação de biocompatibilidade e facilitando a caracterização detalhada das respostas imunes locais nas interfaces implante-tecido.

Introduction

A microscopia de imunofluorescência é uma técnica analítica essencial na pesquisa em medicina regenerativa, facilitando a visualização da arquitetura dos tecidos e da composição celular usando anticorpos conjugados com fluoróforos. Essa metodologia integra a especificidade molecular do reconhecimento imunoquímico com a sensibilidade e versatilidade da detecção de fluorescência, permitindo a observação detalhada das distribuições celulares dos alvos em seus microambientes teciduais. Abordagens de imunofluorescência abrangem estratégias de marcação direta e indireta, com protocolos de imunofluorescência indireta proporcionando amplificação aprimorada do sinal por meio de sistemas secundários de anticorpos conjugados a diversos fluoróforos abrangendo o espectro visível e o infravermelho^{próximo 1}. A capacidade inerente da metodologia para a detecção simultânea de múltiplos alvos por meio da separação espectral facilita a caracterização fenotípica abrangente de populações celulares heterogêneas e suas relações espaciais dentro de microambientes teciduais^{complexos 2}.

As capacidades técnicas da microscopia de imunofluorescência vão além da localização convencional de proteínas para abranger aplicações analíticas quantitativas, incluindo medições de intensidade de fluorescência, análises de colocalização e avaliações de distribuição espacial críticas para entender a função celular e a organização^{dos tecidos 3}. No contexto da pesquisa em biocompatibilidade de implantes, a análise de imunofluorescência fornece insights críticos sobre as respostas imunes do hospedeiro, incluindo reações de corpos estranhos, cascatas inflamatórias e processos de integração de tecidos que determinam a aceitação ou rejeição do implante nos níveis celular e^{molecular 4}.

A implementação bem-sucedida dos protocolos de imunofluorescência exige uma consideração cuidadosa das metodologias de processamento de tecidos que preservam a integridade morfológica enquanto mantêm o sinal fluorescente e minimizam a autofluorescência de fundo. A seleção tradicional do meio de imersão depende do tipo de tecido, dos requisitos analíticos posteriores e dos antígenos específicos de interesse. Para materiais sintéticos e implantes, a literatura atual recomenda principalmente a incorporação completa de resina para manter a estabilidade estrutural durante os procedimentos de^{seccionamento 5}. No entanto, essa abordagem apresenta limitações significativas devido à necessidade de ultramicrôtomos e lâminas especializadas para seccionar blocos de resina polimerizada, representando um investimento substancial em equipamentos e expertise técnica. A incorporação por parafina, embora forneça suporte estrutural adequado para a secção, introduz mudanças conformacionais nos determinantes antigênicos durante a fixação e o processamento por meio de desidratação extensiva, endurecimento químico e infiltração com solventes orgânicos que podem desnaturar proteínas e mascarar epítopos. O processamento de parafina também produz interferência intrínseca de autofluorescência que compromete a detecção de sinais e a análise quantitativa. Essas alterações exigem procedimentos de recuperação de antígenos, normalmente envolvendo a recuperação de epítopos induzida por calor (HIER) ou a recuperação de epítopos induzida por proteolíticos (PIER), para restaurar a acessibilidade de^{anticorpos 6}. Apesar dessas intervenções, numerosos anticorpos comercialmente disponíveis permanecem incompatíveis com amostras embutidas em parafina, e as condições severas de recuperação podem comprometer ainda mais a qualidade do sinal fluorescente e introduzir artefatos de fotobranqueamento.

A criosseção oferece uma metodologia alternativa de processamento para aplicações de imunofluorescência. Dois métodos de criopreservação podem ser usados para a preparação de tecidos. A primeira abordagem envolve criopreservação rápida por imersão direta de amostras de tecido fresco em um banho de isopentano pré-resfriado com nitrogênio líquido para atingir temperaturas abaixo de –20 °C, seguida de secção usando micrótomos criostaticos equipados com câmaras de corte controladas por temperatura. O segundo protocolo utiliza um curto período de fixação em paraformaldeído (PFA) ou formalina, seguido de crioproteção por meio de infiltração graduada em sacarose antes do congelamento. O processo de criopreservação cria uma matriz rígida que mantém a integridade dos tecidos enquanto preserva as conformações nativas das proteínas, essenciais para o reconhecimento de anticorpos. A secção congelada mantém os tecidos quase nativos com modificações químicas^{mínimas 7}, reduzindo assim a necessidade de procedimentos rigorosos de recuperação de antígenos e permitindo o uso de uma gama mais ampla de anticorpos primários, incluindo aqueles incompatíveis com tecidos embutidos na parafina devido à mascaramento do epítopo ou^{desnaturação 8}.

O processo de criossecção normalmente utiliza composto de temperatura de corte ideal (OCT), um meio de embedding solúvel em água composto por álcool polivinílico e polietilenoglicol que fornece suporte estrutural durante a secção, permanecendo transparente e compatível com sistemas de detecção de fluorescência. A incorporação OCT facilita a geração de seções finas e uniformes com espessura de 5 a 15 μm, dependendo dos requisitos analíticos específicos e das características do^{tecido 9}. A preservação das conformações nativas de proteínas em seções congeladas mantém as proporções ideais sinal-ruído essenciais para a análise quantitativa de imunofluorescência, ao mesmo tempo em que mantém epítopos intactos que permitem o uso de uma gama mais ampla de anticorpos primários, incluindo aqueles incompatíveis com tecidos embutidos em^{parafina 8}.

No entanto, a secção de tecidos congelados apresenta desafios técnicos únicos, especialmente no processamento de materiais sintéticos implantados que possuem propriedades fisicoquímicas distintas em comparação com tecidos biológicos nativos. A expansão térmica diferencial entre polímeros sintéticos e interfaces biológicos de tecidos durante o congelamento pode resultar em estresse mecânico localizado que compromete a integridade estrutural e cria artefatos de secção¹⁰. Além disso, a rigidez inerente de muitos materiais sintéticos em relação a tecidos biológicos congelados pode causar deflexão da lâmina durante a secção, resultando em espessura desigual da seção e danos tanto à amostra quanto ao equipamento de corte. Essas limitações técnicas exigem protocolos de processamento especializados que possam atender aos requisitos únicos de amostras contendo implantes, mantendo as vantagens da secção congelada para aplicações de imunofluorescência.

Para abordar essas limitações, este estudo desenvolveu um protocolo de criossecção que combina estabilização seletiva com resina curável por UV com parâmetros controlados de crio-seccionamento para permitir uma análise de imunofluorescência multiparâmetro e de alta resolução de construtos de tecido implantado.

Protocol

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Mayo Clinic (IACUC), sob o número de aprovação A00003765-18-24. Todos os procedimentos envolvendo implantes sintéticos biocompatíveis foram realizados em condições estéreis, de acordo com protocolos de biossegurança apropriados.

1. Processamento de amostras e crioproteção

NOTA: Manuseie formalina exclusivamente em uma exaustão química e use equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados, pois o formalino contém formaldeído, um irritante potente, sensibilizante e carcinógeno.

1. Fixar amostras sintéticas biocompatíveis integradas em tecido em formalina tampã neutra a 10% durante a noite a 4° C, utilizando no mínimo 10 volumes de fixador em relação ao volume do tecido para garantir imersão completa e penetração adequada. O objetivo desse período limitado de fixação é alcançar a mínima reticulação enquanto preserva a morfologia tecidual. (Veja a Tabela de Materiais para materiais usados no Protocolo.)
2. Transfira as amostras para uma solução de sacarose a 15% preparada em soro salino tamponado com fosfato (PBS) para incubação durante a noite a 4° C com agitação suave. Garanta a infiltração completa de sacarose, como evidenciado pelo afundamento do tecido.
3. Transfira as amostras para solução de sacarose a 30% em PBS para uma segunda incubação noturna a 4° C. Confirme o equilíbrio completo afundando tecido no fundo do recipiente, indicando infiltração adequada de sacarose e deslocamento de água.
4. Prepare uma proporção volumétrica 1:1 de solução de sacarose de 30% e composto OCT. Incube amostras neste meio de transição por 2 horas a 4° C, depois transfira para 100% de OCT por 1 hora para alcançar o equilíbrio completo, conforme indicado pela aparência uniformemente opaca do tecido.
5. Posicione as amostras cuidadosamente em criomoldes padrão preenchidos com composto OCT fresco, garantindo orientação ideal para planos de secção. Oriente-se com a interface implante-tecido disponível para procedimentos subsequentes. Elimine as bolhas de ar usando pinças pré-resfriadas.
6. Coloque criomoldes cheios imediatamente sobre a plataforma de gelo seco para criar um gradiente de temperatura que promova a rápida formação de cristais de gelo de baixo para cima. Monitore por 10–15 minutos até a solidificação completa, confirmado pela aparência opaca branca característica do composto OCT congelado. Transfira blocos congelados para armazenamento a –80° C ou diretamente para a câmara do criostato para seccionamento imediato.

2. Configuração do criostato e seccionamento inicial

1. Mantenha a câmara controlada por temperatura crioposto a –15° C. Verifique a temperatura usando monitoramento digital integrado e equilibre durante a noite antes da introdução da amostra.
2. Instale novas lâminas descartáveis. Defina o ângulo da lâmina para a seção combinada de material sintético-biológico de acordo com as especificações do fabricante.
3. A espessura desejada da seção (50–100 μm) é programada no criostato selecionando a configuração Thickness no painel de controle, ajustando usando as setas e confirmando o parâmetro pressionando a tecla Set .
4. Avance através da amostra embutida para alcançar a profundidade predeterminada correspondente à interface implante-tecido. Monitore a superfície da seção em avanço para identificar o plano ideal para aplicação de resina UV, caracterizada por mudanças sutis na opacidade do tecido e exposição inicial à periferia do implante, e a profundidade é confirmada quando essas características permanecem consistentemente visíveis em seções sucessivas aparadas.
   NOTA: Pare a seção imediatamente ao chegar à interface crítica para impedir o avanço além da região-alvo.

3. Aplicação de resina curável por UV

NOTA: Manuseie resina curável por UV em um local bem ventilado usando EPI adequado e proteja olhos e pele da luz de cura LED-UV. Essas resinas contêm irritantes que podem causar reações na pele e nos olhos, e a exposição a LED-UV pode causar lesão ocular induzida por UV.

1. Corte o parafilme usando tesoura para dimensões 2–3 mm que ultrapassem o perímetro do implante. Separe cuidadosamente do fundo protetor usando pinças estériles.
2. Dispense 5–10 μL de resina curável por UV sobre a superfície exposta do parafilme (Figura 1A). O volume de resina é otimizado por meio da realização de aplicações preliminares de teste nas quais volumes incrementais são dispensados, e a dispersão resultante é avaliada visualmente para garantir cobertura uniforme da superfície da amostra sem transbordamento ou acúmulo excessivo de resina que possa interferir na secção.
3. Substitua imediatamente o suporte de papel protetor sobre o parafilme carregado em resina. Aplique um rolo de emenda de poliuretano (2 polegadas) com pressão constante em passagens paralelas sobrepostas, seguida de passagens perpendiculares para obter uma camada fina e uniforme de resina (Figura 1B).
4. Remova cuidadosamente a camada de papel protetor, revelando o filme de resina distribuído uniformemente. Posicione a resina-parafilme diretamente sobre a superfície exposta do implante, garantindo alinhamento preciso com a interface implante-tecido (Figura 1C).
5. Aplique um rolo de junção de poliuretano do centro do implante para fora para eliminar bolhas de ar e garantir contato íntimo entre a resina e superfícies sintéticas e biológicas (Figura 1D).
6. Posição da fonte de luz UV LED de comprimento de onda de 405 nm a uma distância de 2–3 cm, diretamente na superfície do implante. Exponha por 90 segundos para garantir polimerização completa, verificada por avaliação tátil da dureza da resina e características não pegajosas (Figura 1E). Coloque uma cobertura protetora contra UV sobre a janela da câmara do criostato antes da fotopolimerização UV para proteger o operador da exposição prejudicial a UV durante o procedimento de cura com resina.

4. Recuperação de seção e preparação do slide

1. Remova o parafilme usando um único movimento contínuo para evitar a interrupção mecânica da interface resina-tecido. A adesão completa da resina é confirmada inspecionando a superfície exposta sob luz criostatica para verificar cobertura uniforme de resina, ausência de levantamento na borda do tecido e ausência de resíduos visíveis de parafilme.
2. Amostras de seção até uma espessura predeterminada de 8 μm usando um mecanismo calibrado de avanço de microtomo. Monitore cada seção para obter espessura consistente e ausência de artefatos (compressão, rasgamento, seções incompletas). Posicione a placa anti-rolagem de forma ideal para evitar que enrole (Figura 1F).
   NOTA: Deslizes adesivos hidrofílicos e carregados positivamente são usados porque proporcionam retenção superior de amostras desafiadoras, melhorando a aderência durante a transferência de seção e o processamento subsequente. Rótulo os slides individualmente antes da transferência da seção.
3. Posicione a superfície adesiva do deslizante, garantindo o contato inicial na borda da seção antes do contato progressivo em toda a área. Certifique-se de que a superfície de resina curada por UV adera à lâmina enquanto mantém a superfície do tecido para cima para imunofluorescência (Figura 1G).
4. Pressione suavemente o conjunto do ferrolho de seção para eliminar bolhas de ar. Verifique a orientação correta sob a iluminação criostatica, confirmando a interface intacta entre implante e tecido.

5. Armazenamento e preservação

1. Coloque slides completos em caixas de armazenamento pré-rotuladas a –20° C para aplicações que exigem processamento em até 72 horas.
2. Utilize condições de 80° C para períodos de preservação superiores a uma semana.

6. Protocolo de coloração por imunofluorescência

NOTA: Manuseie a pepsina com EPI adequado, pois é um irritante para a pele e respiratória.

1. Retirar as lâminas do armazenamento e transferir para câmaras de umidade por 15–20 minutos para equilíbrio à temperatura ambiente.
2. Realize três ciclos sequenciais de lavagem PBS de 2 minutos.
3. Coleta de antígeno:
   1. Método de recuperação de epítopos induzidos por calor (HIER): Posicionamento horizontal dos slides em recipientes seguros para micro-ondas com solução de recuperação 1x alvo. Micro-ondas (saída de 1000 watts) em alta potência, por 15 minutos, seguido de resfriamento até temperatura ambiente.
   2. Método de recuperação de epítopos induzida por proteolíticos (PIER): Aplique 100–150 μL de solução pronta para uso de pepsina por seção. Cubra com coberturas plásticas temporárias e incube a 37° C por 10 minutos em uma câmara umidificada.
4. Realize três ciclos sequenciais de lavagem PBS (2 min cada).
5. Aplique 1 mL de solução bloqueadora contendo 0,1% de saponina e 2,5% de soro normal de cabra em PBS. Incube por 30 minutos em temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
6. Realize três ciclos sequenciais de lavagem PBS (2 min cada).
7. Aplique soluções primárias de anticorpos de 100 μL em concentrações otimizadas:
   1. Anti-Colágeno IV coelho policlonal com diluição 1:100.
   2. Policlonal de coelho anti-laminina a 1:500 de diluição.
   3. Anticorpo monoclonal anti-F4/80 em diluição 1:500.
8. Cubra com coberturas plásticas temporárias e incube durante a noite a 4° C em câmaras umidificadas.
9. Realize três ciclos de lavagem PBS (2 min cada).
10. Aplique anticorpos secundários a uma concentração de 10 μg/mL.
    1. Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. Anti-Coelho Goat IgG Alexa Fluor 488
11. Incube por 60 minutos em temperatura ambiente em condições escuras.
12. Coloração opcional de aglutinina com germe de trigo (WGA):
    1. Aplique WGA-Alexa Fluor 647 a 5 μg/mL em PBS com 2,5% de soro normal de cabra.
    2. Cubra e incube a 37° C por 30 minutos. Realize três ciclos sequenciais de lavagem PBS de 2 minutos.
13. Aplique meio de montagem de endurecimento rígido de 80 μL com contra-tingimento nuclear por seção.
14. Cubra a cobertura com o vidro da cobertura para eliminar bolhas de ar.
15. Deixe as lâminas curarem horizontalmente em temperatura ambiente por 2 horas no escuro.
16. Armazene a 4° C por até uma semana para obter a melhor qualidade de imagem.

7. Microscopia de fluorescência e aquisição de imagens

1. Realize imagens usando um microscópio de fluorescência invertida com conjuntos de filtros do fabricante: excitação/emissão 360/460 nm, excitação/emissão 470/525 nm, excitação/emissão 545/605 nm, excitação/emissão 620/700 nm.
2. As imagens são capturadas selecionando cada canal de fluorescência no menu Filtro do software do microscópio. Antes da otimização da exposição, um procedimento de balanço de preto é realizado selecionando Ajustar Balanço de Preto para garantir uma correção precisa da linha de base para cada canal. Os parâmetros de exposição são então otimizados abrindo a janela de Captura de Imagem , ativando o modo Live e ajustando os controles de Exposição e Intensidade da Luz até que uma alta relação sinal-ruído seja alcançada sem saturação de pixels. A saturação é monitorada usando o display de histograma do software e a ferramenta Highlight Saturated Pixels . Cada canal é ajustado independentemente antes da aquisição da imagem.
3. Realize aquisição automatizada de tiles com a sobreposição de 10% do fabricante entre campos adjacentes. Mantenha o ajuste automático do foco durante toda a sequência de aquisição.

Results

Avaliação e otimização da qualidade das seções
Após a estabilização e separação com resina UV a 8 μm de espessura, colete as seções em lâminas adesivas e avalie o controle de qualidade. Seções de alta qualidade demonstram morfologia intacta sem fissuras significativas ou artefatos de fratura, com arquitetura contínua do tecido e uma interface implante-tecido preservada (Figura 2A). Seções que apresentam danos estruturais substanciais, inc...

Discussion

Este método de estabilização com resina curável por UV oferece uma abordagem alternativa para criosseção de amostras de tecido embutidas em OCT contendo materiais sintéticos que seriam difíceis de processar usando técnicas padrão de secção congelada. Embora existam diversas opções de adesivos, como lâminas carregadas, fitas de colagem de tecido e outros suportes adesivos, para ajudar a evitar que seções de tecido ou amostras frágeis se soltem durante o manuseio, esses produtos oferecem a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5W Luz Ultravioleta Gargalo 395&ntraço; 405 nm para cura com resina	Amazon	UPC & lrm; 603335835561
Anticorpo - Anti-F4/80 (Monoclonal)	Abcam	ab300421	1:500
Anticorpo - Colágeno IV (Policlonal)	Abcam	AB6586	1:100
Anticorpo - Donkey Anti-Rabbit IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 ug/mL
Anticorpo - Anti-Coelho IgG AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10 ug/mL
Anticorpo - Laminina (Policlonal)	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Limpo	Formlabs	FLBMCL01	Material biocompatível #1
BioMed Durável	Formlabs	FLBMDU01	Material biocompatível #2
Formalina 10% tamponada	Saúde Cardinal	C4320-101
BZ-X Filter Cy5	Keyence	OP-87766	Conjunto de Filtros
Filtro BZ-X DAPI	Keyence	OP-87762	Conjunto de Filtros
Filtro BZ-X GFP	Keyence	OP-87763	Conjunto de Filtros
Filtro BZ-X TRITC	Keyence	OP-87764	Conjunto de Filtros
Software de analisador BZ-X800	Keyence	BZ-X800	Software Integrado
Fisherbrand Premium Coverglass  50 x 24 mm	Fisher Scientific	12-544-14
Impressora 3D Form4B	FormLabs	F4B-Impressora
Tanque de resina Form4	Formlabs	RT-F4-01
Soro de Cabra	Gibco	16210064
Crióstato HM525 NX	Epredia	956641EC
Micro-ondas doméstico	Panasonic	NN-S766BA	Saída de 1000 watts
Coberturas plásticas IHC-Tek 24 mm x 60 mm	IHC World	IW-2601	Cobertura temporária
JDiction Resina UV de Baixa Viscosidade	Amazon	6974143904430	Alta autofluorescência
Keyence BZ-X800	Keyence	BZ-X800
Vamos Resinar Resina UV Tipo Duro Transparente	Amazon	ALR00038	Alta autofluorescência
Let's Resin Resina UV Transparente do Tipo Alta Viscosidade	Amazon	ALR00048
Slides de vidro Matsunami MAS Micro Slide	Oferta de Novos Chegados	SUMAS1190	Deslizante adesivo
Implante cirúrgico Medpor	Stryker	8662	Material biocompatível #3
Mr. Resina UV Resina Cristalina	Amazon	B08FRF9QTB	Alta autofluorescência
MX35 Ultra Microtome Blade	Epredia	3053835
Filme do Laboratório Parafilm M	Parafilm	P7543-1EA
Pepsin	Sigma	R2283-15ML
Soro tamponado com fosfato pH 7,4	Sigma	P3813
Plano Apo & lambda; 40X	Keyence	BZ-PA40	Lente Objetiva
Plano Apo & lambda; 4X	Keyence	BZ-PA04	Lente Objetiva
Rolo de Costura de Poliuretano	Amazon	682698799567
Montagem Antidesvanecimento de Vidro ProLong com Mancha NucBlue	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 Contra-tinção
Saponina	Millipore	558255-100GM
StainTray	Simport	M920-2
Revestimento de silicone estéril	Bentec	PR72034-51N
Solução de Recuperação de Alvo, Citrato pH6	Agilent	S236984-2
Composto Tec-Tecido Tecido (Composto O.C.T)	Sakura	4583
Aglutinina do Germe de Trigo AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5 ug/mL