Visualização tridimensional dos vasos linfáticos na pele humana e suas mudanças estruturais durante o linfedema

Resumo

Aqui, uma visualização tridimensional da estrutura dos vasos linfáticos na pele humana foi realizada usando microscopia confocal ou de folha de luz após a aplicação de três técnicas distintas de limpeza de tecidos. A combinação desses métodos com coloração imunohistoquímica fornece insights sobre alterações funcionais nos vasos linfáticos durante a progressão do linfedema.

Resumo

Os vasos linfáticos da pele, compostos por capilares e vasos coletores, desempenham papéis fundamentais na remoção de resíduos e respostas imunológicas, sendo essenciais para a manutenção da homeostase tecidual. No entanto, a pele humana, com suas três camadas — epiderme, derme e gordura subcutânea — contém uma matriz extracelular densa rica em colágeno, de modo que visualizar redes linfáticas em três dimensões é desafiador. Para abordar essa limitação, este artigo apresenta três métodos distintos, cada um adaptado a moléculas específicas de interesse e objetivos experimentais, para a visualização tridimensional de linfáticos da pele humana usando reagentes de limpeza de tecidos em combinação com microscopia confocal ou de folha de luz. Ao direcionar moléculas de junção aderens em células endoteliais linfáticas por meio da imunohistoquímica, alterações estruturais com claras implicações funcionais, particularmente a característica remodelação semelhante a botão a zíper das junções capilares, foram avaliadas em tecidos de pele derivados de pacientes com linfedema secundário. Essa técnica de visualização tridimensional revela estruturas vasculares que não são discerníveis por meio da análise histológica convencional de seções de tecido, aprimorando assim a compreensão da estrutura e função dos vasos linfáticos.

Introdução

Há um interesse crescente na função dos vasos linfáticos desde o reconhecimento de seu papel na manutenção da homeostase cutânea, além de seu envolvimento bem estabelecido na metástase do câncer ^1,2. Os vasos linfáticos são estruturalmente divididos em capilares e vasos coletores, cada um possuindo características distintas. Capilares linfáticos consistem em uma estrutura de camada única formada por células endoteliais linfáticas e servem como locais iniciais de coleta para fluidos intersticiais, resíduos e células imunológicas. Em contraste, os vasos linfáticos coletores possuem uma estrutura em duas camadas com células musculares lisas ao redor da camada endotelial linfática, permitindo o transporte ativo do líquido linfático coletado pela rede capilar em direção à circulação^{central 3}. Modelos de camundongos foram utilizados para elucidar as características estruturais, especialmente dos vasos linfáticos brônquicos, e mostraram como condições inflamatórias induzem remodelação^{estrutural 4}. Trabalhos anteriores demonstraram que a inflamação induzida pelo ultravioleta causa dilatação anormal dos capilares linfáticos, o que compromete sua função de coleta de fluidos. Os mecanismos moleculares subjacentes a essa disfunção foram identificados, mostrando especificamente que o aumento da expressão de VEGF-A aliado à diminuição da expressão de VEGF-C impulsiona essas alterações^{estruturais 5,6,7}.

Embora técnicas de visualização tridimensional tenham avançado significativamente a compreensão da rede linfática em modelos de^{camundongos 8,9}, a análise estrutural comparável dos vasos linfáticos humanos continuou desafiadora. Essa lacuna analítica surge das dificuldades de trabalhar com tecidos humanos, incluindo a disponibilidade limitada de amostras e as questões técnicas envolvidas na obtenção de imagens tridimensionais abrangentes. Em particular, a pele, caracterizada por uma estrutura de três camadas composta pela epiderme, derme e gordura subcutânea, funcionando como barreira ao ambiente externo, apresenta desafios maiores do que outros órgãos moles. Além disso, a pele humana apresenta desafios analíticos distintos em relação aos modelos de camundongos, incluindo maior espessura de tecido, dificultando a penetração profunda por imagem. Além disso, os abundantes componentes da matriz extracelular, especialmente o colágeno, juntamente com suas alterações estruturais relacionadas à idade, criam barreiras ópticas que reduzem a eficácia das técnicas emergentes de limpeza de tecidos que revolucionaram a imagem linfática em^{camundongos 10}.

Diversos agentes de limpeza de tecidos foram previamente testados para visualizar capilares da pele humana, demonstrando sua compatibilidade^{tecidual 11}. Após esse trabalho, reagentes de limpeza de tecidos foram usados com sucesso para visualizar vasos linfáticos da pele humana em três dimensões¹². Ao focar nas junções aderentes das células endoteliais linfáticas, foram identificadas alterações estruturais nos vasos linfáticos associadas à progressão do^{linfedema 13}. O objetivo deste artigo é descrever em detalhes os procedimentos para visualização tridimensional dos vasos linfáticos da pele humana usando combinações de três técnicas de limpeza da pele, juntamente com microscopia confocal e microscopia de folha de luz, e coloração imuno-histoquímica adaptada a objetivos específicos de pesquisa. Neste estudo, embora nos concentremos exclusivamente em tecidos frescos de pele humana que foram corrigidos no dia da excisão e não passaram por ciclos de congelamento e descongelamento, essas técnicas fornecem insights não apenas sobre as mudanças estruturais dos vasos linfáticos durante a doença e o envelhecimento, mas também sobre as alterações funcionais associadas.

Protocolo

Amostras de pele de indivíduos humanos foram coletadas no Hospital Universitário de Chiba (Chiba, Japão). Todos os procedimentos envolvendo sujeitos humanos foram aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional do Hospital Universitário de Chiba e pelo Centro Global de Inovação Shiseido, e todos os sujeitos forneceram consentimento informado por escrito. Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Pré-tratamento de amostras de pele humana

1. Remover o tecido subcutâneo dos espetáculos excisados após a aquisição.
   NOTA: O intervalo entre a excisão e a aquisição da pele foi aproximadamente h. Durante o transporte, o tecido era imerso em DMEM e mantido em bolsas de gelo.
2. Coloque as amostras com o lado epidérmico para baixo em uma placa quente a 60 °C por 45 segundos para separar a epiderme da derme.
3. Imerga imediatamente os espécimes em PBS gelado.
4. Separe a epiderme e a derme usando uma pinça.
5. Fixe as partes dérmicas com paraformaldeído a 4°C por 16 horas e, em seguida, lave com PBS antes do uso.
   NOTA: Após a fixação, as amostras foram armazenadas em PBS a 4 °C, e as etapas de imunocoloração foram iniciadas em poucos meses.
   ATENÇÃO: A solução PFA é tóxica. Toda preparação e manuseio devem ser realizados em uma exaustão de fumo, enquanto se usa o equipamento de proteção individual adequado.

2. Imunocoloração de montagem completa combinada com reagentes de limpeza

1. Técnica iDISCO
   1. Aparar os exemplares para aproximadamente 5 mm × 5 mm × 5 mm de tamanho.
   2. Transfira as amostras para 5% Triton X-100 e 2,5% Tween 20 em PBS em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 24 °C por 16 horas para permeabilização.
   3. Lave as amostras com PBS a 24 °C por 1 hora, repetindo o processo três vezes.
   4. Imerga as amostras no tampão de bloqueio A recém-preparado (1% BSA, 0,1% Tween 20, 0,03% azida de sódio em PBS) em um shaker orbital ajustado para 50 rpm a 24 °C por 72 horas.
   5. Incubar as amostras com anticorpo primário contra podoplanina (1:100) em um buffer de bloqueio A em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 37 °C por 72 horas.
   6. Lave as amostras com o tampão de lavagem A (0,1% Tween-20 em PBS) a 24 °C por 1 hora, repetindo o processo três vezes. Em seguida, mantenha as amostras em buffer de lavagem A em um shaker orbital ajustado para 50 rpm a 4 °C por 72 horas.
   7. Incube as amostras com anticorpo secundário contra IgG de camundongos conjugado com Alexa Fluor 647 (1:1000) em um buffer de bloqueio A em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 37 °C por 72 horas.
   8. Repita o passo 1.6.
   9. Incube as amostras com 50% de MeOH a 24 °C por 3 horas.
   10. Incube as amostras com 70% de MeOH a 24 °C por 3 horas.
   11. Incube as amostras com 100% de MeOH a 24 °C por 16 horas.
   12. Incube as amostras com diclorometano a 24 °C por 15 minutos, repetindo o processo duas vezes.
   13. Limpe as amostras com éter dibenzílico a 24 °C por 16 horas.
       NOTA: Se o tecido não tiver ficado transparente neste ponto, esperar ainda mais não resultará em melhora significativa.
   14. Capture imagens dos espasmes com um microscópio de folha de luz.
       NOTA: Use uma Folha de Luz com um objetivo EC Plan-Neofluar 5×/0.16; ajuste a iluminação (excitação) em 63 nm e a detecção em 648 nm; adquirir uma pilha Z com tamanho de passo de 5,8 μm.
       ATENÇÃO: Metanol, diclorometano e éter dibenzílico são perigosos. Toda preparação e manuseio devem ser realizados em uma exaustão de fumo, enquanto se usa o equipamento de proteção individual adequado.
2. Reagente Rapiclear 1.52
   1. Aparar os exemplares para aproximadamente 5 mm × 5 mm × 2 mm de tamanho.
   2. Transfira as amostras para 2% de Triton-X 100 em PBS em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 24 °C por 16 horas para permeabilização.
   3. Imerga as amostras no buffer bloqueador B recém-preparado (soro de burro 5% e 1% Triton-X 100 em PBS) em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 4 °C por 16 horas.
   4. Incubar as amostras com anticorpos primários contra podoplanina e VE-cadherina (ambos a 1:100) em um tampão bloqueante B em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 4 °C por 72 horas.
   5. Lave as amostras com o tampão de lavagem B (3% de NaCl e 0,2% de Triton-X 100 em PBS) a 24 °C por 1 hora, repetindo o processo três vezes. Depois, mantenha as amostras no buffer de lavagem B em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 4 °C por 16 horas.
   6. Lave as amostras com PBS a 24 °C por 1 hora.
   7. Incubar as amostras com anticorpos secundários contra IgG de camundongo e IgG de coelho, conjugados a Alexa Fluor 647 e 568, respectivamente (ambos a 1:1000), em buffer de bloqueio B em um shaker orbital ajustado para 50 rpm a 4 °C por 16 horas.
   8. Repita os passos 1,5. e 1.6.
   9. Limpe as amostras com pelo menos 5 vezes o volume da amostra de Rapiclear 1,52 a 24 °C por 16 horas.
      NOTA: A limpeza das regiões periféricas do tecido foi observada em menos de 1 hora.
   10. Inglobar as amostras limpas em uma câmara de gel de polidimetilsiloxano colocada sobre um engobe de cobertura com o reagente Rapiclear 1.52 fresco.
   11. Fotografe os espetáculos com um microscópio confocal.
       NOTA: Use um microscópio confocal com um objetivo Plan-Apochromat 10×/0,45 M27; ajustar excitação em 633 nm e 561 nm, e alcance de detecção 641-754 nm e 566-628 nm, com um detector GaAsP; adquirir uma pilha Z com tamanho de passo de 3,15 μm.
3. Técnica CUBIC
   1. Podar os exemplares para aproximadamente 5 mm × 5 mm × 3 mm de tamanho.
   2. Imerga as amostras em 50% CUBIC-L a 24 °C por 24 horas como pré-tratamento para delipidação.
   3. Transfira as amostras para 100% CUBIC-L em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 37 °C por 7 dias para deslipidação.
   4. Lave as amostras com PBS em temperatura ambiente por 24 horas.
   5. Imerga as amostras em um buffer de bloqueio recém-preparado A em um shaker orbital ajustado para 50 rpm a 24 °C durante 72 horas.
   6. Incubar as amostras com anticorpo primário contra VE-cadherina, podoplanina e CD31 (1:100, 1:100 e 1:200, respectivamente) no buffer de bloqueio A em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 37 °C por 72 horas.
   7. Lave as amostras com o tampão de lavagem A a 24 °C por 1 hora. Repita o processo três vezes e depois mantenha as amostras no buffer de lavagem A em um shaker orbital ajustado para 50 rpm a 4 °C por 72 horas.
   8. Incubar os espécimes com anticorpos secundários contra IgG de camundongo, IgG de coelho e IgG de ovelha, conjugados a Alexa Fluor 647, 568 e 488, respectivamente (todos a 1:1000), em buffer de bloqueio A em um agitador orbital ajustado para 50 rpm a 37 °C por 72 horas.
   9. Repita o passo 3.7.
   10. Pré-limpe as amostras com 50% CUBIC-R+(M) a 24 °C por 16 horas.
   11. Limpe as amostras com 100% CUBIC-R+(M) a 24 °C por 16 horas.
       NOTA: Se o tecido não tiver ficado transparente neste ponto, esperar ainda mais não resultará em melhora significativa.
   12. Fotografe os espetáculos com um microscópio confocal.
       NOTA: Use um microscópio confocal com um objetivo Plan-Apochromat 20×/0,8 M27; ajustar excitação em 633 nm, 561 nm e 488 nm, e alcance de detecção 641-754 nm, 566-628 nm e 479-550 nm, com um detector GaAsP; adquirir uma pilha Z com tamanho de passo de 0,78 μm.

Resultados

Diferença na transmissão da luz de tecido de pele humana limpa com e sem epiderme
A Figura 1 mostra fotografias representativas de amostras de pele humana com e sem epiderme, após permeabilização e limpeza com o reagente Rapiclear 1.52. A remoção epidérmica aumenta a transparência dos tecidos ao eliminar a melanina, um potente absorvedor de luz, como confirmado pela visibilidade aumentada da linha preta sob as amostras.

Discussão

A visualização tridimensional das redes linfáticas em tecidos biológicos é de importância crítica para compreender suas características estruturais e funções fisiológicas, bem como alterações patológicas. Este protocolo apresenta três métodos distintos de limpeza de tecidos otimizados para tecido de pele humana, cada um adaptado para objetivos observacionais específicos.

A remoção epidérmica é considerada um passo crítico para eliminar a melanina, que reduz a ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-CD31	R& Sistemas D	AF806	diluição em 1:200
Anticorpo anti-Podoplanina	Dako	M3619	diluição em 1:100
Anticorpo anti-VE-cadherina	Tecnologia de Sinalização Celular	#2500	diluição em 1:100
CUBIC-L	Indústria Química de Tóquio	T3740
CUBIC-R+(M)	Indústria Química de Tóquio	T3741
DMEM, glicose baixa, piruvato	Thermo Fisher SCIENTIFIC	11885084
Anticorpo secundário anti-rato Donkey IgG (H+L) altamente adsorvido cruzadamente, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-31571	diluição em 1:1000
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorbido Cruzado, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A10042	diluição em 1:1000
Anti-Ovelha Anti-Ovina Anti-Ovelha Anti-Adsorvido Secundário Cruzado, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher SCIENTIFIC	A-11015	diluição em 1:1000
Rapiclear 1.52	Laboratório Sunjin	RC152001
Microscópio ZEISS Lightsheet Z.1	Carl Zeiss
Microscópio Confocal de Varredura a Laser ZEISS LSM 880	Carl Zeiss