1. Taxonomia e características do gênero Nocardia
- Sistema de classificação da Nocárdia
De acordo com o sistema de classificação mais recente, as Nocardia spp. atualmente compreendem 109 espécies válidamente nomeadas, das quais aproximadamente metade são consideradas clinicamenterelevantes. A taxonomia da Nocardia está em constante evolução, e a aplicação do sequenciamento do gene 16S rRNA, análise de sequência multilocus (MLSA) e sequenciamento do genoma inteiro (WGS) refinou significativamente a classificação e identificação desse gênero1˒10.
A prevalência de espécies específicas de Nocardia varia substancialmente dependendo da metodologia de identificação, apresentação clínica e regiãogeográfica 1. Quando técnicas moleculares como MLSA são aplicadas, Nocardia cyriacigeorgica e Nocardia farcinica emergem como as espécies mais prevalentesno total: 1˒3˒4. Notavelmente, muitos isolados anteriormente relatados como asteroides de Nocardia foram reclassificados como N. cyriacigeorgica com base na caracterizaçãomolecular 1. Em contraste, Nocardia brasiliensis é o agente predominante da nocardiose cutânea primária e do actinomicectoma nocárdico, em vez de uma espécie universalmente prevalente em todas as síndromesclínicas 1. Outras espécies clinicamente relevantes comumente encontradas incluem Nocardia nova, Nocardia otitidiscaviarum, Nocardia veterana e membros do complexo Nocardia transvalensis 1˒3.
Fatores geográficos e o status imune do hospedeiro também influenciam significativamente a distribuição das espécies. Por exemplo, N. brasiliensis é mais frequentemente relatada em regiões tropicais e subtropicais, enquanto N. farcinica e N. cyriacigeorgica são comumente identificadas em climastemperados 1˒3. Em pacientes imunocomprometidos, certas espécies como N. farcinica e N. cyriacigeorgica estão associadas a infecções disseminadas mais graves2˒6.
A identificação precisa das espécies é fundamental para desenvolver estratégias de tratamento eficazes, pois diferentes espécies de Nocardia exibem perfis distintos de suscetibilidade antimicrobiana. Por exemplo, N. farcinica é intrinsecamente resistente a muitos β-lactâmicos11, enquanto N. brasiliensis frequentemente apresenta menor suscetibilidade a carbapenêmicos3˒4. Assim, a identificação precisa das espécies orienta diretamente a terapia antimicrobiana adequada e melhora os resultados clínicos.
- Características biológicas de Nocardia
Nocardia spp. são bactérias filamentosas ramificadas Gram-positivas, com forte capacidade de se adaptar a vários nichos, permitindo que sobrevivam sob diversas condiçõesambientais 12. Essas bactérias normalmente formam colônias filamentosas e produzem colônias características "calcárias" ou "enrugadas" em meio ágarico (Figura 1). Nocardia cresce lentamente, geralmente exigindo de vários dias a semanas de incubação para crescimento visível. Além disso, as espécies de Nocardia podem utilizar diversas fontes de carbono, demonstrando forte diversidade metabólica, o que permite a sobrevivência em uma ampla variedade de ambientesnaturais 13.
- Características infecciosas de Nocardia
Infecções por nocárdia tipicamente se apresentam como infecções pulmonares, infecções de pele ou doenças sistêmicas e são mais comuns em pacientesimunocomprometidos 2˒14. Clinicamente, as manifestações são diversas e podem incluir tosse, febre e dificuldade respiratória. As infecções podem evoluir rapidamente para doença pulmonar grave ou sepse. Em alguns casos, infecções por Nocardia também podem causar abscessos cerebrais ou outras infecções do sistema nervoso central, especialmente em pacientes imunossuprimidos15. Portanto, a identificação precoce e o tratamento rápido são fundamentais para melhorar o prognóstico do paciente.
- Características epidemiológicas das infecções por Nocardia
Estudos epidemiológicos mostram variação geográfica significativa nas infecções por Nocardia . A incidência global é relativamente baixa, mas aumenta significativamente em populações de alto risco, como indivíduos infectados pelo HIV e receptores de transplante de órgãos. Por exemplo, a incidência de infecções por Nocardia em receptores de transplante renal é de aproximadamente 0,4%–1,3%, enquanto em recipientes de transplante de pulmão pode chegar a 9%16˒17.
Análises de suscetibilidade em diferentes populações indicam que pacientes que recebem terapia imunossupressora de longo prazo são mais propensos a infecções por Nocardia , que estão intimamente associadas a uma função imunológicacomprometida 2. Além disso, fatores de exposição ambiental, como contato com o solo e inalação de poeira, são considerados aumentar o risco de infecção por Nocárdia , especialmente entre indivíduos que vivem ou trabalham em ambientes de altorisco 18.
2. Avanços nas técnicas de identificação molecular para Nocardia spp.
- Sequenciamento do gene rRNA 16S
Devido ao processo complexo e demorado de cultivar e isolar Nocardia, a introdução da tecnologia de PCR melhorou significativamente a velocidade e a precisão do diagnóstico. Laurent et al. demonstraram que a amplificação do gene 16S rRNA usando primers específicos poderia identificar rapidamente Nocardia a partir de isolados cultivados, lançando as bases para sua aplicação em microbiologiaclínica 19. Posteriormente, foi relatada a detecção direta de Nocárdia em amostras clínicas usando PCR de 16S rRNA, embora sua sensibilidade permaneça variável e exija suspeita clínicaprévia de 20˒21.
Estudos comparativos diretos mostraram que a qPCR específica para Nocardia, direcionada ao gene 16S rRNA, proporciona maior sensibilidade e tempo de resposta mais curto do que a cultura convencional em amostras clínicas, incluindo fluido de lavagem broncoalveolar, escarro, pus e amostras de tecido. Couble et al. relataram sensibilidade de 88% e especificidade de 98% para qPCR direto de Nocardia , com resultados disponíveis em poucas horas, enquanto a cultura pode exigir dias a semanas deincubação 22. Ding et al. confirmaram ainda que a PCR do gene rRNA 16S pode ser aplicada diretamente a amostras clínicas para detecção de Nocárdia , permitindo identificação rápida mesmo em casos negativos em cultura e compensando efetivamente as limitações da culturatradicional 21.
Esse método confirma efetivamente a infecção nocárdica, mas, como abordagem direcionada, requer suspeita clínica prévia. Apesar de sua alta precisão para identificação em nível de gênero, a alta conservação do gene 16S rRNA representa desafios para distinguir espécies próximas de sangue, como aquelas dentro do complexo Nocardia asteroides 10,21. Essa limitação reflete uma resolução reduzida em nível de espécie, em vez de uma baixa precisão geral. Portanto, os resultados do sequenciamento frequentemente exigem validação cruzada com outros métodos, como análise de sequência multilocus (MLSA) ou sequenciamento do genoma inteiro (WGS), para alcançar resolução definitiva em nível de espécie23˒24.
- Análise de sequência multilocus (MLSA)
MLSA é uma técnica molecular com valor significativo de aplicação na identificação e tipagem de espéciesbacterianas 23. Para gêneros complexos como Nocardia, o MLSA permite uma identificação mais precisa de espécies ao analisar informações de sequência de múltiplos genes conservados. Estudos demonstraram que o MLSA pode diferenciar efetivamente entre várias espécies de Nocardia , especialmente aquelas morfologicamente e fisiologicamentesemelhantes 25. Por exemplo, um estudo identificou 14 espécies diferentes de Nocardia ao sequenciar quatro genes (por exemplo, gyrB, hsp65, secA1 e 16S rRNA), destacando a eficiência e precisão doMLSA 25. Além disso, o MLSA pode revelar diversidade genética e apoiar investigações epidemiológicas. Também facilita o acompanhamento da transmissão e variação da cepas, fornecendo dados importantes para o monitoramento e controle da infecção.
No entanto, o MLSA é intensivo em mão de obra, custoso e não possui limiares de corte universais, limitando sua aplicação clínica rotineira. Como observado por Traxler et al., o MLSA não é adequado para uso rotineiro devido a essasrestrições 1. Portanto, o papel principal do MLSA na prática atual é limitado a ambientes de pesquisa, incluindo investigações epidemiológicas, tipagem de cepas e estudos taxonômicos. Para identificação clínica rotineira, a MALDI-TOF MS é preferida devido à sua rapidez, baixo custo e facilidade de uso. Quando é necessária maior resolução — como para identificação definitiva de espécies, detecção de genes de resistência ou análise filogenética — o sequenciamento do genoma completo (WGS) oferece capacidades superiores. Estudos recentes usando WGS não apenas distinguiram espécies conhecidas de Nocardia com alta resolução, mas também permitiram a identificação de espécies potenciais novas, superando as capacidades do MLSAsozinho 24. O WGS, portanto, emergiu como uma alternativa mais poderosa, oferecendo maior resolução e capacidade analíticaaprimorada 9.
- Aplicação e desafios do MALDI-TOF MS
A espectrometria de massas de ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) tornou-se cada vez mais difundida em microbiologia, especialmente para identificação rápida de patógenos, demonstrando valor clínicosignificativo 26. Essa tecnologia analisa espectros de proteínas microbianas para fornecer identificação precisa em nível de espécie ou complexo em pouco tempo. Por exemplo, estudos relataram uma precisão de identificação de 97,3% para espécies de Nocardia em amostras clínicas noJapão 27.
Apesar do desempenho forte, desafios permanecem. A precisão da identificação em nível de espécie pode variar dependendo da versão do banco de dados e do número de espéciestestadas 23. Bancos de dados atualizados demonstraram melhorar a proporção de isolados que alcançam identificação confiável em nível de gênero (pontuação >1,7) de 77,6% para 94,7%, destacando a importância de atualizações regulares de bancos de dados. A identificação em nível de espécie normalmente exige limiares de pontuação mais altos (por exemplo, >2,0).
MALDI-TOF MS oferece identificação rápida (tipicamente <10 minutos por isolado após o crescimento da colônia), baixo custo por teste (US$ 1–5 por amostra) e complexidade técnica mínima, tornando-o ideal para laboratórios de microbiologia clínica de linha de frente. No entanto, as limitações incluem o alto custo inicial do instrumento e a necessidade de bancos de dados espectrais abrangentes e regularmente atualizados para manter a precisão em nível de espécie.
- Avanços no sequenciamento do genoma completo (WGS)
O sequenciamento do genoma inteiro (WGS) está demonstrando cada vez mais vantagens significativas na identificação microbiana, fornecendo informações genômicas abrangentes e possibilitando a análise filogenética, oferecendo assim insights sobre as relações evolutivasbacterianas 28. Estudos mostraram que a WGS permite a caracterização detalhada da diversidade genética e da estrutura populacional de Nocardia24.
A viabilidade de implementar o WGS em laboratórios clínicos está melhorando. Por exemplo, o WGS pode identificar variantes emergentes e fornecer dados para monitoramento de resistênciaantimicrobiana 29. No entanto, apesar de sua alta precisão e produção abrangente, a adoção generalizada continua limitada pelos altos custos e pela complexidade da análise de dados.
Embora o WGS esteja se tornando um método de referência, barreiras como custo, complexidade operacional e requisitos de infraestrutura permanecem. Na maioria dos laboratórios clínicos, o WGS é impraticável para diagnósticos rotineiros devido aos custos (US$ 100–300 por isolado), tempos de resposta (3–7 dias), necessidade de infraestrutura avançada em bioinformática e expertise especializada. Atualmente, seu uso é amplamente restrito a laboratórios de referência e investigações de surtos.
- Sequenciamento metagenômico de próxima geração (mNGS)
O sequenciamento metagenômico de próxima geração (mNGS) introduziu novas possibilidades para detectar Nocardia30. Métodos tradicionais de cultura frequentemente enfrentam desafios devido ao crescimento lento e às necessidades ambientais específicas da Nocardia, levando a diagnósticos atrasados. Nesse contexto, o mNGS surgiu como uma alternativa valiosa.
Diversos relatos de casos e estudos em pequena escala demonstraram o potencial da mNGS para a detecção de Nocardia 31. Por exemplo, a mNGS tem sido usada para diagnosticar infecção cutânea por Nocardia , identificando rapidamente o patógeno em pacientesimunocompetentes 32. Da mesma forma, em infecções de ouvido, nariz e garganta, a mNGS identificou N. farcinica, permitindo o tratamentodirecionado 33. Em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica, a análise mNGS de amostras respiratórias identificou com sucesso N. otitidiscaviarum, melhorando a pontualidade e a precisãodiagnósticas 34. Além disso, a mNGS pode detectar infecções mistas, como demonstrado em casos em que tanto N. farcinica quanto outros patógenos foramidentificados 30.
No entanto, esses achados baseiam-se em grande parte em relatos de casos ou pequenas coortes e exigem validação em estudos maiores e prospectivos. Portanto, as conclusões sobre o desempenho diagnóstico da mNGS para Nocardia devem ser interpretadas com cautela, e a tecnologia permanece como uma ferramenta complementar, e não como um método diagnóstico de primeira linha.
Apesar de seu potencial, o mNGS apresenta várias limitações importantes. O alto custo (US$ 500–1.500 por amostra) e a disponibilidade limitada restringem seu uso a centros especializados ou casoscomplexos 7˒31. A falta de protocolos padronizados contribui para a variabilidade no desempenho7˒30. A interpretação é desafiadora devido à dificuldade em distinguir infecção verdadeira de colonização ou contaminação, especialmente em amostrasrespiratórias 30˒31˒35. Além disso, a mNGS não fornece dados de suscetibilidade a antimicrobianos, que são fundamentais para orientar a terapia1˒4. Por fim, a importância clínica das sequências de baixa abundância permanece incerta, e faltam limiares padronizadosde relato 7˒31.
No geral, a mNGS representa uma ferramenta diagnóstica auxiliar valiosa, especialmente em pacientes complexos ou gravemente graves, quando os métodos convencionais são inconclusivos. No entanto, não deve ser considerado uma solução diagnóstica universal, e os resultados devem ser interpretados junto com achados clínicos, radiográficos e microbiológicos.
- Exploração de métodos diagnósticos moleculares emergentes
Com os avanços na biologia molecular, abordagens diagnósticas emergentes estão sendo exploradas para a detecção da Nocardia . Tecnologias de detecção baseadas em CRISPR permitem a identificação rápida de sequências genéticas específicas com altasensibilidade 36. Além disso, abordagens de aprendizado de máquina e inteligência artificial (IA) introduziram novas possibilidades para a triagem rápida do Nocardia37.
No entanto, esses achados são derivados de estudos de pequena escala de prova de conceito e devem ser interpretados com cautela. Atualmente, nenhuma dessas abordagens foi clinicamente validada para a detecção rotineira de Nocárdia . Ensaios baseados em CRISPR podem eventualmente evoluir para ferramentas rápidas e de baixo custo no ponto de atendimento, mas isso exigirá validação clínica extensa. Da mesma forma, a análise de imagens assistida por IA mostrou potencial preliminar para triagem, mas carece de protocolos padronizados e avaliação prospectiva. Ambas as abordagens ainda estão em desenvolvimento inicial e ainda não são recomendadas para uso clínico. Estudos futuros devem focar na validação multicêntrica, padronização e demonstração da utilidade clínica antes que esses métodos possam ser adotados na prática rotineira.
Para facilitar a comparação, as principais características de desempenho, restrições práticas e papéis clínicos recomendados desses métodos são resumidos na Tabela 1.
3. Teste de suscetibilidade antimicrobiana (AST) de Nocardia spp.
- Mecanismos de resistência da Nocárdia
Os mecanismos de resistência das espécies de Nocardia incluem principalmente mutações gênicas, produção de enzimas e formação debiofilmes. Muitas espécies de Nocardia, particularmente N. farcinica e N. cyriacigeorgica, demonstraram resistência a múltiplosantibióticos 38. Por exemplo, a resistência a sulfonamidas em Nocardia spp. está associada a mutações no gene da dihidrofolato redutase, resultando em diminuição da suscetibilidade ao trimetoprim–sulfametoxazol (TMP-SMX)39,40,41.
Além disso, espécies de Nocardia podem produzir β-lactamases e outras enzimas que degradam antibióticos, levando à resistência a penicilinas e cefalosporinas42. Esses mecanismos de resistência complicam o tratamento das infecções por Nocardia , especialmente em populações de alto risco, onde o surgimento de cepas resistentes agrava ainda mais os desafios terapêuticos. Os principais mecanismos de resistência identificados nas espécies de Nocardia são resumidos na Tabela 2, incluindo genes específicos de resistência, tipos de mutação e dados quantitativos de suscetibilidade.
- Teste tradicional de suscetibilidade a antimicrobianos
Os métodos tradicionais de teste de suscetibilidade antimicrobiana incluem principalmente técnicas de microdiluição e difusão de ágar. O método da microdiluição é considerado o mais confiável para determinar a suscetibilidade antimicrobiana da Nocardia, fornecendo valores precisos de concentração mínima inibitória (CMI)43.
Apesar de ser o método de referência, a microdiluição do caldo para Nocárdia está sujeita a variabilidade significativa entre e dentro do laboratório. Fatores como preparação do inóculo, escolha do meio de cultivo, tempo de incubação e dificuldades na interpretação dos pontos finais devido ao crescimento residual ou baixa turbidez podem afetar a reprodutibilidade35˒43. Esses desafios técnicos são particularmente relevantes para organismos de crescimento lento e heterogêneos, como a Nocardia , e ressaltam a importância dos protocolospadronizados 1.
Em um estudo, 146 cepas de Nocardia foram testadas por microdiluição, mostrando alta suscetibilidade a linezolíde, amikacina e TMP-SMX, com taxas de 100%, 96% e 94%, respectivamente4˒44. No entanto, esses dados se originam de uma única região geográfica (Japão) e não devem ser generalizados sem cautela. Os perfis de resistência aos antimicrobianos da Nocardia variam substancialmente conforme a região geográfica, influenciados pelos padrões locais de uso de antibióticos e pela espéciecirculante 1˒3. O método de difusão de ágar também é amplamente utilizado para testes de suscetibilidade em Nocardia. No entanto, sua precisão é influenciada por fatores como meio de cultura, densidade de inóculo e a lenta taxa de crescimento da Nocardia, que pode resultar em zonas de inibição poucodefinidas 1˒43. Diferentemente da microdiluição do caldo, a difusão de ágar não foi padronizada para Nocardia pelo Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais (CLSI) e deve ser considerada um método de triagem, e não uma técnica de referência.
Embora os métodos tradicionais continuem eficazes na prática clínica, o aumento da diversidade e resistência entre as espécies de Nocardia levou a um interesse crescente em integrar métodos de detecção molecular para fornecer uma avaliação mais abrangente. O método de microdiluição continua sendo o padrão ouro para testes de suscetibilidade a antimicrobianos; no entanto, depende da taxa de crescimento bacteriano, o que pode ser problemático para espécies de crescimento lento, como Nocardia. O método de difusão em disco é mais conveniente, mas menos sensível para esses organismos. Técnicas moleculares, incluindo a detecção de genes de resistência por PCR, oferecem alternativas rápidas, mas permanecem suplementares e não podem substituir os testes fenotípicos.
- Aplicação de métodos de detecção molecular
Com os avanços na biologia molecular, os métodos de detecção molecular são cada vez mais usados para complementar abordagens fenotípicas tradicionais de identificação, enquanto seu papel nos testes de suscetibilidade antimicrobiana permanece uma área ativa de pesquisa, focada principalmente na detecção de genes específicos deresistência 35.
Por exemplo, o sequenciamento do gene 16S rRNA e o MLSA podem diferenciar espécies de Nocardia e fornecer insights sobre genes de resistênciaassociados 21. O sequenciamento do genoma inteiro (WGS) permite uma análise genômica abrangente, oferecendo insights mais profundos sobre composição genética e mecanismosde resistência 24˒28. Alguns estudos identificaram vários genes β-lactamase em N. farcinica11, que estão intimamente associados à resistência aantibióticos 38.
O sequenciamento metagenômico de próxima geração (mNGS) também demonstra vantagens na identificação de cepas resistentes. Em alguns casos, a mNGS pode identificar espécies de Nocardia e fornecer informações relacionadas à resistência, apoiando a seleção de antibióticos e reduzindo tratamentos inadequados devido ao diagnósticoincorreto 30.
No entanto, o entendimento atual das correlações genótipo–fenótipo na Nocardia permanece incompleto, e muitos determinantes da resistência permanecem pouco caracterizados. Portanto, as abordagens moleculares não podem substituir o teste fenotípico de suscetibilidade atualmente. Eles servem como ferramentas complementares para apoiar a interpretação de resultados baseados em cultura e podem orientar a terapia direcionada quando genes de resistência bem caracterizados são detectados. As decisões clínicas devem continuar a depender principalmente dos resultados fenotípicos de AST, especialmente dada a variabilidade geográfica nos padrões de resistência e a falta de critérios interpretativos padronizados para métodos moleculares.
4. Desafios clínicos na identificação da Nocardia e testes de suscetibilidade a antimicrobianos
Espécies de Nocardia são patógenos oportunistas que podem causar infecções graves, especialmente em pacientes imunocomprometidos1˒46. Embora essas infecções sejam relativamente raras, sua alta morbidade e mortalidade apresentam desafios significativos para o diagnóstico e tratamento clínico. O diagnóstico preciso da nocardiose começa antes dos testes laboratoriais, com fatores pré-analíticos desempenhando um papel crítico no sucesso tanto dos métodos baseados em cultura quanto moleculares. A qualidade da amostra influencia diretamente as taxas de detecção; amostras respiratórias profundas, como lavagem broncoalveolar (BAL), escarro induzido ou biópsias, apresentam taxas de recuperação maiores do que o escarro expectorado. As condições de transporte são igualmente importantes, pois as espécies de Nocardia são exigentes e podem ser tomadas pela flora comensal, caso os exemplares sejam atrasados ou armazenados de forma inadequada. Tempos prolongados de transporte (>2 h) sem um meio adequado podem comprometer a viabilidade e reduzir o rendimento de culturaem 45.
Procedimentos de descontaminação usados para amostras respiratórias (por exemplo, N-acetil-L-cisteína–NaOH) podem, inadvertidamente, reduzir a recuperação da Nocardia devido ao seu crescimento lento e suscetibilidade a agentes químicos. Portanto, os laboratórios devem considerar meios seletivos (por exemplo, ágar extrato de levedura de carvão tampão) e períodos de incubação estendidos (de até 2 a 4 semanas) para melhorar a recuperação46. Um grande desafio clínico é distinguir a colonização da infecção verdadeira. A nocárdia pode ser isolada de amostras respiratórias em pacientes com doença pulmonar crônica (por exemplo, bronquiectasia, doença pulmonar obstrutiva crônica) sem evidências de doença invasiva. Nesses casos, a detecção pode representar colonização, e não infecção. Essa distinção é fundamental, pois o tratamento desnecessário pode aumentar a toxicidade e a resistência, enquanto a falha no tratamento da infecção verdadeira pode resultar em doença disseminada com alta mortalidade. O julgamento clínico, apoiado por achados radiográficos, histopatologia e sintomas sistêmicos, éessencial 2.
Fatores do hospedeiro influenciam significativamente tanto a suscetibilidade quanto os resultados. O tipo e o grau de imunossupressão são determinantes chave. Entre os receptores de transplante de órgãos sólidos, a incidência varia conforme o tipo de órgão: os que receberam transplante de pulmão apresentam o maior risco (até 9%), seguidos pelos receptores de coração e fígado, enquanto os receptores de transplante de rim apresentam incidência menor, mas ainda significativa (0,4%–1,3%)16˒17. Essas diferenças refletem variações nos regimes imunossupressores e na exposição ambiental. O uso de agentes que depletam células T e corticosteroides em altas doses aumenta ainda mais o risco, especialmente no primeiro ano após otransplante 1.
Tecnologias baseadas em espectrometria de massa, como a MALDI-TOF MS, demonstraram alta precisão na identificação de Nocardia , embora ainda existamlimitações de 26˒27. A precisão da identificação em nível de espécie depende fortemente da abrangência e atualidade do banco de dados de referência, e o desempenho varia entre diferentes versões do banco de dados. Esses fatores, em vez das falhas específicas de identificação por espécie, representam os principais desafios para laboratórios clínicosrotineiros 23.
Quanto aos testes de suscetibilidade a antimicrobianos, existe variabilidade significativa entre as espécies de Nocardia . Embora muitas cepas permaneçam suscetíveis a linezolida e amikacina, a resistência a outros antibióticos varia conforme a espécie e pode influenciar os resultados dotratamento 3. Portanto, o teste de suscetibilidade continua sendo crucial para orientar a terapia, conforme discutido na Seção 3.