Um ensaio FRET de molécula única permite a análise quantitativa do recozimento mediado por Hfq entre sRNAs bacterianos e mRNAs, possibilitando a medição da cinética e estabilidade da interação. Resultados representativos demonstram como o comprimento da semente, os motivos de ligação Hfq e o espaçamento dos motivos afetam a formação dupla do RNA.
Artigo de investigação
Efeito do comprimento da semente e dos motivos de ligação no recozimento de sRNA-mRNA mediado por Hfq analisado usando FRET de molécula única
Neste artigo
Resumo
Resumo
Definir as regras que regem o recozimento entre pequenos RNAs bacterianos (sRNAs) e seus alvos de mRNA é desafiador porque esses RNAs são altamente heterogêneos em sequência e estrutura. Para desvendar a contribuição de características individuais, variamos sistematicamente determinantes-chave, incluindo a força da semente, os motivos de ligação Hfq e o espaçamento entre eles. Os efeitos dessas características na estabilidade duplex sRNA-mRNA foram testados usando transferência de energia de ressonância de Förster de molécula única (smFRET), que permite monitoramento de moléculas individuais de RNA na escala de milissegundos e oferece acesso a eventos dinâmicos frequentemente obscurecidos em ensaios de conjunto.
Demonstramos que regiões de sementes curtas (4-5 pb) formam complexos instáveis e de vida curta, enquanto sementes mais longas (8-10 pb) produzem dúplexes estáveis. Estender os motivos de ligação Hfq ou introduzir um espaçador entre os sítios de ligação no mRNA aumentou ainda mais a vida útil da interação, destacando a importância da resistência dos motivos e do arranjo espacial na eficiência de recozimento mediada por Hfq. Além disso, essa abordagem fornece uma estrutura robusta e reprodutível para dissecar a dinâmica da interação RNA-RNA em resolução de molécula única e para sondar mecanismos de chaperona de RNA.
Introdução
A expressão gênica bacteriana é amplamente regulada no nível pós-transcricional por pequenos RNAs. Esses RNAs curtos (tipicamente 50-300 nt) atuam por pareamento de bases com os mRNAs-alvo1. Em muitos casos, sRNAs recozem a sítios de ligação ao ribossomo para reprimir a tradução ou desencadear o decaimento do mRNA ao recrutarRNases 2,3. Embora essas interações tenham sido amplamente estudadas usando ensaios genéticos e bioquímicos, a maioria das abordagens disponíveis infere regulação indiretamente a partir de efeitos em estado estacionário nos níveis de RNA ou na saída de proteínas, dificultando a resolução da dinâmica de ligação subjacente.
A regulação eficiente do alvo frequentemente requer o chaperone de RNA Hfq, uma pequena proteína hexamérica semelhante aoSm 4,5. O Hfq estende a meia-vida dos sRNAs ao protegê-los dasnucleases 6 e promove o recozimento com os mRNAs-alvo 7,8. O Hfq alcança essas funções por meio de três superfícies distintas de ligação ao RNA com diferentes preferências: a face distal reconhece motivos AAN geralmente encontrados em mRNAs, a face proximal liga sequências ricas em U típicas dos terminadores de sRNA, e a borda interage eletrostaticamente com as colunas dorsuaisde RNA 9. No entanto, o Hfq está presente em abundância muito menor do que o total de RNAsinteragentes 10,11. Apesar dessa aparente limitação, sRNAs recém-sintetizados rapidamente encontram seus alvos e acionam a regulação em minutos após a transcrição12. Esse paradoxo sugere que as interações RNA-Hfq são altamente dinâmicas, com os RNAs se associando e dissociando continuamente em vez de permanecerem ligados em complexosestáveis 13,14. Compreender como tais interações transitórias produzem regulação confiável requer acesso experimental a eventos individuais de ligação, em vez de médias populacionais.
As interações entre sRNAs e mRNAs são mediadas por sequências sementes imperfeitamente complementares, que precisam localizar seus sítios de correspondência dentro de mRNAs frequentemente longos e altamente estruturados. Além disso, a distância entre a região semente do sRNA e o sítio de ligação ao Hfq no mRNA pode variarconsideravelmente 15, complicando ainda mais o processo de recozimento. O Hfq ajuda a superar esses desafios ao transferir de forma flexível sRNAs entre possíveis sítios de ligação no alvo, aumentando assim a probabilidade de encontrar a regiãocorreta de pareamento 16. O pareamento mediado por Hfq também pode remodelar estruturas locais de mRNA, desenrolando transitoriamente regiões pareadas de bases e expondo sequências que de outra forma seriam inacessíveis. Esse tipo de remodelação, no entanto, também pode levar a eventos de recozimento não produtivos ou abortivos. Essas interações transitórias às vezes podem ser estabilizadas por fortes motivos de ligação Hfq localizados próximos ao sítio depareamento 17. Apesar dessa flexibilidade, nem todos os encontros sRNA-mRNA resultam em formação duplex estável, e os fatores que determinam a eficiência do recozimento permanecem pouco compreendidos. Em particular, ainda não está claro como determinantes individuais de sequência contribuem quantitativamente para a vida útil da ligação e para a estabilidade complexa.
Aqui, estabelecemos um sistema mínimo de molécula única reconstituída que permite manipulação passo a passo dos determinantes de sequência e medição direta da cinética de recozimento usando smFRET. Neste sistema, projetamos pares de RNA com recozimento inicialmente ineficiente e alteramos sistematicamente características-chave, incluindo resistência da semente, resistência do motivo de ligação Hfq e o espaçamento entre esses locais, para dissecar como parâmetros individuais influenciam a estabilidade duplex. Ao isolar características de sequência definidas em um sistema in vitro controlado, essa abordagem possibilita a dissecação mecanicista das regras de direcionamento de sRNA que são difíceis de desvendar in vivo devido à complexidade da rede e efeitos regulatórios indiretos.
Protocolo
Este protocolo descreve o ensaio FRET de molécula única para monitorar o recozimento de sRNA-mRNA. Inclui procedimentos para design, síntese, passivação e funcionalização de lâminas de modelo, imagem de molécula única e análise quantitativa de dados.
Preparação de RNAs
Projete as sequências de sRNA e mRNA in silico. Cada sRNA deve terminar com um terminador de transcrição e conter um motivo de ligação Hfq rico em U, bem como uma sequência semente complementar ao mRNA alvo. O mRNA correspondente deve incluir repetições AAN que servem como motivo de ligação a Hfq e uma sequência complementar à região semente do sRNA. Sequências fora da ligação Hfq são randomizadas evitando motivos AAN e tratos ricos em U para evitar interações não intencionais com Hfq. Adicione uma sequência complementar de laço à extremidade 3' do mRNA para permitir a imobilização na superfície durante a imagem. Prediga estruturas secundárias de RNA excluindo sequências complementares de laços usando estrutura de RNA via servidor web oulocalmente 18. Para análise baseada na web, faça upload das sequências FASTA para o Servidor Web RNAstructure (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) e selecione Prever uma Estrutura Secundária. Use parâmetros padrão (temperatura 37 °C, sem restrições de dobramento). Após o cálculo, inspecione o diagrama estrutural e a probabilidade de dobrar. As regiões foram classificadas como ocluídas se nucleotídeos dentro do motivo semente ou de ligação a Hfq tivessem probabilidades previstas de pareamento de bases >60%. Sequências que ultrapassavam esse limite eram redesenhadas.
Prepare modelos de DNA para transcrição in vitro estendendo oligonucleotídeos sobrepostos usando DNA polimerase, seguindo o protocolo do fabricante. A concentração do primer era de 3 μM cada. O programa termociclador foi usado conforme recomendado pelo fabricante, exceto que o número de ciclos de amplificação foi reduzido para 8, o que foi suficiente para estender os primers.
Transcreva RNA a 37 °C por 3 horas até a noite toda usando a polimerase de RNA T7 em tampão de transcrição 1× (80 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM espermidina, 10 mM NaCl), suplementado com 1 mM cada NTP, 40 mM DTT e 30 mM deMgCl 2. Pare a reação adicionando EDTA a uma concentração final de 30 mM. Para a precipitação de RNA, adicione 1/10 de volume de 3 M NaOAc (pH 5,4), seguido por 2,5-3 volumes de ≥99% de etanol. Misture bem e incube a -80 °C por 1 hora. RNA de pellet por centrifugação a ≥20.000 × g por 35 minutos a 4 °C. Remova o sobrenadante, lave o pellet com 70% de etanol e seque ao ar por um instante. Dissolva o pellet de RNA em 20 μL de 8 M ureia e aqueça a 90 °C por 2 minutos. Purifique o RNA em géis de poliacrilamida a 8% contendo 8 M ureia. Retirar as bandas de interesse e eluir o RNA durante a noite no tampão de elução (0,3 M acetato de sódio, pH 5,4, 1 mM EDTA). Recupere o RNA por precipitação de etanol (siga as instruções para precipitação de DNA) e dissolva o pellet em água sem nuclease.
Para preparar RNAs para marcação fluorescente, realizar transcrição in vitro conforme descrito, suplementando a reação com 32 mM de GMP para gerar transcritos carregando um monofosfato de 5'. Trate o RNA com 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida,cloridrato 19 (EDC) e imidazol para introduzir um grupo amina na extremidade 5'. Incube o sRNA em tampão carbonato-bicarbonato (pH 8,5) com Alexa Fluor 555 ou Cy3 éster do NHS, seguindo as instruções do fabricante. Purifique o RNA modificado usando colunas de spin cromatografia, precipite com etanol e dissolva o pellet em água sem nuclease. Determine a eficiência da marcação espectrofotometricamente medindo a absorvância a 260 nm e no máximo de absorção específico do corante usando um Nanodrop ou espectrofotômetro equivalente. Calcule as concentrações de RNA e corantes usando a lei de Beer-Lambert e os correspondentes coeficientes de extinção fornecidos pelo fabricante do fluoróforo. A eficiência de marcação é definida como a razão molar do contraste para o RNA e rotineiramente se aproximava de 100%. RNAs marcados podem ser armazenados a -20 °C.
Ordem de oligonucleotídeos de DNA que carregam uma metade 3′-biotina e um ligador C6 5′-amino. Precipite DNA usando etanol e acetato de sódio, conforme descrito acima. Rotule o grupo amina com éster Cy5 NHS em tampão carbonato-bicarbonato (pH 8,5) conforme as instruções do fabricante. Determine a concentração de DNA marcado espectrofotometricamente, conforme descrito acima. DNAs marcados podem ser armazenados a -20 °C.
Purificação Hfq
Cultive células Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB que portam o plasmídeo de expressão Hfq pET21b-EcHfq, no qual o gene hfq de E. coli é expresso a partir de um promotor induzível por IPTG. Hfq é expresso sem uma tag de afinidade; a proteína nativa contém resíduos suficientes de histidina expostos à superfície para permitir a purificação por cromatografia de afinidade Ni2+ . Cultive células em 1 L de meio LB-Miller suplementado com 100 μg/mL de ampicilina a 37 °C para um ODde 600 de 0,6. Induza a expressão de Hfq adicionando IPTG a uma concentração final de 1 mM e incube por 4 horas a 37 °C. Colhe as células por centrifugação a 5.000 × g por 10 minutos, depois ressuspenda o pellet em 50 mL de tampão de lise (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 250 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoetanol, Atenção: 2-mercaptoetanol é tóxico, manuseio em uma exaustão). Lisar as células por sonicação no gelo usando uma configuração de pulso de 50% do ciclo de trabalho. Aplique três pulsos de 40-s com intervalos de resfriamento de 1 minuto sobre gelo entre os pulsos. Centrifuge o lisado a 27.000 × g por 20 minutos a 4 °C. Aqueça o sobrenadante a 85 °C por 45 minutos, depois centrifuge novamente nas mesmas condições. Trate o sobrenadante resultante com RNase A (30 μg/mL) e DNase I (5 U/mL) por 1 hora em temperatura ambiente, com suave agitação, seguida de filtração através de um filtro de 0,45 μm. Aplique o lisado clarificado a uma coluna de cromatografia de afinidade pré-carregada com NiSO4. Lave a coluna com tampão (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 0,5 mM 2-mercaptoetanol). Elude a proteína usando o mesmo tampão com concentração linear de gradiente de imidazol de 10 mM a 1 M. Agrupe as frações contendo Hfq e carregue-as em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho HiLoad 16/600 Superdex 200 equilibrada com tampão HB (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NH4Cl, 1 mM EDTA, 10% glicerol). Opere a coluna conforme as instruções do fabricante. Uma análise representativa SDS-PAGE da purificação de Hfq é mostrada na Figura Suplementar 1. Concentre a proteína purificada, se necessário, usando filtros centrífugos (MWCO de 3 kDa). Alíquotas purificadas de Hfq podem ser armazenadas a -80 °C.
Experimentos com molécula única
Passivação de lâminas de quartzo20
Prepare lâminas de quartzo com cinco furos paralelos (0,8 mm de diâmetro) perfurados próximos a cada borda longa. Coloque lâminas e coberturas de quartzo em um pote de coloração Hellendahl (suporte de lâminas) e faça sonicar acetona por 20 minutos (Atenção: acetona é inflamável e volátil; trabalhe em uma exaustão). Repita a etapa de limpeza usando metanol (Atenção: o metanol é tóxico e inflamável; use o cabo em uma exaustor). Enxágue bem os slides com água e faça sonic em 1 M de KOH por 1 h (Cuidado: KOH é cáustico, use luvas e proteção para os olhos). Enxágue as lâminas com água, depois sonice sequencialmente em acetona e metanol por 20 minutos cada. Repita a limpeza do KOH usando 5 M KOH por 1 hora, seguida de uma lavagem cuidadosa com água (Atenção: Manuseie o KOH concentrado com o equipamento de proteção adequado). Seque os slides ao ar. Prepare um conjunto limpo de potes de mancha Hellendahl e enxágue-os com hexano (Atenção: hexano é altamente inflamável; manuseie em uma capela de fumo), depois deixe secar ao ar. Coloque os lâminas no suporte e enxágue as lâminas duas vezes com hexano. Adicione 75 mL de hexano ao suporte do lâmina e injete cuidadosamente 50 μL de diclorodimetilsilano (DMDCS) sob a superfície do hexano (NOTA: evite expor o DMDCS ao ar). Incube os slides com balanço suave por 1,5 h. Enxágue e faça sonicing dos slides em hexano por 1 minuto e repita essa etapa três vezes para remover o DMDC residual. Seque as lâminas ao ar e sele-as a vácuo em tubos de 50 mL (por exemplo, Falcon ou tubos cônicos). Lâminas preparadas podem ser armazenadas a −20 °C até uso adicional.
Montagem e funcionalização de canais de fluxo
Um canal de fluxo simples pode ser montado usando uma lâmina de quartzo, engobe de vidro, fita dupla face, pontas de pipeta e epóxi. Aplique tiras finas de fita dupla face entre os furos do slide de quartzo e coloque o coverslip por cima. Sele as bordas mais longas com epóxi. Corte aproximadamente 5 mm de segmentos da ponta de uma pipeta (tanto a ponta estreita quanto a do colar mais largo) e insira um em um orifício para servir como saída e o outro em um orifício paralelo para formar um reservatório de entrada. Prenda ambos com epóxi. O reservatório de entrada deve reter líquido sem vazamento antes da injeção. Para puxar soluções pelo canal, conecte o tubo de uma seringa de 1 mL à saída.
Pré-trate os canais sequencialmente com os seguintes reagentes para funcionalizar a superfície: BSA biotinilada (0,2 mg/mL) por 5 minutos, Tween-20 (0,2%) por 10 minutos e NeutrAvidin (0,1 mg/mL) por 1 minuto. Aproximadamente 100 μL de cada solução são suficientes por canal. Evite puxar mais líquido do que o presente no reservatório de entrada, pois isso introduzirá ar no canal e gerará bolhas. Deixe um pequeno volume de solução no reservatório entre as etapas para evitar que o canal seque. Enxágue cuidadosamente com 1× tampão TNK (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl) entre cada etapa. Esse tratamento estabelece uma superfície de biotina-NeutrAvidina para imobilização de RNA.
Prepare dúplexes mRNA-tether imediatamente antes da imobilização, misturando mRNA de 40 nM com um DNA marcado com Cy5 biotinilado de 20 nM. Desnature a mistura a 75 °C por 5 minutos em tampão de 1× TNK (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl), depois refaça a 37 °C por 15 minutos e equilibre a 20 °C.
Dilua a amostra 50 vezes em tampão de imagem (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico, 0,01% octetilenoglicol monododecilílico éter, 0,8% glicose, inibidor de RNase 2 U/mL) e injete-a no canal de fluxo para imobilizar os mRNAs. Incube por 1 minuto, depois lave com tampão de imagem suplementado com um sistema de absorção de oxigênio (165 U/mL glucose oxidase e 2170 U/mL catalase) para reduzir o fotobranqueamento.
Prepare os complexos sRNA-Hfq misturando os componentes em uma proporção 1:1 até uma concentração final de 250 nM em 1× tampão TNK e incube por 5 a 15 minutos em temperatura ambiente. Dilua os complexos 50 vezes no buffer de imagem contendo o sistema de captura de oxigênio e injete-os no canal de fluxo imediatamente antes da imagem.
Aquisição de dados de molécula única
Configure o microscópio de fluorescência interna total baseada em prismas (TIRF) ligando a câmera EMCCD e os lasers. Monte a lâmina preparada com canais de fluxo montados no palco do microscópio e coloque o prisma por cima. Use um único software (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) para adquirir dados. No software, determine o nível de fundo selecionando AutoEscala e copie o valor obtido no campo Background. Ajuste a taxa de quadros de aquisição para 100 ms. Excite Alexa Fluor 555 ou Cy3 usando um laser de 532 nm e Cy5 usando um laser de 633 nm. Colete emissões de ambos os canais simultaneamente por meio de uma meta de imersão em água de 60×. Para cada filme, comece com dez quadros de excitação de 633 nm para localizar mRNAs marcados com Cy5 no campo de visão. Continue gravando por 5 minutos com excitação de 532 nm. Finalize a aquisição com 1 s de excitação de 633 nm para verificar o fotobranqueamento Cy5. Isso gera o arquivo de filme .pma, que pode ser usado para análise.
Análise de dados de molécula única
Analise arquivos .pma brutos usando scripts IDL personalizados para realizar mapeamento de canal doador-aceitador e extrair trajetórias de intensidade de fluorescência. Primeiro, grave um filme de calibração usando esferas fluorescentes multicoloridas detectáveis tanto nos canais doador quanto no aceitador durante a excitação com o laser de 532 nm ou 633 nm. Use este vídeo de calibração para gerar um arquivo de mapeamento que alinhe os canais doador e aceitador. Aplique o arquivo de mapeamento resultante a todas as gravações experimentais para identificar pares doador-aceitador correspondentes, detectar pontos fluorescentes e exportar traços de tempo de intensidade para análise de FRET a jusante. Instruções detalhadas, passo a passo, são fornecidas junto com o script (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab).
Traces de intensidade do processo no MATLAB usando o script s_tr_E.m. Inicie o script e insira o diretório contendo os arquivos .traces e .pks, seguido pelo índice do arquivo e pela resolução temporal. Selecione a janela de quadro usada para identificação de pontos quando solicitado. O roteiro então exibe as intensidades do doador e do aceitador por cada ponto individual. Navegue pelas moléculas usando comandos de teclado (b para voltar, g para pular para uma molécula especificada). Defina as linhas de base do doador e do aceitador (k) e corrija o vazamento (l) clicando nos gráficos quando necessário. Salve as trilhas aceitas individualmente como arquivos .dat contendo intensidades de tempo, doador e aceitador, pressionando s. Use os arquivos exportados para análises quantitativas posteriores.
Use o programa peak-finder para analisar trilhas individuais de smFRET e extrair eventos de ligação para quantificação, incluindo análise de tempo de permanência e distribuições de estados dos FRETs. Inicie o programa e abra a pasta que contém os arquivos de rastreamento .dat exportados usando o menu Arquivo. Defina os valores de referência e os valores de vazamento de doador para aceitador determinados anteriormente usando o script MATLAB. Em seguida, defina os limiares de intensidade para guiar a detecção automática de picos de modo que todos os eventos de ligação visualmente verificados estejam acima dos valores selecionados. Se o ruído fizer com que um único evento seja dividido em múltiplos picos, mescle-os manualmente usando a função de fusão embutida. Clique em Salvar picos para exportar eventos detectados como arquivos .csv contendo horário de início, horário de término e eficiência média de fretes para cada evento. Os arquivos de saída são salvos no diretório peaks, enquanto valores de fretes resolvidos por frame para cada evento são gravados no diretório peak-fret. A eficiência do FRET é calculada dividindo a intensidade de fluorescência do aceitador pela soma das intensidades do doador e do aceitador, usando valores corrigidos para o vazamento de fundo e do doador no canal do aceitador. Inspecionar manualmente as trilhas para fotobranqueamento Cy5, identificado por uma diminuição abrupta na eficiência do FRET acompanhada de aumento da intensidade Cy3. Quando ocorre o fotobranqueamento, assuma que a ligação persiste enquanto a fluorescência Cy3 permanecer detectável, e corrija as durações de pico editando os arquivos de .csv correspondentes.
Importar valores de eficiência de fretes resolvidos em frames dos arquivos de pico para o GraphPad Prism. Gerar histogramas de FRET usando a função de Distribuição de Frequência e ajustar as distribuições com modelos Gaussiano para identificar a população dominante de FRETs.
Determine os tempos de permanência para eventos individuais de ligação subtraindo a associação dos pontos de tempo de dissociação usando uma planilha. Calcule a fração de eventos transitórios (<10 s) para cada repetição experimental. Análises estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism. Comparações entre duas condições foram avaliadas usando testes t não pareados, e comparações entre três ou mais condições foram analisadas usando ANOVA unidirecional com o teste pós-hoc de Tukey.
Resultados
O comprimento da semente define o regime dinâmico do pareamento sRNA-mRNA
Estabelecemos um ensaio mínimo de molécula única para testar como as características de sequência governam o recozimento mediado por Hfq. Os RNAs modelo foram projetados seguindo arquiteturas previamente descritas dos pares sRNAs-mRNA dependentes deHfq 16,17 e carregavam um motivo de ligação a Hfq rico em adenosina no mRNA e um sítio de ligação à borda rico em uridina no sRNA (Figura 1A). O sRNA foi marcado com Alexa Fluor 555 (doador) na extremidade 5ʹ e o cabo mRNA-DNA com Cy5 (aceitador), permitindo a detecção de proximidade induzida pelo pareamento de bases através do FRET.
Variar a complementaridade da semente de 4, 5, 8 para 10 pb produziu comportamentos dinâmicos distintos. Com uma semente de 4 pontos base, as interações foram predominantemente transitórias e apresentaram eficiências heterogêneas de FRET, sugerindo pareamento de bases incompleto (Figura 1B-D). Em contraste, sementes de 8 pb e 10 pbbs produziram dúplexes estáveis que frequentemente persistiam durante a janela de observação (Figura 1C). As interações produziram o esperado estado de fretes altos (FRET E ≈ 0,79-0,80, Figura 1D), consistente com o pareamento completo de bases entre RNAs. Uma semente de 5 pontos base produziu eventos de ligação de curta duração, porém bem definidos (E FRET ≈ 0,66), fornecendo uma faixa dinâmica viável para modificações subsequentes na sequência de RNA (Figura 1B-D). Por isso, usamos complementaridade de 5 pontos básicos para todos os testes posteriores.
Motivos de ligação a Hfq mais fortes aumentam a estabilidade do complexo sRNA-mRNA
Em seguida, perguntamos como a resistência da ligação Hfq modula a vida útil da ligação em complementaridade fixa de 5 pb. Estender o motivo do mRNA de AAN4 para AAN6 aumentou significativamente a probabilidade de formação de complexos estáveis (p < 0,001). A vida média aumentou de 7,5 s para 18 s, e a fração de eventos instáveis < 10 s diminuiu de 80 ± 2% para 68,3 ± 2,9% (Figura 2A-C).
Em seguida, testamos o efeito do motivo de ligação a Hfq no sRNA. O encurtamento do sítio de ligação à borda de UUAUUUUUUU para CUUC (sRNA-SR, "borda curta") produziu interações altamente instáveis (vida média de 1,9 s com AAN4), e o fortalecimento do motivo do mRNA nesse contexto teve apenas um efeito modesto (média 3,0 s com AAN6, não significativa, Figura 2B,C). Assim, ambos os parceiros contribuem para a estabilidade do complexo produzido, mas contatos fracos sRNA-Hfq limitam os ganhos de um motivo de mRNA mais forte.
Um espaçador entre os sítios Hfq e semente no mRNA promove complexos de vida mais longa
O Hfq pode permanecer ligado à região AAN enquanto usa sua superfície de borda para facilitar a busca pelo sítio ótimo de pareamentode sRNA 16. Essa propriedade sugeria que o espaçamento adicional entre as duas regiões de ligação no mRNA poderia influenciar a estabilidade da interação.
Para testar isso, introduzimos um espaçador de fita simples de 15 nts entre os sítios de ligação Hfq e sRNA (N15). Essa modificação aumentou significativamente a vida útil dos eventos de recozimento estável de 7,5 s (AAN4) para 47 s (AAN4-N15) (p < 0,01) (Figura 3A,B). A porcentagem de eventos de ligação com duração inferior a 10 s também diminuiu de 80 ± 2% para 44 ± 6% (Figura 3C). Esses dados indicam que flexibilidade adicional entre os módulos de ligação pode estabilizar intermediários de recozimento e promover duplexes de vida mais longa.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Todos os dados que apoiam os achados deste estudo, incluindo trajetórias de FRET de molécula única, conjuntos de dados processados e scripts de análise, estão publicamente disponíveis no repositório de Dados Mendeley em: doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
Figura 1: Efeito da complementaridade sRNA-mRNA na eficiência da ligação. (A) ensaio smFRET para recozimento sRNA-mRNA. O pareamento de bases entre o sRNA marcado com Alexa Fluor 555 e o complexo imobilizado de cabo mRNA-Cy5-DNA produz um sinal de frequência alta. Os mRNAs modelo contêm um sítio de ligação a Hfq (AAC)4 (azul) e um sítio de ligação a sRNA (S5, vermelho), seguidos por cinco nucleotídeos e a região híbrida RNA-DNA. Os sRNAs incluem um sítio de ligação à borda (laranja). Os painéis em (B-D) são agrupados por condição experimental (comprimento da semente). (B) Evento representativo de ligação ao sRNA em uma única molécula de mRNA. Traços de intensidade de fluorescência do sRNA marcado com Alexa Fluor 555 (doador, verde) e do cabo de Cy5-DNA (aceitador, vermelho) são mostrados. O Cy5 ficou diretamente empolgado durante o primeiro e o último dez quadros da gravação. (C) Rastergramas representando 50 moléculas representativas de mRNA ligadas por sRNA-Hfq. Cada barra horizontal representa uma única interação sRNA-mRNA. (D) Histogramas das eficiências de FRET para interações entre mRNAs e sRNAs contendo 4 bp (N = 416 mRNAs), 5 bp (N = 513 mRNAs), 8 bp (N = 191 mRNAs) ou 10 bp (N = 105 mRNAs) regiões complementares. As eficiências FRET foram calculadas a partir das intensidades do doador e aceitador corrigidas por linha inicial e vazamento para eventos individuais de ligação em intervalos de 0,1 s. Ajustes Gaussianos (azul) indicam a população dominante de FRET e não foram usados para calcular valores E_FRET. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 2: Efeito do comprimento do motivo de ligação ao Hfq nas interações sRNA-mRNA. A região de pareamento de bases em todas as variantes tem 5 pontos base de comprimento. (A) Rastergramas mostrando 50 mRNAs representativos ligados por complexos sRNA-Hfq. Cada barra horizontal representa uma única interação. Diagramas em cartoon acima ilustram os desenhos correspondentes de RNA com mudanças no número de repetições (AAC) no mRNA e no comprimento da região de ligação à borda no sRNA (SR = "borda curta"). Coloração como na Figura 1A. (B) Gráficos de dispersão dos tempos de vida de ligação ao sRNA-mRNA. Cada ponto representa um único evento de ligação. Tempos médios de vida (linha horizontal vermelha): 7,5 s para mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNAs), 18 s para mRNA-AAN6 + sRNA (N = 142 mRNAs), 1,9 s para mRNA-AAN4 + sRNA-SR (N = 85 mRNAs) e 3 s para mRNA-AAN6 + sRNA-SR (N = 149 mRNAs). (C) Gráfico de barras mostrando a porcentagem de eventos de ligação menores que 10 s. Barras de erro representam o desvio padrão em relação a dois conjuntos de dados independentes. Análise estatística por ANOVA unidirecional com o teste pós-hoc de Tukey para comparações múltiplas. p < 0,001, ****p < 0,0001; NS, não significativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura 3: Efeito do comprimento do espaçador entre os sítios de ligação Hfq e sRNA nas interações sRNA-mRNA. A região de pareamento de bases em todas as variantes tem 5 pontos base de comprimento. (A) Rastergramas que representam 50 mRNAs representativos ligados pelo complexo sRNA-Hfq. Cada barra horizontal representa um único evento de ligação. Os diagramas em desenho animado acima ilustram o design correspondente do RNA. N15 = espaçador 15 nt de sequência aleatória. Coloração como na Figura 1A. (B) Gráficos de dispersão dos tempos de vida de ligação ao sRNA-mRNA. Cada ponto representa um único evento de ligação. Tempos médios de vida (linha horizontal vermelha): 7,5 s para mRNA-AAN4 + sRNA (N = 188 mRNAs) e 47 s para mRNA-AAN4-N15 + sRNA (N = 289 mRNAs). (C) Gráfico de barras mostrando a porcentagem de eventos de ligação menores que 10 s. Barras de erro representam o desvio padrão em relação a dois conjuntos de dados independentes. Análise estatística por teste t sem pareamento. **p < 0,01. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
Figura suplementar 1: Purificação da E. coli Hfq. Análise SDS-PAGE da expressão e purificação de Hfq. (Top) Amostras coletadas durante a purificação em uma coluna de afinidade Ni2+ (HiTrap), incluindo antes da indução, após indução, pellet, lisado, carga, fluxo, frações de lavagem e frações de pico eluídas. (Embaixo) SDS-PAGE de frações de pico após cromatografia por exclusão de tamanho em uma coluna HiLoad 16/600 Superdex 200. Formas monoméricas (~11 kDa) e hexaméricas (~66 kDa) de Hfq são indicadas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Discussão
Este estudo estabelece um ensaio de molécula única mínima para dissecar como características específicas da sequência de RNA determinam a eficiência do recozimento de sRNA-mRNA mediado por Hfq. Variando o comprimento da semente, a resistência do motivo de ligação Hfq e o espaçamento entre os módulos de ligação, quantificamos diretamente como cada parâmetro contribui para a estabilidade duplex na resolução de molécula única. Ao contrário das medições em conjunto, que relatam efeitos médios populacionais, essa abordagem resolve diretamente eventos individuais de ligação e dissociação, permitindo a medição da heterogeneidade cinética e interações transitórias. Nossos resultados mostram que até regiões de sementes curtas podem se envolver transitoriamente, enquanto sementes mais longas produzem duplexes estáveis com vidas prolongadas. Esses achados são consistentes com dados anteriores in vivo e em conjunto que demonstram que regiões naturais de semente em sRNAs bacterianos tipicamente abrangem de 6 a 12 nucleotídeos e raramente formam dúplexes totalmentecomplementares 21,22,23.
Também descobrimos que tanto os motivos de ligação Hfq do mRNA quanto do sRNA influenciam fortemente a estabilidade dúplex. Estender o motivo AAN no mRNA aumentou a vida útil da ligação, enquanto encurtar o sítio de ligação ao bordo do sRNA os desestabilizou significativamente. Isso apoia um modelo cooperativo no qual a face distal do Hfq ancora motivos de mRNA ricos em adenosina, e a borda recruta sRNAs ricos em uridina para promover o alinhamento eficiente de regiõescomplementares 9,17. Em contraste com ensaios genéticos ou baseados em repórter, que normalmente detectam apenas resultados regulatórios produtivos, esse sistema separa quantitativamente a estabilidade de ligação dos efeitos posteriores, permitindo a comparação direta de como características individuais de sequência modulam a vida útil das interações físicas. Um motivo forte de ligação à borda é particularmente importante quando são necessários rearranjos estruturais para o pareamento sRNA-mRNA, pois aumenta a retenção de RNA no Hfq17. Acredita-se também que a borda promova varredura lateral de mRNAs pelos complexossRNA-Hfq 16, uma propriedade que pode ser particularmente importante quando os locais-alvo estão distantes da região de ligação ao Hfq. Nossos resultados com um espaçador de 15 nts entre os sítios de ligação apoiam essa visão, mostrando que flexibilidade adicional entre o motivo semente e Hfq aumenta a estabilidade do pareamento, possivelmente reduzindo as restrições estéricas durante a troca de fios.
Além dos sistemas naturais, os resultados são relevantes para o projeto de sRNAs sintéticos ou engenheirados. A maioria das estratégias de design existentes foca na otimização de uma região semente ou de um andaimegeral 23,24,25, mas nossos dados destacam determinantes adicionais, como o espaçamento entre o motivo de ligação Hfq e a região alvo. Como as características de sequência são introduzidas de forma controlada e modular, o ensaio fornece uma estrutura experimental sistemática para testar regras de projeto. Esse princípio pode orientar a futura construção de sRNAs artificiais com maior eficiência regulatória.
Embora a abordagem permita uma análise quantitativa e reprodutível das interações RNA-RNA, ela também apresenta limitações. O ensaio investiga regiões totalmente complementares, enquanto a maioria das interações fisiológicas sRNA-mRNA contém desajustes e protuberâncias que podem afetar o reconhecimento e a regulação. O método mede o tempo de vida útil da ligação entre sRNA e mRNA, mas não aborda diretamente os resultados regulatórios posteriores, como inibição da translação ou decaimento do mRNA. Adaptações futuras desse ensaio podem incluir regiões de sementes descompatíveis, teor variado de GC, ou ribossomos e degradossomos para investigar sistematicamente como esses fatores moldam a cinética de ligação.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos à Profª Sarah Woodson por facilitar o acesso à instrumentação de molécula única. Este estudo foi financiado pelo Centro Nacional de Ciência, Polônia (2022/46/E/NZ1/00462 até EMM) e uma Bolsa de Instalação EMBO (IG 5730-2024 para EMM).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,45 & mu; Filtro M | Millipore | HABG04700 | |
| Coluna Hi-Trap de 5 mL | Cytiva | GE17-0408-01 | |
| Acetona | Merck | 270725 | Grau HPLC |
| Solução de acrilamida:bis-acrilamida | Merck | A2792-100ML | |
| ALEXA555 Éster succinimidila do NHS | Thermo Fischer | A20009 | |
| Filtros Centrífugos Amicon Ultra (NMWL, 3 kDa) | Merck | UFC900308 | |
| Cloreto de amônio | Merck | 1330-500G | |
| Ampicilina | Merck | A9518-5G | |
| ATP | Linegal Chemicals | K054.1 | |
| Beta-mercaptoetanol | Merck | M3148-500ML | |
| BIO-BSA | Merck | A8549-10MG | |
| Colunas de Bio-Spin com Bio-Gel P-30 | Bio Rad | 7326231 | Para purificar RNA marcado |
| Catalase | Merck | C9322 | |
| CTP | Linegal Chemicals | K057.4 | |
| Éster HNS Cy3 | Cytiva | PA13105 | |
| Éster succinimidil do NHS Cy5 | Cytiva | PA15101 | |
| DDT | Thermo Fischer | R0861 | |
| Diclorodimetilsilano | Merck | 440272 | |
| Oligômeros de DNA (amarração) um ligador 5′-amino C6 | Termociência | N/A | |
| Dnase I | Termo Científica | 18047019 | |
| EDC | Termociência | PG82079 | |
| EDTA | Merck | ED2SS-1KG | |
| Câmera EMCCD | Andor | ||
| Etanol | Merck | 1085430250 | |
| Glicose | Merck | D9434-1KG | |
| Glucose oxidase | Merck | G2133-50KU | |
| Glicerol | Merck | G5516-1L | |
| GMP | Merck | G8377 | |
| GTP | Linegal Chemicals | K056.4 | |
| Hcl | Merck | 1.00318 | |
| Hexano | Thermo Fischer | 045652.M1 | |
| Coluna de exclusão de tamanho do HiLoad 16/60 Superdex 200 | Cytiva | GE28-9893-35 | |
| IPTG | Merck | 420322-1GM | |
| KCl | Merck | P9541-1KG | |
| KOH | Merck | 484016-1KG | |
| Cloreto de magêncio | Merck | M8266-1KG | |
| Metanol | Merck | 34885-M | Grau HPLC |
| Neutravidina | Thermo Fischer | 31000 | |
| Sulfato de níquel | Merck | 1067261000 | |
| Nikkol | Merck | P8925-1G | |
| Q5 Polimerase | NEB | M0491S | Usado para produção de molde de transcrição in vitro |
| RNase A | Termociência | EN0531 | |
| RNasin Plus | Promega | N2611 | |
| Acetato de sódio | Merck | S7545-100G | |
| Cloreto de sódio | Sigma-Aldrich | S3014-1KG | |
| Espermidina | Merck Life Science | S2626 | |
| Tris Base | Termo Científica | 17926 | |
| Trolox | Merck | 238813-1G | |
| Ureia | Merck | U1250-5KG | |
| UTP | Linegal Chemicals | K055.3 |
Referências
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