Um fluxo de trabalho para Imagens ao Vivo e Análise Quantitativa de Redes de Microtúbulos Acentrossomais em Oócitos de Drosophila

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo que combina imagens ao vivo com ferramentas de análise automatizada para analisar a dinâmica dos microtúbulos no ovocíto Drosophila . Esse fluxo de trabalho permite a medição eficiente e reprodutível do comportamento dos microtúbulos, incluindo crescimento, orientação, velocidade e organização espacial, podendo ser adaptado a outros tipos celulares após otimização.

Abstract

O citoesqueleto do microtúbulo (MT) é essencial para muitas funções celulares, incluindo a forma celular, polaridade, migração e divisão. Enquanto os centrossomos funcionam como o principal centro organizador de MT (MTOC) em células animais em divisão, muitas células diferenciadas, incluindo os oócitos de Drosophila , dependem de vias acentrossômicas para montar redes MT. Em contraste com o amplo conhecimento da organização da MT em células proliferantes, pouco se sabe sobre como as redes MT se montam sem os centrossomos. Os oócitos de Drosophila fornecem um modelo poderoso para estudar a organização e dinâmica da MT acentrossomal. No entanto, sua densa rede de MT desafia a imagem convencional. Imagens ao vivo permitem visualização em tempo real do crescimento e orientação da MT, mas métodos de análise padronizados continuam limitados. Aqui, apresentamos um protocolo baseado em imagem ao vivo para analisar a dinâmica de crescimento da MT em oócitos de Drosophila usando a Proteína de Ligação Terminal 1 (EB1)-Proteína Fluorescente Verde (GFP), uma proteína de rastreamento de extremidade positiva que marca os locais de polimerização ativa da MT. A microscopia confocal Airyscan de alta resolução permite a detecção de cometas EB1, enquanto macros personalizados de Fiji e scripts em Python fornecem quantificação simplificada e reprodutível da densidade, velocidade, comprimento e orientação dos cometas. Validamos esse método comparando oócitos controle com aqueles submetidos a uma despolimerização MT induzida por frio, bem como mutantes Patronin (CAMSAP em humanos), um estabilizador conservado de MT na extremidade inferior e um componente central dos centros organizadores de microtúbulos não centrossomais (ncMTOC), como controle positivo para dinâmica MT comprometida. Nossas análises revelaram dinâmicas específicas de MT por região, incluindo enriquecimento anterior dos cometas EB1 e vieses de orientação característica, e confirmaram a sensibilidade do fluxo de trabalho para detectar perturbações sutis no crescimento da MT. Essa abordagem fornece uma estrutura confiável e amigável para estudar o comportamento da MT em oócitos. O protocolo passo a passo permite a investigação de reguladores da MT nesse contexto e pode ser adaptável a outros tipos celulares diferenciados, como neurônios e células epiteliais, com a otimização adequada. De forma mais ampla, apoia estudos mecanicistas e triagens genéticas que examinam como diversas arquiteturas de MT sustentam funções celulares especializadas.

Introduction

O citoesqueleto do microtúbulo (MT) é um componente essencial da célula eucariótica, desempenhando papéis essenciais no estabelecimento e manutenção da forma, polaridade e divisão celular. O comportamento dinâmico dos polímeros MT, caracterizado por crescimento e retração, é crucial para muitos processos baseados em MT ^1,2. A montagem de diferentes matrizes de MT depende da ação combinada dos centros organizadores de microtúbulos (MTOCs), dos quais os MTs são nucleados, e da atividade de diversas proteínas regulatórias de MT que controlam a estabilidade, orientação e dinâmica da MT ^1,2,3. O MTOC mais estudado é o centrossomo, que gera matrizes radiais de MTs importantes para regular a forma e polaridade celular na interfase e para a montagem do fuso mitótico na^{mitose 4,5}. No entanto, ao sair ou diferenciar a mitótica, como nos neurônios e células epiteliais, a atividade centrossômica do MTOC é frequentemente atenuada e, em casos extremos, como nos oócitos, pode ser^{eliminada 6,7}. Isso está frequentemente associado à remodelação específica do citoesqueleto MT por tipo celular, com a atribuição da função MTOC a outros sítios^{celulares 2,3,8}, geralmente chamados de MTOCs não centrossmais (ncMTOCs). Embora avanços substanciais tenham sido feitos na elucidação da organização da MT em células mitóticas, sabe-se relativamente pouco sobre como as MTs são nucleadas, estabilizadas e organizadas espacialmente em células animais que saem da mitose ou passam por^{diferenciação 2}. Notavelmente, em organismos vivos, a maioria das células não se divide; Eles saíram do ciclo celular e/ou se diferenciaram. Portanto, é fundamental entender como o citoesqueleto da MT é montado e regulado nesses contextos. Esse conhecimento é essencial para descobrir como arquiteturas de MT distintas são estabelecidas para suportar funções celulares especializadas.

O óócito Drosophila melanogaster fornece um sistema poderoso para estudar a organização e função do MT acentrossômico. Nos estágios médios da oogênese, a atividade do centrossomo é^{atenuada 9}, e as MTs são geradas a partir de ncMTOCs localizados no córtex anterolateral do oócito (Figura 1B). Essa rede MT é essencial para a localização de mRNAs, proteínas e organelas maternas, que por sua vez são críticos para o estabelecimento dos futuros eixos embrionais^{e desenvolvimento 10,11}. Trabalhos anteriores mostraram que os ncMTOCs do oócito são compostos pela proteína MT de extremidade negativa Patronina, que forma um complexo com a proteína espectrraplaquina Shot, ancorada ao citoesqueleto cortical. Foi proposto que as MTs crescam a partir de fragmentos curtos de MT gerados pela corte de enzimas como a Katanina, que podem atuar como sementes para futura polimerização de^{MT 12}. Mecanismos semelhantes foram propostos em outras células diferenciadas, como os^{neurônios 13}, onde a atividade centrossômica é reduzida. No entanto, os mecanismos pelos quais o corte gera redes complexas de MT, como no ovocito, permanecem pouco compreendidos. Ainda não está claro se as MTs nesses contextos são formadas principalmente por rearranjo baseado em corte ou por uma combinação de corte e nucleação de novo MT. A complexidade da rede de MT de oócitos a torna um sistema ideal para estudar como as MTs são geradas e organizadas fora do conhecido contexto centrossômico. Notavelmente, isso também representa um desafio para imagens e análises: a densa rede de MT dentro do oócito dificulta a resolução de MTs individuais usando imunocoloração convencional ou abordagens de imagem^{estática 2,14}.

Imagens ao vivo melhoraram muito a capacidade de estudar redes MT, pois permitem a visualização de eventos de polimerização MT em tempo real, oferecendo insights essenciais sobre a dinâmica e a orientação do crescimento MT. Estudos anteriores analisaram com sucesso a dinâmica de crescimento da MT em ovócitos usando imagens ao vivo dos marcadores de extremidade^{positiva 14, 15, 16}. No entanto, em muitos casos, os procedimentos de análise de imagem usados para quantificar a dinâmica da MT são descritos apenas brevemente, dependem de implementações personalizadas ou específicas de laboratório, ou não são disponibilizados publicamente, limitando assim a reprodutibilidade e a adoção mais ampla. Nosso método se baseia nessas abordagens anteriores ao fornecer um pipeline de análise totalmente documentado, abertamente disponível e fácil de usar, que permite a quantificação padronizada dos parâmetros de crescimento da MT em conjuntos de dados e condições experimentais. Neste protocolo, a dinâmica da MT é registrada em meio da oogênese, quando o citoesqueleto da MT é organizado por redes MT acentrossomal. As MTs em crescimento são visualizadas usando EB1-GFP, uma proteína de rastreamento de extremidade ^17,18 de MT, e são adquiridas por microscopia confocal de varredura a laser com um detector de matriz em modo de alta velocidade. A novidade da nossa abordagem está em sua análise de imagens: um pipeline totalmente documentado, amigável para o usuário, passo a passo, que exige que os usuários selecionem apenas regiões de interesse. O processamento e a quantificação de imagens são facilitados por macros Fiji personalizados e scripts em Python, permitindo a detecção eficiente e reprodutível dos cometas EB1 e a extração de parâmetros, incluindo orientação de crescimento, velocidade e organização espacial. Essa estrutura fornece uma ferramenta padronizada e acessível para comparar dinâmicas de MT entre condições experimentais.

Neste manuscrito, aplicamos esse método para comparar o crescimento de MT em oócitos controle e em oócitos despolimerizados por tratamento a frio. Isso serve tanto para validar o protocolo quanto para apoiar estudos futuros voltados a dissecar o papel das proteínas candidatas na regulação da MT.

Protocol

1. Genética das moscas

NOTA: Para visualizar MTs no oócito, este protocolo utiliza um transgene público (Table of Materials) que expressa a proteína de acompanhamento da extremidade mais avançada da MT EB1, marcada com a etiqueta GFP (Proteína Fluorescente Verde^{) 19}. EB1-GFP se liga especificamente a MTs em crescimento mais extremidades, aparecendo como "cometas" fluorescentes movendo-se na direção da^{polimerização 17,18}. Isso permite a visualização e quantificação da dinâmica de crescimento do MT, incluindo orientação, velocidade e distribuição espacial dentro do oócito^14,20.

1. Mantenha todas as cepas de mosca em meio padrão de ágar de farinha de milho a 25 °C usando técnicas padrão de criação de Drosophila .
2. Cruzar 8–12 fêmeas virgens portadoras de um transgene UAS-RNAi direcionado à expressão de uma proteína de interesse, para 5 machos do genótipo matα4-Gal4-VP16; EB1-GFP.
   NOTA: Para simplificar os cruzamentos genéticos, gere um stock de moscas cruzando a linha V32-Gal4 (inserção no segundo cromossomo) com a linha EB1-GFP (inserção no terceiro cromossomo). Como o EB1-GFP está sob o controle de um promotor de UASp, o driver V32-Gal4 induz a expressão de EB1-GFP, assim como de qualquer transgene UAS-RNAi introduzido em cruzamentos subsequentes, se desejado.
3. Após a eclosão da prole F1, selecione de 10 a 15 fêmeas do genótipo desejado (com menos de uma semana de idade).
4. Transfira as fêmeas, junto com 2–3 machos, para um frasco fresco contendo uma pequena quantidade de pasta de levedura na superfície do alimento. A pasta de levedura estimula a oogênese e promove a progressão do desenvolvimento da câmara de ovos. A presença dos machos garante o acasalamento, o que também promove a maturação dos oócitos e a postura de ovos. Mantenha as moscas a 25 °C por 2 dias.
   NOTA: Para investigar o papel de genes específicos na dinâmica da MT, a redução de proteínas pode ser alcançada usando o sistema UAS/GAL4²¹, com o driver materno público matα4-Gal4-VP16 (também conhecido como V32-Gal4; Tabela de Materiais), que inicia a expressão de Gal4 na linha germinativa a partir dos estados 3–4 da oogênese. Como descrito acima, esse fator induz a expressão de EB1-GFP, bem como de construções UAS-RNAi, permitindo a depleção das proteínas de interesse apenas após a fase do germário. Essa estratégia ignora as funções iniciais potenciais das proteínas-alvo durante as divisões mitóticas iniciais e a especificação dos oócitos. Ao realizar tais experimentos, as moscas devem ser preparadas conforme descrito anteriormente.

2. Dissecação do ovário

1. Anestesie as fêmeas F1 usando CO₂ em um tapete antiaéreo padrão e selecione uma fêmea para dissecação.
2. Transfira a fêmea selecionada diretamente para um prato de fundo de vidro de 35 mm (com espessura de vidro de 0,13–0,15 mm) e coloque uma gota de óleo de imagem sobre a mosca.
3. Posicione a mosca voltada para o lado ventral para cima (asas voltadas para baixo). Usando uma pinça, segure suavemente a parte inferior do tórax com uma pinça, e com uma segunda pinça, belisque um pouco a cutícula abdominal da parte posterior do abdômen.
4. Extraia suavemente o trato reprodutor puxando-o cuidadosamente pela abertura.
5. Isole os ovários e depois os ovaróis individuais, deslizando-os suavemente pelo óleo usando a pinça. Ao manipular os ovários, sempre segure-os pelas câmaras mais antigas dos óvulos (estágios 13–14) para evitar danificar os estágios intermediários mais frágeis (estágios 6–9), que são os de interesse para imagem (Figuras 1A,B).
6. Segure a ponta anterior do ovário, onde estão localizados o germário e as câmaras dos óvulos em estágio inicial (Figuras 1A,B). Aplique uma tensão lenta e constante para separar os ovários individuais. À medida que você puxa, câmaras de ovos em vários estágios de desenvolvimento vão surgir. Esse processo pode ser repetido várias vezes por ovário para isolar ovos²² adicionais (veja o vídeo para demonstração).
   NOTA: Para ovocitos submetidos a tratamento a frio para despolimerizar a MT, as dissecações foram realizadas conforme descrito anteriormente, mas usando buffer BRB-80 em vez de óleo de imagem. Os ovários dissecados foram então transferidos para microtubos contendo BRB-80 e incubados no gelo por 15^{minutos e 23} minutos. Após a incubação, os ovários foram transferidos para um recipiente de fundo de vidro com óleo de imagem, e o protocolo foi retomado a partir da etapa 3.1.

3. Imagem ao vivo

1. Coloque o prato de fundo de vidro no palco do microscópio usando o suporte apropriado.
2. Selecione câmaras de óvulos do estágio 7 ou 8 para a imagem.
   NOTA: Câmaras de ovos nesses estágios podem ser identificadas com base no tamanho dos oócitos e na posição nuclear. O óócito é claramente maior que as células individuais dos enfermeiros e ocupa aproximadamente um terço (estágio 7) a metade (estágio 8) da câmara do ovo. O núcleo do ovocíto está posicionado no córtex anterior do óvucito, adjacente às células^{enfermeiras 24}.
3. Evite câmaras de óvulos de imagem que mostrem descontinuidade na camada externa das células foliculares ou outros sinais de dano, que possam indicar perturbação mecânica causada pela pinça. Para uma qualidade de imagem ideal, utilize um sistema de imagem confocal rápido com alta relação sinal-ruído (SNR) e um objetivo de 63x (1,40 NA, imersão em óleo). Certifique-se de seguir os critérios de amostragem Nyquist-Shannon.
4. Ajuste o foco e determine a exposição apropriada, pois ela pode variar dependendo do construto EB1 usado (por exemplo, diferentes promotores ou etiquetas fluorescentes) e do sistema de microscópio. O sinal deve ser brilhante o suficiente para acompanhar a dinâmica dos cometas, mas não saturado ou obscurecido pela fluorescência de fundo.
5. Ajuste o laser de 488 nm para excitar o fluoróforo GFP (10% da potência do laser; ganho do detector = 750 V). Selecione uma janela de emissão apropriada de 500–550 nm ou um conjunto de filtros equivalente para o fluoróforo GFP.
6. Adquira filmes em time-lapse com duração mínima de 4 minutos, usando um intervalo de quadros de 500 ms (2 quadros/s) para obter dados suficientes para acompanhar MT e finais individuais. (Vídeo Suplementar 1 ilustra uma aquisição representativa em time-lapse adequada para análise subsequente de rastreamento de MT).
7. Processe as imagens adquiridas usando o processamento do detector de matriz no software de aquisição do microscópio com a força padrão do filtro de processamento.
   NOTA: Uma vez imersos em óleo de imagem, os ovários dissecados permanecem viáveis por até 90 minutos. Durante esse período, as câmaras dos ovos podem ser visualizadas sem sinais significativos de degeneração. Após esse período, uma nova fêmea deve ser dissecada e as câmaras de ovos frescos preparadas para imagem²⁰.

4. Processamento de imagem

Execute o seguinte fluxo de trabalho para gerar gráficos e estatísticas para quantificar vários parâmetros associados à dinâmica da MT. Execute cada etapa, seja automaticamente via macro/script ou manualmente seguindo o protocolo (Figura 2). Todos os macros Fiji, scripts de rastreamento e código de análise em Python usados nesse fluxo de trabalho são fornecidos como Arquivos de Codificação Suplementares 1–7.

1. Pré-processamento de imagem - PASSO 1
   Os passos a seguir preparam imagens brutas em time-lapse, corrigindo o descolorimento fotofónico e reduzindo o ruído de fundo, garantindo a estabilidade do sinal para o rastreamento. Primeiro, a visibilidade do EB1 é aprimorada usando um filtro de Diferença de Gaussas (DoG), que funciona como um filtro passa-banda espacial. Ao subtrair uma imagem fortemente borrada de uma imagem levemente borrada, esse processo suprime a névoa citoplasmática de baixa frequência e o ruído de pixels de alta frequência, enquanto isola o sinal limitado por difração dos cometas EB1. Segundo, um filtro de gradiente temporal é aplicado para realçar especificamente as pontas de MT em crescimento. A pilha de imagens é refatiada para mapear a dimensão temporal ao eixo espacial Y. Uma convolução 1D com um núcleo [-1 0 1] é então aplicada para calcular a derivada temporal de cada pixel, destacando a borda de ataque dos cometas em movimento, onde a intensidade aumenta mais rapidamente. A pilha é então fatiada de volta às suas dimensões originais, fundida em uma imagem composta e exportada para análise.
   NOTA: Esta etapa pode ser executada em lote para todos os arquivos de uma pasta, arrastando o arquivo macro File1.Step1_MTs_macro.ijm (Arquivo de Codificação Suplementar 1) para Fiji e rodando a macro.
   1. Instalação pré-requisito de plugin (Configuração única)
      1. Lançar Fiji. Navegue até Plugins > Instalar na barra de menus.
      2. No navegador de arquivos, selecione o arquivo File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (Supplementary Coding File 7) fornecido com este protocolo.
      3. Quando for solicitado salvar o plugin, certifique-se de que o destino é a pasta padrão de plugins dentro do seu diretório de instalação Fiji e clique em Salvar.
      4. Reinicie Fiji para concluir a instalação.
         NOTA: Esta versão compilada do plugin é idêntica à versão embutida de Fiji, mas remove a necessidade de uma instalação separada do Java Development Kit (JDK), simplificando o processo de configuração.
   2. Correção de água sanitária e redução de ruído:
      1. Abra Fiji e depois abra cada arquivo usando o plugin importador Bio-Formats
      2. Compense a decadência da fluorescência ao longo do tempo executando o plugin Bleeach Correction, usando a correção de branqueamento Simple-Ratio (fundo = 0).
      3. Execute o Filtro de Pilha de Kalman Compilado (acquisition_noise = 0,1; polarização = 0,7) para suprimir ruído aleatório de fótons enquanto preserva a dinâmica verdadeira do sinal ao longo do tempo
      4. Recorte a dimensão de tempo resultante da imagem para reduzir o tempo de processamento, se desejado.
         NOTA: Esses passos geram uma imagem com desrudo, que depois aparece como canal 1 no final do passo 1 (4.1.5) (Figura 3A). Recomenda-se excluir os primeiros 5 a 10 quadros (pontos de tempo), pois a janela rolante do filtro de Kalman filtra apenas parcialmente esses quadros iniciais.
   3. Diferença de aprimoramento de características dos Gaussanos (DoG):
      1. Duplique a imagem da 4.1.2.4 duas vezes (clique com o botão direito na imagem e clique em Duplicar).
      2. Aplique o plugin Gaussian Blur a uma cópia usando um sigma baixo (σ = 1).
      3. Aplique o plugin Gaussian Blur à outra cópia usando um high sigma (σ = 8).
      4. Abra o plugin Image Calculator e subtraia a imagem de alta sigma da imagem de baixa sigma (= Baixo – Alto) para isolar detalhes finos.
      5. Remova o fundo usando o Math > Subtrair de Fiji e selecione um valor (limiar DoG = 100) para manter apenas o sinal verdadeiro, se necessário.
         NOTA: Esses passos geram uma imagem de diferença de Gauss, que depois aparece como canal 2 no final do passo 1 (4.1.5) (Figura 3B).
   4. Aprimoramento do sinal EB1-GFP:
      1. Selecione a imagem da 4.1.2.4 e use o plugin Reslice com configurações: topo, sem interpolação.
      2. Use o plugin Convolve 2D com kernel [–1 0 1] para melhorar as pontas de MT.
      3. Use novamente o plugin Reslice com as mesmas configurações para restaurar as dimensões originais da imagem.
      4. NOTA: Esses passos gerarão uma imagem com um sinal EB1-GFP aprimorado. Esta imagem aparecerá posteriormente como canal 3 no final do passo 1 (4.1.5) (Figura 3C).
      5. Molhar canais e exportar imagem:
         1. Misture a imagem MT EB1-GFP (4.1.2.4) com a imagem Difference of Gaussians (4.1.3.5) e a imagem de aprimoramento de sinal EB1-GFP (4.1.4.3) usando o plugin Merge Channels. Certifique-se de que a imagem a ser usada para análise posterior seja colocada no Canal 3 durante o processo de fusão.
         2. Salve o arquivo resultante como um arquivo .tif, usando o formato de nomeação: "filename"_processed.tif. Garanta que a imagem usada para análise a jusante termine com _processed.tif
2. Regiões de Interesse (ROI) - PASSO 2
   Nessa etapa, três ROIs serão definidos ao longo do eixo anteroposterior do oócito: anterior (ROI1), médio (ROI2) e posterior (ROI3). Realize essa segmentação espacial para possibilitar a análise da dinâmica da MT em diferentes regiões do oócito.
   NOTA: Este Passo 2 pode ser executado para cada "nome de arquivo"_processed.tif arrastando o arquivo macro File_2_Step2_MTs_macro.ijm (Arquivo de Codificação Suplementar 2) até Fiji e pressionando Executar. A macro pedirá ao usuário que desenhe manualmente um retângulo no oócito. A região mais próxima do início do polígono (primeiro clique) corresponde ao primeiro retorno do investimento. A região retangular selecionada será automaticamente dividida em retornos de investimento retangulares iguais. Se nenhum retorno de investimento for salvo, os próximos passos serão executados na imagem completa.
   1. Definindo ROIs:
      1. Abra o arquivo de destino via Plugins → Bio-Formatos → Importador de Bio-Formatos.
      2. Use a ferramenta Polígono para desenhar uma região de interesse que abrange a região desejada.
      3. Adicione a região selecionada ao Gerenciador de ROI (pressione a tecla T).
      4. Repita o passo 4.2.1 para saber quantos retornos de investimento você precisa.
   2. Medir e exportar área:
      1. Selecione o primeiro retorno de investimento
      2. Execute Analyze → Measure e salve o valor Area como um arquivo nomeado: "filename_processed_RoiArea.csv
         NOTA: O nome do arquivo deve corresponder ao nome original da imagem e terminar com: _processed_RoiArea.csv
      3. Use o ROI Manager para economizar os ROIs. Use o mesmo nome de arquivo com o. Extensão de ROI para um único ROI, ou a extensão .zip para múltiplos ROIs.
3. Detectar e rastrear cometas EB1-GFP - PASSO 3
   Use o plugin^{TrackMate 25} para detectar cometas EB1-GFP e acompanhar seus movimentos ao longo do tempo.
   NOTA: O PASSO 3 pode ser aplicado a cada "nome de arquivo"_processed.tif arrastando o arquivo macro File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (Arquivo de Codificação Suplementar 3) para Fiji e pressionando EXECUTAR. Depois, selecione uma pasta a ser processada. Os ROIs serão carregados automaticamente e a análise será realizada para cada arquivo, gerando saídas de spot e track correspondentes. Antes do processamento em lote, recomenda-se analisar 2 a 3 imagens representativas para verificar visualmente se as configurações padrão do detector e do rastreador são adequadas ao tamanho e à dinâmica dos cometas. Se as configurações forem adequadas, o usuário pode ajustar os parâmetros relevantes para rastrear com precisão as pontas EB1, minimizando assim falsos negativos e falsos positivos.
   1. Abra o arquivo de destino via Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer
   2. Abra o plugin TrackMate. Selecione SIM se for solicitado trocar T e Z.
   3. Selecione detector de log. Ajuste o diâmetro da partícula para 0,5 μm (ajuste conforme necessário)
   4. Defina o Limiar de Qualidade para 30 (ajuste conforme necessário). Ative tanto a localização Sub-pixel quanto o pré-processamento com um filtro mediano.
   5. Remova qualquer filtragem adicional de pontos. Selecione o método de rastreamento de Kalman
   6. Defina um raio inicial de busca para 0,5, raio de busca de 0,7 e gap máximo de quadro de 2 (ajuste conforme necessário - O raio inicial de busca gera o rastreador, o raio de busca controla até onde um ponto pode se mover entre quadros, e o intervalo máximo de quadro permite desaparecimentos curtos na trajetória).
   7. Pule o filtro de faixas que vai aparecer. Quando a faixa estiver concluída, vá em Spots → Exportar para CSV e nomeie o arquivo: "nome do arquivo"_ROI01_spots.csv
   8. NOTA: A nomeação dos arquivos deve refletir o número de ROIs analisados. Se múltiplos ROIs forem usados, salve cada arquivo de saída com um identificador correspondente, como _ROI01, _ROI02, etc.
4. Visualização de dados e análise quantitativa - PASSO 4
   Use os scripts em Python para processar os dados de rastreamento e calcular parâmetros-chave, incluindo número de cometas, velocidade, vida útil, consistência angular e orientação. Esses scripts geram tabelas resumidas (arquivos CSV), gráficos e análises estatísticas para apoiar a análise quantitativa da dinâmica da MT (Figura 4).
   1. Configuração do ambiente de software:
      1. Instale a distribuição Python (3.12). Garanta que as seguintes bibliotecas externas em Python estejam instaladas (via pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodels): Pandas e NumPy (para manejo de estruturas de dados e computação numérica), SciPy e Statsmodels (especificamente scipy.stats, para estatística circular e testes de hipóteses), Matplotlib e Seaborn (para gerar gráficos de rosas e gráficos de barras estatísticos), IPython (para ferramentas de exibição dentro do caderno), Jupyter Notebook (para usar o caderno).
      2. Coloque os módulos de análise personalizados (File_5_MTModule1.py e File_6_MTModule2.py – Arquivos de Codificação Suplementares 5 e 6) no diretório raiz ao lado do caderno de análise (Arquivo 4_Step4_MTs_results.ipynb – Arquivo de Codificação Suplementar 4).
      3. Abra o caderno Jupyter executando o comando "jupyter notebook" no terminal Python e carregue o Arquivo 4_Step4_MTs_results.ipynb – Arquivo de Codificação Suplementar 4 caderno.
   2. Dados de entrada e definição de parâmetros:
      1. Preencha o banco de dados para mapear réplicas biológicas aos metadados experimentais deles.
      2. Forneça o seguinte para cada experimento: Nome Base: A string identificadora única encontrada nos nomes dos arquivos, Condição: O grupo experimental (ex.: "Controle", "Tratado"), Ângulo de correção: O ângulo necessário para alinhar o ROI com o eixo biológico (ex.: Anterior = 0°).
      3. Ajuste os parâmetros: exportar formato de imagem e dpi, plotar cores e o tamanho padrão da caixa para cálculos angulares
      4. Defina os parâmetros de filtragem de dados para excluir faixas curtas: Comprimento mínimo de trilha: faixas menores que essa duração são descartadas
   3. Execução do pipeline de análise:
      1. Leia e execute todas as células de código para processar os dados brutos de rastreamento. O script percorre a lista do banco de dados para executar os seguintes passos procedimentais:
         1. Identifique todos os arquivos CSV específicos do ROI associados a cada Nome Base.
         2. Filtrar trilhas com base no comprimento mínimo (apenas trajetórias persistentes por mais de 3 quadros são mantidas), calcular velocidades instantâneas, calcular o deslocamento total e aplicar a correção de ângulo de referência a todas as trajetórias.
         3. Normalize a contagem de cometas pela área do ROI (carregada a partir dos metadados) para calcular a densidade do cometa.
      2. Agregue os dados processados em um conjunto de dados mestre (df_all) e calcule estatísticas gerais resumidas (velocidade média, duração da trilha e comprimento do vetor de consistência angular) para cada ROI.
      3. Execute a função make_combined_rose_panel para gerar parcelas de rosas agrupadas. Isso cria uma comparação lado a lado dos painéis das distribuições angulares para todos os ROIs dentro de cada condição experimental. Execute create_comprehensive_analysis_plots_enhanced para criar gráficos de barras para métricas escalares.
      4. Execute a função run_angle_analysis_pipeline para realizar uma análise de orientação específica:
         1. Classifique as trilhas em bins de orientação usando duas estratégias: Binning Cardinal (4 bins de largura de 90°: Norte/Anterior, Leste/Direita, Sul/Posterior, Oeste/Esquerda) e Binning Anterior/Posterior (2 bins de 180° Anterior vs. Posterior).
         2. Calcule a porcentagem de trilhas se movendo em cada orientação definida por oócito.
   4. Análise estatística e geração de resultados:
      1. Itere por métricas escalares definidas: número médio de cometas por quadro por área, duração média da trilha do cometa e velocidade média do cometa. Para cada métrica, ela realiza:
         1. Realize testes de Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney U para comparações independentes entre condições experimentais.
         2. Realize testes de Friedman ou Wilcoxon para avaliar a consistência entre ROIs.
         3. Realize testes de Rank Assinado de Friedman e Wilcoxon (usando o método Pratt) para avaliar preferências de orientação (por exemplo, Norte vs. Sul) dentro de cada ROI.
         4. Exporte os seguintes resultados para o diretório de Resultados : CSVs resumidos (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), Relatórios Estatísticos (por exemplo, Cometa Médio velocity_mwu.csv) e Gráficos (arquivos PNG de alta resolução).
            NOTA: O Passo 4 só pode ser executado em Python. Abra o File_4_Step4_MTs_results.ipynb e leia e execute todas as células. Cada célula contém instruções para execução e o respectivo resultado esperado.

5. Análise estatística:

NOTA: Devido à distribuição não gaussiana dos dados de acompanhamento, testes estatísticos não paramétricos foram empregados para todas as comparações.

1. Avalie diferenças independentes entre condições experimentais (por exemplo, Controle vs. Tratada) usando o teste Mann-Whitney U (para dois grupos) ou o teste de Kruskal-Wallis, seguido por comparações Mann-Whitney pares pós-hoc (para >2 grupos)).
2. Avalie as preferências orientacionais dentro do mesmo ROI usando o teste Friedman (diferença global) seguido pelo teste Wilcoxon Signed-Rank (par a par).
3. Trate de laços de diferença zero usando o método Pratt.
4. Relate as comparações par a par como valores-p não corrigidos para preservar o poder estatístico. Use os scripts fornecidos para reportar tanto os valores p brutos quanto ajustados, com significância definida em 0,05. Informe todas as estatísticas resumidas como Média ± Erro Padrão da Média (SEM), salvo indicação em contrário).

Results

Esse protocolo foi utilizado com sucesso para analisar a dinâmica de crescimento e a polaridade da MT em oócitos de Drosophila melanogaster em estágios intermediários da oogênese, utilizando EB1-GFP, uma proteína de acompanhamento positivo que marca os locais de polimerização ativa da MT^17,18. Quando fotografada por microscopia confocal de varredura a laser, a EB1-GFP aparece como "cometas" brilhantes e pontuados que se movem na orientação do crescimento da MT^17,18 (Figura 3A; Vídeo Suplementar 1). Rastrear e quantificar esses cometas permite uma avaliação precisa da nucleação, elongação e organização do MT dentro do oócito. Usando esse protocolo de fluxo de trabalho, a dinâmica da MT foi avaliada em oócitos de controle e em oócitos submetidos a perturbação experimental da rede MT. Especificamente, o comportamento do cometa EB1 foi comparado em três condições: oócitos controle não tratados, oócitos controle tratados a frio e oócitos mutantes mutantes de p. atronina tratados a^{frio 12,26}. O tratamento a frio induz a despolimerização da MT, permitindo a avaliação do crescimento da MT durante a recuperação. Oócitos mutantes dep-atronina heterozigóticos (+/patr⁰⁵²⁵²) foram incluídos como controle positivo para dinâmica MT comprometida. A patronina é um estabilizador conservado da extremidade inferior^{do MT 27}, e um componente central dos ncMTOCs nos óócitos¹² e outros^{tecidos 2}. Trabalhos anteriores demonstraram que mutantes patroninas submetidos à despolimerização por MT apresentam uma diminuição significativa no número de cometas EB1 após o recrescimento¹². Assim, incluir mutantes patroninas heterozigóticas permitiu validar o método contra um fundo conhecido de defeito no recrescimento. Os óócitos dos estágios 7-8 foram imaturizados quando os centrossomos são atenuados e as MTs são geradas por vias acentrossômicas.

Consistente com observações anteriores, a maior densidade de cometas EB1 foi detectada na região anterior do oócito, com uma diminuição gradual em direção ao^14,15 posterior (Figura 5B; Tabela 1; Tabelas Suplementares 1 e 2). Para distinguir entre eventos legítimos de polimerização MT e sinais estacionários ou fora do plano, este protocolo discrimina entre o número total de focos EB1-GFP detectados e o subconjunto de focos que são móveis. A fração imóvel provavelmente representa cometas estacionários ou cometas movendo-se predominantemente no plano axial (Figura 5A,B). Análises do comprimento da trilha MT e da velocidade de crescimento foram realizadas exclusivamente nos cometas móveis EB1-GFP para evitar a inclusão de sinais estacionários ou movimentos axiais que pudessem interferir na estimativa do comprimento e da velocidade da trilha. Os focos totais de EB1-GFP e a fração móvel são apresentados em gráficos separados para permitir a comparação direta entre a detecção geral e o comportamento dinâmico (Figura 5A,B). Nos oócitos de controle, o protocolo mediu 0,189 ± 0,02 SEM cometas móveis EB1/^{μm 2} (18,9 cometas EB1/100^{μm 2}) na região anterior, seguido por 0,064 ± 0,02 SEM e 0,043 ± 0,01 SEM cometas móveis EB1/^{μm 2} nas regiões média e posterior, respectivamente (6,4 e 4,3 cometas EB1/100^{μm 2}) (Figura 5B; Tabela 1; Tabelas Suplementares 1 e 2). Um estudo^{anterior 28} que mediu cometas EB1 no mesmo estágio de desenvolvimento detectou 48,54 cometas EB1/100μm², o que é maior do que os valores detectados aqui para cometas EB1-GFP móveis. No entanto, os valores medidos são consistentes ao considerar o número total de cometas EB1-GFP detectados (Figura 5A; Tabela 1; Tabelas Suplementares 1 e 2). A seção de Materiais e Métodos desse estudo não especifica quantos z-stacks foram usados para registrar os oócitos. Portanto, é possível que mais de um z-stack tenha sido incluído na análise, o que pode ter contribuído para o maior número de cometas EB1-GFP detectados. Outro fator que pode influenciar os valores relatados é a região do oócito selecionada para quantificação do cometa. Se as regiões de interesse fossem escolhidas mais próximas do polo mais anterior, onde a densidade do cometa EB1 é maior, isso poderia ter aumentado a densidade média do cometa em comparação com as medições apresentadas aqui. No entanto, os resultados obtidos aqui são da mesma ordem de magnitude e refletem consistentemente uma diminuição na densidade do cometa EB1 em direção à região posterior, conforme relatado^{anteriormente 14,15}.

Após o recrescimento da MT induzida pelo frio, os oócitos controle apresentaram números de cometas EB1 comparáveis aos controles não tratados, indicando uma recuperação robusta da MT. Em contraste, consistente com relatos^{anteriores 12}, mutantes patroninas apresentaram uma redução significativa no número de cometas EB1 móveis na região anterior (ROI1) em comparação com ambos os controles (Figura 5B; Tabela 1; Tabelas Suplementares 1 e 2). Embora o número de cometas nas regiões média e posterior (ROIs 2 e 3) também tenha tendido a cair, essas diferenças não foram estatisticamente significativas (Figura 5B). A redução observada aqui foi menos pronunciada do que a relatada nos ensaios baseados em^{nocodazol 12}. Isso provavelmente reflete o uso de mutantes patroninas heterozigóticos nos quais apenas um alelo sofre mutação. Além disso, o protocolo de despolimerização induzida pelo frio pode não despolimerizar completamente todas as MTs, e o intervalo de 5 a 15 minutos entre a remoção do gelo e a imagem provavelmente permite alguma nucleação e regeneração da MT antes da aquisição dos dados. Em contraste, ensaios à base de nocodazol são realizados imediatamente após a inativação do colcemídeo usando um laser^{UV 12} do microscópio. No entanto, esses resultados demonstram que esse protocolo pode detectar alterações biologicamente relevantes e específicas de região na organização da MT. Eles também se alinham com o enriquecimento de ncMTOCs e de Patronina, um componente central do ncMTOC, na parte anterior do oócito. A redução mais fraca no número de cometas nas regiões média e posterior também pode refletir a exclusão desenvolvimental de ncMTOCs e Patronin do córtex posterior nesses^{estágios 12}.

A análise do comprimento da trilha EB1 nos oócitos controle revelou trilhas de cometas mais longas na região anterior do oócito (0,613 μm ± 0,04 SEM) e cometas mais curtos nas regiões média e posterior (0,463 μm ± 0,04 SEM e 0,488 μm ± 0,05 SEM, respectivamente) (Figura 5C; Tabela 1; Tabelas Suplementares 1 e 2). Essa constatação é consistente com dados anteriores mostrando que as MTs persistem por períodos mais curtos no polo posterior do que no polo anterior, sugerindo que as MTs no polo posterior são¹⁴ mais curtas. Em oócitos mutantes patronina heterozigóticos tratados a frio, o comprimento do cometa EB1 foi significativamente reduzido em comparação com controles tratados a frio nas regiões anterior e posterior. Uma tendência semelhante, não estatisticamente significativa, foi observada na região central (Figura 5C; Tabela 1; Tabelas Suplementares 1 e 2), sugerindo uma redução parcial na estabilidade da MT. Em conjunto, esses resultados apoiam o papel conhecido da Patronina como estabilizador de MT de extremidade negativa e são consistentes com observações anteriores em células cultivadas por Drosophila, onde a perda de Patronin resulta em fusos de MT mais^{curtos 12,27}. Esses achados também destacam a sensibilidade desse protocolo na detecção de perturbações sutis, porém biologicamente significativas, na dinâmica da MT.

Ao medir a velocidade do cometa EB1 em oócitos de controle, a análise detectou velocidades médias de 0,208 ± 0,01 μm/s, 0,207 ± 0,01 μm/s e 0,202 ± 0,01 μm/s nas regiões anterior, média e posterior, respectivamente (Figura 5D; Tabela 1; Tabelas Suplementares 1 e 2), que é consistente com trabalhos anteriores^14,15. Os oócitos controle apresentaram uma leve diminuição na velocidade de crescimento da MT da região anterior para a posterior. Isso pode refletir o enriquecimento de ncMTOCs, juntamente com potencialmente outras proteínas associadas a microtúbulos (MAPs) não identificadas, nas regiões anterolaterais, que facilitam o crescimento e a extensão dos MT, contribuindo assim para a diminuição posterior observada. Em oócitos tratados a frio, mutantes patronina heterozigóticos apresentaram uma tendência não estatisticamente significativa para uma leve redução na velocidade de crescimento da MT em comparação com os controles, embora essa diferença não tenha alcançado significância estatística (Figura 5D; Tabela 1; Tabelas Suplementares 1 e 2). Essa descoberta é consistente com observações anteriores em células-tronco neurais de Drosophila expressando mutantes^{patronina 29}.

A localização dos ncMTOCs na região anterolateral do oócito, juntamente com sua exclusão da parte posterior, faz com que a maioria dos MTs seja cultivada com suas extremidades negativas ancoradas no córtex anterolateral. Consequentemente, estabelece-se um gradiente antero-posterior de MTs dentro do oócito, com um viés de orientação modesto: 60% dos MTs crescem em direção à posterior e 40% à¹⁴ anterior. Nosso protocolo detectou com sucesso esse viés em oócitos de controle em todas as regiões do oócito (Figura 5E). O viés na orientação da MT foi mais pronunciado na região posterior, conforme relatado^{anteriormente 14}. Notavelmente, esse enriquecimento posterior no viés de orientação foi perdido após tratamento a frio em oócitos mutantes patronina controle e heterozigóticos (Figura 5E,F). Em oócitos controle tratados a frio, a orientação da MT deslocou-se para crescimento direcionado anteriormente em todas as regiões. Esse deslocamento apareceu como uma tendência nas regiões anterior e média e tornou-se estatisticamente significativo na região posterior (Figura 5F). Uma possível explicação para essa perda de viés em direção ao lado posterior é que, sob condições tratadas a frio, MTs recém-polimerizados podem precisar de tempo para se associar a MAPs, como proteínas motoras, que promovem a estabilização e/ou a reticulação dos MTs. O recrutamento tardio desses fatores pode prejudicar o reforço dos MTs orientados posteriormente. Em resumo, esse protocolo permite uma análise sensível e quantitativa do crescimento, comprimento, velocidade e orientação da MT dentro dos oócitos. Ele detecta de forma confiável mudanças específicas de região e biologicamente significativas na dinâmica da MT, em linha com estudos anteriores, e demonstra sensibilidade para resolver diferenças sutis no comportamento da MT, como ilustrado pelas observações feitas em mutantesheterozigotos de p-atronina.

Figura 1: Oogênese de Drosophila melanogaster (A) Visão geral da oogênese no ovário de Drosophila . Cada ovário contém de 12 a 16 ovarios, que funcionam como uma linha de produção de óvulos. A oogênese começa no germarium, onde 2 a 3 células-tronco germinativas se dividem assimetricamente, produzindo uma célula-tronco e uma célula-filha que começam a se diferenciar. Essas células passam por 4 divisões mitóticas para formar um cisto de 16 células conectado por canais circulares. A partir dessas células, uma se torna o óvulo, enquanto as outras servem como células enfermeiras, apoiando o crescimento e desenvolvimento do óócito até um ovocíto de estágio 14 na extremidade posterior. (B) Esquema da câmara de ovos de Drosophila estágio 9. As MTs são geradas a partir de ncMTOCs localizados no córtex anterolateral, que são excluídos do lado posterior do^{oócito 12}. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Diagrama do fluxo de trabalho do protocolo. Visão geral das principais etapas desde a dissecação de ovários e imagens ao vivo até o rastreamento de cometas e análise quantitativa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Imagens representativas geradas pelo processamento dos oócitos do estágio 7–8. (A-E) Imagens representativas ilustrando o fluxo de processamento de imagens na etapa 1 aplicadas a ovocitos do estágio 7–8 a partir de oócitos tratados a frio com patronina 05252 controle, controle tratado a frio e patronina^{heterozigótica 05252} . Os canais são uma imagem representativa de uma projeção máxima de 2 quadros de um filme time-lapse de 150 quadros adquiridos a 0,5 s por quadro. (A) Canal 1, que corresponde à geração de uma imagem com desrudo a partir do óócito correspondente com imagem. (B) Canal 2, que corresponde à geração de uma diferença de imagem gaussiana. (C) Canal 3, que corresponde à geração de uma imagem onde o sinal dos cometas EB1-GFP foi aprimorado para mostrar as pontas dos cometas. (D) Fusão dos canais 2 e 3, que ajuda a visualizar as pontas dos cometas resultantes do processamento do canal 2. (E) Trajetórias de cometas EB1-GFP geradas a partir do time-lapse C nas FIJI usando o plugin Temporal Color Code para ilustrar a dinâmica da MT. O código de cores indica a projeção de tempo para 20 quadros (0,50 s entre os quadros). Barra da escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Captura de tela de uma seção no PASSO 4 Jupyter Notebook. O caderno é estruturado com células Markdown que fornecem instruções autoexplicativas, seguidas por células de código que geram resultados e logs em tempo real. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5: Análise da dinâmica do cometa EB1-GFP em oócitos de controle e tratados a frio dos estágios 7-8. Os dados representam a média ± SEM por ROI (ROI1–ROI3) para oócitos tratados a frio controle, controle ^{e patronina 05252} tratados a frio. Medições de cometas EB1-GFP foram obtidas a partir de imagens de time-lapse processadas em FIJI; a menos que indicado em contrário, as análises eram realizadas em imagens processadas no Canal 3. O número total de cometas EB1-GFP foi analisado a partir de imagens do Canal 2 (Imagem DoG). A significância estatística foi avaliada usando o teste de Kruskal–Wallis seguido por comparações pós-hoc de Mann–Whitney, ou o teste de Friedman seguido pelos testes de pares pareados de Wilcoxon, conforme apropriado (p < 0,05; p < 0,001; p < 0,0001). (A) Gráfico de pontos de dispersão mostrando o número médio de números totais de cometas EB1-GFP. (B) Gráfico de pontos de dispersão mostrando o número médio de cometas EB1-GFP móveis. (C) Gráfico de pontos de dispersão mostrando o comprimento médio da trilha do cometa EB1-GFP. (D) Gráfico de pontos de dispersão mostrando a velocidade média dos cometas EB1-GFP. (E) Gráficos de Rose mostrando a orientação das trilhas EB1-GFP dentro de ROI1–ROI3 no controle (n = 14), controle tratado a frio (n = 12) e ^{patronina 05252} tratados a frio (n = 11) ovocitos. A porcentagem média de cada trilho por óvuto, orientada para o anterior (A) ou posterior (P), é indicada para cada condição e ROI. (F) Gráfico de barras mostrando a porcentagem média dos ângulos de trajetória do cometa EB1-GFP orientados para os lados anterior e posterior do oócito. As porcentagens foram calculadas por ovocito e representam a distribuição relativa da orientação do cometa dentro de cada ROI. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Métrica	ROI	Controle (n=14)	Controle tratado a frio (n=12)	Patronin05252 Tratado a Frio (N=11)
Número total de cometas EB1-GFP (#/μm2)	ROI 1 (anterior)	0,667 ± 0,18	0,691 ± 0,20	0,570 ± 0,17
	ROI 2 (meio)	0,394 ± 0,11	0,532 ± 0,15	0,400 ± 0,12
	ROI 3 (posterior)	0,353 ± 0,09	0,561 ± 0,16	0,378 ± 0,11
Número do cometa EB1-GFP móvel (#/μm2)	ROI 1 (anterior)	0,189 ± 0,02	0,175 ± 0,03	0,099 ± 0,03
	ROI 2 (meio)	0,064 ± 0,02	0,091 ± 0,02	0,056 ± 0,02
	ROI 3 (posterior)	0,043 ± 0,01	0,104 ± 0,03	0,047 ± 0,02
EB1-GFP Comprimento da trilha do cometa (μm)	ROI 1 (anterior)	0,613 ± 0,04	0,621 ± 0,03	0,478 ± 0,07
	ROI 2 (meio)	0,463 ± 0,04	0,535 ± 0,03	0,410 ± 0,05
	ROI 3 (posterior)	0,488± 0,05	0,543 ± 0,04	0,393 ± 0,05
Velocidade do cometa EB1-GFP (μm/s)	ROI 1 (anterior)	0,208 ± 0,01	0,198 ± 0,01	0,188 ± 0,01
	ROI 2 (meio)	0,207 ± 0,01	0,199 ± 0,01	0,186 ± 0,01
	ROI 3 (posterior)	0,202 ± 0,01	0,194 ± 0,01	0,177 ± 0,01

Tabela 1. Resumo das medições do cometa EB1-GFP em regiões antero-posteriores em oócitos analisados. As medições foram obtidas a partir de oócitos tratados a frio com patronina ⁰⁵²⁵² em controle e heterozigóticos. As regiões de interesse foram definidas como ROI1 (anterior), ROI2 (média) e ROI3 (posterior).

Tabela Suplementar 1. Análise estatística das medições de cometas EB1-GFP entre condições experimentais. Os valores p indicam diferenças entre oócitos controle, controle tratados a frio e patronina⁰⁵²⁵² tratados a frio heterozigóticos para cada ROI (ROI1-ROI3). Comparações globais entre as três condições foram realizadas usando o teste de Kruskal–Wallis, seguidas por comparações post hoc de Mann–Whitney par a par.  Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Tabela Suplementar 2. Comparação estatística das medições do cometa EB1-GFP entre ROIs em cada condição experimental. Os valores p indicam diferenças entre ROI1 (anterior), ROI2 (médio) e ROI3 (posterior) dentro de oócitos tratados a frio com patronina 05252 em controle e patronina⁰⁵²⁵² tratados a frio em controle e heterozigotos. As diferenças gerais entre os ROIs em cada condição foram avaliadas usando o teste de Friedman. Comparações par a par entre ROIs foram posteriormente realizadas usando testes de par pareado de Wilcoxon com rangos assinados. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Vídeo Suplementar 1. Imagens em time-lapse da proteína de acompanhamento de extremidade positiva EB1-GFP em um oócito de estágio controle 7–8, demonstrando uma aquisição representativa adequada para análise subsequente de rastreamento de MT (relacionada à Figura 3). Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Arquivo de Codificação Suplementar 1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm. Um macro Fiji/ImageJ para pré-processamento de imagem. Ele automatiza a correção por fotobranqueamento, filtragem de Kalman e subtração de fundo usando um filtro de Diferença de Gaussas (DoG). Também aplica um aprimoramento de gradiente temporal (refatiamento e convolução 1D) para afiar as bordas de ataque das pontas de MT e melhorar a fidelidade do rastreamento. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Arquivo de Codificação Suplementar 2: File_2_Step2_MTs_macro.ijm. Uma macro Fiji/ImageJ para definição semi-automatizada de Região de Interesse (ROI). Ele solicita ao usuário que defina o limite dos oócitos e segmenta automaticamente a seleção em zonas equidistantes (em nosso exemplo, 3 zonas: Anterior, Central e Posterior) para permitir a estratificação regional da análise. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Arquivo de Codificação Suplementar 3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Um script em Python (executado dentro de Fiji/ImageJ) que realiza o rastreamento automatizado dos cometas EB1 usando o Trackmate. Ele processa em lote imagens pré-processadas, detecta cometas usando parâmetros de qualidade definidos, os vincula em trajetórias e exporta os dados brutos de coordenadas como arquivos CSV. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Arquivo de Codificação Suplementar 4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb. Um Jupyter Notebook que serve como interface principal para análise quantitativa. Ele carrega os dados brutos de rastreamento, executa o pipeline de análise e gera todos os resultados finais, incluindo gráficos de rosas, tabelas estatísticas resumidas e gráficos comparativos para densidade, velocidade e vida útil dos cometas. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Arquivo de Codificação Suplementar 5: File_5_MTModule1.py. Um módulo Python personalizado contendo funções utilitárias fundamentais usadas para extração de dados e cálculos geométricos básicos. Inclui funções para encontrar arquivos ROI, calcular velocidades instantâneas e calcular deslocamentos angulares básicos. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Arquivo Suplementar de Codificação 6: File_6_MTModule2.py. Um módulo Python personalizado contendo funções avançadas de análise e visualização. Ele abriga os algoritmos para o pipeline de análise de orientação (binning cardinal vs. axial), testes estatísticos robustos (método Friedman/Wilcoxon com Pratt) e a geração de gráficos polares (rosas) de qualidade para publicação. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Arquivo de Codificação Suplementar 7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. Um plugin compilado Java Kalman Filter para Fiji/ImageJ é necessário para as etapas de redução de ruído na macro de pré-processamento. Essa versão independente elimina a necessidade de um Java Development Kit (JDK) separado, simplificando a configuração de software do usuário. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo

Discussion

Imagens ao vivo da dinâmica da MT em oócitos apresentam desafios únicos, pois são necessários conjuntos de dados de alta qualidade e análises quantitativas para extrair informações significativas. Embora estudos anteriores tenham relatado abordagens de imagem ao vivo^{14, 15 e 16}, as etapas da análise de imagem são frequentemente altamente personalizadas, e os protocolos não fornecem detalhes suficientes para a reprodutibilidade. Consequentemente, pesquisadores sem ampla expertise em imagem ou computação podem enfrentar barreiras para reproduzir essas análises. Para enfrentar esses desafios, foi desenvolvido um fluxo de trabalho simplificado, combinando imagens ao vivo Airyscan de alta resolução com macros e scripts automatizados e amigáveis ao usuário. Esse pipeline permite a detecção e rastreamento eficientes dos cometas EB1, seguidos por uma análise quantitativa da orientação, velocidade e organização espacial da MT. Ao minimizar a intervenção manual e fornecer instruções claras passo a passo, o fluxo de trabalho promove a acessibilidade e a reprodutibilidade da análise da dinâmica da MT em ovócitos.

A dissecação do ovário e a preparação da amostra são passos iniciais críticos. Os oócitos devem ser cuidadosamente dissecados para evitar danos mecânicos, e a duração da imagem deve ser limitada a 90 minutos para manter a viabilidade²⁰. A seleção do estádio é importante: após a metade da oogênese, o oócito aumenta de tamanho e acumula gema no citoplasma, o que torna a visualização do sinal EB1 cada vez mais difícil após o estágio 9. Portanto, não é recomendada a realização de imagens além do estágio^9. Além disso, para quantificações reprodutíveis, quando possível, oócitos de tamanho comparável são preferíveis, pois isso garante que regiões definidas de interesse correspondam a posições equivalentes antero-posteriores entre amostras.

O controle de temperatura é essencial para a reprodutibilidade. Os estoques de moscas devem ser mantidos em condições padrão de cultura (25 °C) para apoiar o desenvolvimento normal e a expressão consistente de EB1-GFP, especialmente ao usar o sistema GAL4/UAS, que é sensível a flutuações de temperatura. A estabilidade da temperatura durante a imagem é igualmente importante, pois variações podem afetar a dinâmica da MT. Embora não seja necessário um compartimento com controle de temperatura, recomenda-se evitar flutuações de temperatura durante a aquisição.

Para aquisição de imagem, a imagem confocal do detector de matriz foi selecionada por sua alta sensibilidade e melhora SNR, minimizando assim a necessidade de redução de ruído após a aquisição. Objetivos de alta abertura numérica (o mais altos possível) em combinação com o correspondente adequado do índice de refração devem ser usados para maximizar a resolução lateral e axial, que é fundamental para resolver cometas individuais em redes densas. Além disso, os critérios de amostragem^{Nyquist-Shannon 30} devem ser seguidos em XYZ e tempo para evitar perda de precisão no rastreamento do cometa. Igualmente importante é a seleção cuidadosa do plano de imagem ao longo do eixo z. Imagens em profundidade demais resultam em perda de fluorescência devido à dispersão da luz, enquanto restringir a aquisição à superfície cortical não consegue capturar toda a dinâmica dos cometas EB1. Os dados mais informativos são obtidos em uma posição intermediária z. Oócitos nos quais o núcleo se encaixa dentro do plano selecionado devem ser evitados, pois o compartimento nuclear desloca uma grande parte do citoplasma e não possui trilhos EB1, reduzindo assim o número de cometas detectáveis.

Embora otimizado para imagens confocais baseadas em detectores de matriz, esse pipeline de análise é independente de hardware e compatível com outras modalidades, como microscopia confocal de disco giradisso. No entanto, os usuários devem estar cientes de que sistemas com menor NA ou SNR podem exigir ajustes nos parâmetros de pré-processamento do macro (por exemplo, tolerância ao ruído/sigmas DoG) e podem resultar em menor densidade de detecção de cometas em comparação com os valores apresentados neste estudo. No entanto, embora os valores absolutos possam variar entre sistemas, as tendências relativas observadas entre condições experimentais e ROIs devem permanecer robustas.

Dada a grande estrutura 3D do óvulo, a imagem 2D captura apenas uma seção óptica da rede MT. Consequentemente, cometas que se movem acentuadamente ao longo do eixo z podem sair do plano focal, potencialmente levando a uma subestimação dos tempos de vida da trilha e da velocidade absoluta (já que apenas a componente xy do vetor velocidade é medida). No entanto, imagens volumétricas 3D de alta velocidade de todo o oócito exigiriam campos de visão (FOV) menores, tempos de exposição mais curtos e tempos de resposta do detector mais rápidos, reduzindo assim a SNR e distribuindo o tempo de aquisição entre múltiplas fatias z, comprometendo a resolução temporal necessária para rastrear cometas EB1 rápidos. Para mitigar cometas immóveis e artefatos fora de foco, filtros convolucionais e de duração mínima foram aplicados (excluindo trilhas < 3 quadros) para remover pontos transitórios que atravessam o plano focal. Além disso, como essa limitação geométrica se aplica uniformemente em todas as condições experimentais, as diferenças relativas observadas na densidade, velocidade e orientação do cometa permanecem robustas. Embora técnicas emergentes como microscopia de campo de luz idealmente capturem a estrutura 3D completa simultaneamente, elas ainda não estão amplamente disponíveis. No entanto, os valores medidos para todos os parâmetros da dinâmica da MT são consistentes com relatórios anteriores, indicando que este protocolo é adequado para investigar a dinâmica da MT em diferentes configurações experimentais.

Antes de usar os macros nesse protocolo, recomenda-se processar manualmente as primeiras imagens para garantir que os parâmetros do software estejam corretamente otimizados. Fatores como resolução de imagem, ampliação, relação sinal-ruído, taxa de quadros e se os dados são de plano único ou de pilha z podem influenciar a precisão do rastreamento. Ajustando iterativamente os parâmetros enquanto inspecionam visualmente as faixas resultantes para minimizar falsos positivos e falsos negativos. Uma vez otimizados, aplique os parâmetros de forma consistente entre os conjuntos de dados para garantir a reprodutibilidade.

Por fim, algumas limitações em relação à interpretação biológica devem ser observadas. O EB1-GFP rotula seletivamente o MT crescente mais as extremidades e, portanto, relata os locais de polimerização ativa de MT, em vez de toda a população de MT. MTs estáveis e não polimerizantes presentes durante o período de imagem não são detectados por este método. Embora essa limitação seja menos restritiva nos oócitos em meio à oogênese, onde a maioria dos MTs é altamente dinâmica, deve ser considerada ao aplicar o protocolo a outros tipos celulares com populações substanciais estáveis de MT, como os neurônios³¹.

Em conclusão, esse fluxo de trabalho permite uma análise quantitativa de alta resolução da dinâmica da MT em oócitos de Drosophila . Ao integrar dissecação otimizada, imagens confocais confocais em matriz e ferramentas automatizadas de análise, oferece um método rigoroso, porém acessível, para investigar reguladores de MT em um contexto acentrossomal. Embora validado principalmente em ovócitos, os princípios dessa abordagem são adaptáveis, após otimização, a outros tipos celulares, incluindo células não divididas como neurônios e epitélios, oferecendo uma plataforma escalável para triagens genéticas e estudos mecanicistas da organização da MT.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pinça Dumont #5	Ferramentas Científicas Finas	11252-20
EB1::GFP	Do Dr. Antoine Guichet, CNRS, Institut Jacques Monod, França		Genótipo: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Placas de Petri com fundo de vidro	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα 4-Gal4-VP16	Centro de Estoques Drosophila de Bloomington	7062	Genótipo: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Oil 10S, VOLTALEF	VWR Chemicals	24627.188
Mutante Patronin	Centro de Estoques Drosophila de Bloomington	16647	Genótipo: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
W1118	Centro de Estoques Drosophila de Bloomington	3605
Zeiss LSM 980 com Airyscan 2	Zeiss