Experimentos de imunocoloração e penetração de corantes para definir proteínas de junção septata plissada no núcleo em epitélios embrionários de Drosophila

Resumo

Esses protocolos descrevem como caracterizar a organização e a função de oclusão das junções do septo plissado no epitélio embrionário de Drosophila no controle e mutante.

Resumo

O objetivo desses protocolos é avaliar a organização e a função barreira das junções septadas plissadas (pSJs) nos tecidos epiteliais derivados da ectodermia dos embriões de Drosophila. A pSJ forma uma barreira oclusiva na membrana lateral dos tecidos ectodérmicos, incluindo epiderme, glândulas salivares, traqueia e intestino posterior, que é funcionalmente semelhante à junção apertada nos tecidos vertebrados. Em Drosophila, foram identificadas 30 proteínas necessárias para a formação de pSJs. As proteínas pSJ centrais são inicialmente localizadas ao longo do comprimento da membrana lateral, mas se enriquecem fortemente na região apical lateral da junção, apenas basal à junção aderente, no estágio 16 da embriogênese. No final do estágio 15 da embriogênese, esses tecidos possuem uma junção oclusora totalmente funcional. Este artigo descreverá protocolos de imunocoloração e permeabilidade a corantes que podem ser usados para investigar a organização e função dos pSJs em embriões controle e mutantes. O uso bem-sucedido desses protocolos pode ser usado para demonstrar a função de oclusão das pSJs e para testar se um gene desconhecido codifica um componente central da junção.

Introdução

Uma função crítica dos tecidos epiteliais é compartimentalizar regiões distintas dentro de um organismo. A criação desses ambientes distintos é essencial para o funcionamento dos órgãos e para proteger o organismo de ameaças externas. A junção oclusora formada entre as células de um epitélio é responsável por estabelecer e manter esses ambientes, prevenindo o fluxo paracelular de solutos entre os lados apical e basal desse^{epitélio 1,2}. Em organismos vertebrados, a junção oclusora é chamada de junção apertada, enquanto em invertebrados como Drosophila melanogaster ^1,3 é chamada de junção septata. Existem dois tipos de SJ em artrópodes, distinguidos por sua distribuição tecidular e^{ultraestrutura 4}. As junções do septo plissado (pSJs) são encontradas em tecidos derivados da ectoderme, como epiderme, glândulas salivares, traqueia e intestino posterior. Eles são caracterizados ultraestruturalmente por uma matriz em forma de escada de material denso em elétrons no espaço extracelular entre as células, que fica logo basal à junção^{aderente 3,5}. Em contraste, as junções septato lisas (sSJ) são encontradas em tecidos derivados endodermicamente, como os túbulos do intestino médio e de Malpighi, e não apresentam septos densos em elétrons entre^{as células 6}.

Estudos genéticos em Drosophila identificaram 30 proteínas necessárias para a estrutura e função do pSJ e identificaram proteínas adicionais que residem na junção, mas que não parecem ter função em seu estabelecimento ou manutenção (revisado no^{capítulo 7}). A partir dessas análises, os cientistas categorizaram as proteínas SJ em três classes. As proteínas SJ centrais residem na junção e são necessárias para o estabelecimento e manutenção da junção. Dezessete proteínas foram identificadas como proteínas centrais pSJ, incluindo Coracle (Cora), Neurexin IV, complemento relacionado à macroglobulina (Mcr), Kune-kune e ATPase^{alfa 8,9,10,11,12}. Nove proteínas foram identificadas como proteínas pSJ acessórias necessárias para o estabelecimento e/ou manutenção da junção, mas que não necessariamente residem na junção. Essa classe inclui proteínas como Rab5, Rab11 e^{Coiled 13,14}. Por fim, proteínas residentes em pSJ localizam-se na pSJ, mas são dispensáveis para o estabelecimento e manutenção da junção. Exemplos dos quatro membros desse grupo incluem Discs Large e Fasciclin^{III 15,16}.

O estabelecimento de uma pSJ funcionalmente intacta é um processo em múltiplas etapas que começa no meio da embriogênese, quando todas as proteínas centrais da pSJ estão totalmente expressas. Alguns genes centrais do pSJ são expressos maternamente, mas todos apresentam forte expressão zigótica nos estágios^12-17. No estágio 12, as proteínas centrais da pSJ se localizam ao longo de toda a extensão da membrana lateral. Durante os estágios 13-16, as proteínas centrais da pSJ são endocitadas e depois recicladas de volta para a membrana lateral na região da pSJ. Esse processo requer proteínas acessórias de pSJ, incluindo Rab5 e^{Rab1111 14}. No estágio 16, as proteínas centrais da pSJ estão localizadas de forma estreita na região da pSJ ao longo da membrana lateral. De acordo com essas observações, a função total de oclusão da junção ocorre no estágio final 15 da^{embriogênese 12}. Isso é melhor demonstrado usando um ensaio de permeabilidade a corantes. Antes da formação da junção, uma esfera de dextrano de 10 kDa, marcada com um marcador fluorescente, como rodamina, pode passar pelo espaço paracelular entre as células. Se o dextrano marcado for injetado no hemocel, ele se acumulará rapidamente no lúmen dos epitélios tubulares, como a traqueia, glândula salivar e intestino posterior. Após o pSJ ficar fisiologicamente tenso ao final do estágio 15, o dextrano injetado fica restrito ao lado basal do epitélio e não pode se acumular no lúmen (domínio apical) desses órgãos.

As proteínas pSJ centrais compartilham uma característica característica em que cada proteína pSJ central requer a presença de todas as outras proteínas pSJ centrais para a localização subcelular^{correta 18,19}. Essa interdependência na formação de pSJ é uma característica definidora das proteínas centrais de pSJ e está na base dos protocolos apresentados neste artigo. Mutações nos genes pSJ centrais ou acessórios levam à letalidade embrionária e são caracterizadas pela deslocalização de outras proteínas pSJ centrais ao longo da membrana lateral em embriões do estágio 16, em vez de estarem fortemente localizadas em sua região apical lateral normal. Em contraste, mutações em genes residentes em pSJ não levam à deslocalização das proteínas centrais de^{pSJ 15}. A perturbação funcional da pSJ em mutações do gene pSJ central e acessório é revelada pelo acúmulo de dextrano marcado de 10 kDa no lúmen da traqueia, glândulas salivares ou intestinos posteriores em embriões mutantes de estágio 16 ou 17. Por fim, a característica distintiva entre uma proteína pSJ central e uma proteína acessória é sua localização subcelular. As proteínas pSJ centrais estão fortemente associadas à pSJ uma vez formadas, enquanto proteínas pSJ acessórias são críticas para a montagem da junção, mas não necessariamente residem na junção. Os melhores exemplos de proteínas pSJ acessórias são Rab5 e Rab11. Ambas são proteínas citoplasmáticas que auxiliam no transporte de carga da membrana plasmática para a fase inicial e na reciclagem de endossomos e depois de volta à membrana^{plasmática 14}. Para distinguir se uma nova proteína potencial de pSJ é um componente central ou uma proteína acessória, geralmente é útil criar um anticorpo específico ou expressar uma proteína recombinante marcada fluorescente para determinar onde essas proteínas se localizam em vários pontos do processo de maturação de pSJ.

O objetivo desses protocolos é distinguir de forma inequívoca as potenciais proteínas centrais e acessórias pSJ das proteínas residentes em pSJ. Diversos estudos revelaram papéis adicionais e não ocluentes para as proteínas pSJ durante o desenvolvimento, incluindo papéis na morfogênese e na polaridade^apical-basal 17,20,21,22. À medida que o interesse pela biologia da pSJ aumenta e mais proteínas potenciais da pSJ são identificadas, os protocolos simples e facilmente interpretáveis apresentados aqui ajudarão os pesquisadores a caracterizar corretamente a organização da pSJ e as funções de oclusão dessas proteínas. Na literatura, muitas abordagens experimentais adicionais para caracterizar proteínas pSJ foram descritas, incluindo a Recuperação de Fluorescência Após Fotobranqueamento (FRAP) e a microscopia eletrônica^{de transmissão 6,23}. Embora essas abordagens sejam frequentemente muito úteis, o ensaio de imunocoloração apresentado aqui fornece visualização rápida da localização da proteína pSJ sem métodos ultraestruturais caros e demorados, enquanto o ensaio de permeabilidade do corante oferece uma leitura funcional da integridade da pSJ que não é alcançável apenas por imagem. Além disso, esses ensaios podem ser realizados usando equipamentos laboratoriais padrão, como um microscópio de fluorescência de boa qualidade e um sistema rudimentar de microinjeção. Deve-se notar que esses ensaios são otimizados para análise de embriões de Drosophila estágio 16 e não são adequados para avaliar a organização ou função dos SJs.

Protocolo

1. Estadiamento de embriões

1. Cruze moscas machos e fêmeas saudáveis dos genótipos apropriados (veja a Tabela de Materiais para exemplos) e coloque-as em gaiolas de coleta de embriões com placas frescas de suco de maçã cobertas com pasta de levedura. Deixe as moscas se aclimatarem às gaiolas de coleta de ovos por um ou dois dias antes de iniciar a coleta dos embriões.
2. Colete embriões em placas de suco de maçã e permita que se desenvolvam até o estágio 16 (~13 h após a postura de ovos (AEL) até 16 h de AEL a 25 °C). Deixe os adultos depositar ovos fertilizados por 1-2 horas em pratos de suco de maçã, retire o prato da gaiola de coleta de ovos e depois envelheça até 13-16 AEL a 25 °C. Alternativamente, coletar embriões durante a noite a 25 °C e então selecionar embriões do estágio 16 antes da fixação ou durante a imagem, após fixação e imunocoloração.
   NOTA: O estadiamento embrionário pode ser avaliado pela morfologia intestinal, que é mais facilmente visualizada pela autofluorescência no espectro UV (ou seja, canal DAPI). Nos embriões do estágio 16, o intestino aparece como três ovais longos paralelos perpendiculares ao eixo longo do corpo (Figura 1H).

2. Fixação e imunocoloração de embriões

1. Monte uma cesta de coleta de embriões com uma malha de nylon (malha de 120 mm). Cubra a abertura e as roscas do cesto com a malha de náilon, depois parafuse a tampa.
2. Desaloje delicadamente os embriões do prato de suco de maçã com um pincel e solução de lavagem para embriões. Despeje a mistura de embriões na cesta de coleta e enxágue os embriões com água destilada.
   NOTA: Tenha cuidado para direcionar a água para dentro da cesta de coleta de embriões e evite respingar os embriões nas laterais da cesta, o que pode resultar em perda de embriões devido à aderência.
3. Descoriione os embriões mergulhando a cesta de coleta e os embriões em uma bandeja contendo 50% de água sanitária comercial (concentração final de 3,75% hipoclorito de sódio). Misture os embriões na água sanitária e mantenha-os imersos por 3 a 5 minutos em temperatura ambiente. Retire o cesto da água sanitária e enxágue os embriões com água destilada, novamente direcionando o fluxo de água pelo interior do cesto.
4. Prepare um frasco de fixação adicionando volumes iguais de solução fresca de paraformaldeído a 4% e heptano a um frasco de cintilação de 20 mL. Produzir solução de paraformaldeído dissolvendo a quantidade apropriada de paraformaldeído em soro tampão fosfatado quente (~90 °C) em uma exaustão química. Para acelerar o processo de dissolução, adicione 10 μL de Hidróxido de Sódio 14 N (por 10 mL de PBS) ao fixador até que o formaldeído entre em solução, depois adicione 10 μL de ácido clorídrico 14 N para ajustar o pH de volta ao neutro.
   ATENÇÃO: Sempre use jaleco, óculos de proteção e luvas ao manusear paraformaldeído e heptano, e use apenas sob uma capela química. O paraformaldeído é um carcinógeno e corrosivo, enquanto o heptano é altamente inflamável e irritante para a pele e os olhos.
5. Desmonte a cesta de coleta de embriões e imerga a malha de nylon com embriões descoriionados no heptano. Os embriões se desprendem do nylon e se acomodam na interface entre o heptano (camada superior) e o fixo (camada inferior). Fixe os embriões sacudindo o frasco de fixação em um agitador plataforma a 240 rotações por minuto (RPM) por 20 minutos.
6. Remova o fixador do frasco de fixação com uma pipeta Pasteur em uma capela de fumaça química. Descarte o aditivo em um recipiente aprovado para resíduos químicos perigosos. Adicione um volume igual de metanol, feche a câmara de fixação e agite vigorosamente a câmara por 5 a 10 segundos. Os embriões fixos se soltam do envelope vitelino e afundam para o fundo do metanol (camada inferior). Os envelopes de vitelina e quaisquer embriões que não tenham conseguido se soltar do envelope vitelino permanecerão na interface e serão removidos no passo 2.7.
   ATENÇÃO: Sempre use jaleco, óculos de proteção e luvas ao manusear metanol, pois é tóxico e inflamável.
7. Remova o heptano com uma pipeta Pasteur e descarte-o em um recipiente aprovado para resíduos químicos perigosos. Depois, remova a maior parte do metanol, deixando os embriões em um pequeno reservatório de metanol, e descarte o metanol em resíduos químicos perigosos. Adicione 5 mL de metanol, faça os embriões girar e deixe-os se acomodarem. Remova a maior parte do metanol novamente e repita esse processo mais 2 vezes.
8. Transfira os embriões em metanol para um tubo de cultura de vidro de 0,8 mL. Remova o metanol e adicione 750 mL de solução blocada (PBS mais 1% soro de burro normal e 0,1% Triton X-100). Lave os embriões 3 vezes em PBS, depois incube-os em solução em bloco por 30 minutos em temperatura ambiente, misturando suavemente em um balanço plataforma.
9. Enxágue os embriões mais uma vez em PBS e depois adicione bloco mais anticorpos primários. Use anticorpos contra uma proteína central pSJ (por exemplo, Coracle) e uma proteína de junção aderens (por exemplo, E cadherina). Incube os embriões em anticorpos primários durante a noite a 4 °C ou por 3-4 horas em temperatura ambiente, com mistura suave em um balanço plataforma.
10. Remova o bloqueio com anticorpos primários e enxágue os embriões três vezes em PBS. Adicione o Block e lave os embriões por 30 minutos em temperatura ambiente em um balanço plataforma.
11. Enxágue os embriões mais uma vez no PBS, depois adicione a solução bloqueante e os anticorpos secundários marcados fluorescentemente específicos para os anticorpos primários usados no passo 2.9. Incubar embriões em temperatura ambiente por 3-4 horas ou durante a noite a 4 °C.
12. Remova o bloqueio com anticorpos secundários e enxágue os embriões três vezes em PBS. Adicione o Block e lave os embriões por 30 minutos em temperatura ambiente em um balanço plataforma.
13. Enxágue os embriões novamente em PBS e depois transfira-os para uma lâmina de microscópio usando uma pipeta Pasteur. Remova o excesso de PBS usando pequenas tiras de papel Whatman, tomando cuidado para não tocar nos embriões. Cubra os embriões com substrato de montagem (comercialmente disponível ou feito de 90% glicerol, 10% 1 M Tris, pH 8,0, com 0,5% de n-propila galato como agente antidesfaçante). Cubra com um copo de cobertura número 1,5 do tamanho adequado e fele as bordas com esmalte.

3. Imagem e análise de dados de embriões imunocoloridos

1. Para melhores resultados, observe embriões em um microscópio confocal com uma meta de imersão em óleo de 40x. Use embriões de controle para ajustar a intensidade e ganho do laser no confocal para alcançar um sinal fluorescente forte sem saturar pixels demais. Identifique embriões de escolha do estágio 16 (ou seja, aqueles que não expressam GFP codificada por balanceador para identificar embriões mutantes) usando a morfologia do intestino médio. Foque a varredura na glândula salivar ou no intestino posterior, pois esses órgãos são polarizados e possuem membranas laterais longas, ideais para distinguir a junção aderente, a pSJ e a superfície lateral restante. Imagem em posição em z que incluirá o maior diâmetro possível do lúmen da glândula salivar ou do intestino posterior para observar a membrana lateral completa da célula epitelial.
   NOTA: O exemplo mostrado na Figura 1C foi feito em um microscópio confocal com uma lente de imersão em óleo HC PL APO 40x/1.3 CS2, com intensidade de laser de 1,59 e ganho de 3,3 para o laser de 561 nm, intensidade de laser de 2,0 e ganho de 21,7 para o laser de 638 nm (veja Tabela de Materiais).
2. Imagine um tecido polarizado em pelo menos 20 embriões controle e mutante estágio 16. Registrem apenas dados de embriões em que o marcador de junção do aderente esteja localizado de forma rígida na região apical lateral da membrana para garantir que o embrião tenha sido fixado e tingido adequadamente. Em seguida, registre a distribuição do marcador pSJ ao longo da membrana lateral. Em embriões wildtype estágio 16, procure um forte enriquecimento das proteínas pSJ ao longo dos ~10-15% da membrana lateral, apenas basal à junção do aderente.
   NOTA: A localização incorreta de até mesmo 10-20% da proteína pSJ ao longo do comprimento da membrana lateral é diagnóstica para um defeito de organização da pSJ. Defeitos de organização da pSJ são fortemente penetrantes em todos os embriões mutantes de pSJ no núcleo e acessórios, então você deve esperar ver de 75 a 100% dos embriões mutantes exibindo proteína pSJ claramente mal localizada.

4. Preparação para a injeção do corante

1. Faça uma solução de corante fresca dissolvendo 10 kDa de Dextrano marcado com rodamina em 1 mg/mL em 0,5 M de fosfato de sódio, pH 7,5 e 5 mM de cloreto de potássio.
2. Puxe um tubo capilar (1,0 mm de diâmetro de campo x 0,5 mm de diâmetro interno com fibra) para dentro de uma agulha de vidro usando um puxador de agulha.
   NOTA: Puxadores de agulhas são idiossincráticos e as configurações para agulhas ideais frequentemente variam de um dia para o outro. Agulhas boas têm um afunilamento gradual até uma ponta afiada e devem cair entre os formatos mostrados na Figura 2A. A agulha à esquerda é mais longa e pode dobrar ao ser empurrada para dentro do embrião. Isso pode ser corrigido quebrando novamente a agulha mais longe da ponta. A agulha da direita é boa, mas terá um diâmetro maior quando quebrada inicialmente e pode empurrar líquido demais para dentro do embrião. Se isso acontecer, troque por uma agulha nova com uma ponta mais fina. É melhor puxar várias agulhas ao mesmo tempo quando as condições do puxador criam agulhas com o formato correto. Agulhas em excesso podem ser armazenadas em um recipiente fechado com um pedaço de espuma ou fita adesiva para fixar as agulhas de forma independente.
3. Coloque a agulha no suporte de um micromanipulador. Posicione o micromanipulador ao lado de um microscópio invertido (Figura 2F). Oriente a agulha o mais próximo possível da lâmina do microscópio e abaixe-a de modo que fique no mesmo plano z do lado da lâmina.
4. Quebre a ponta da agulha atingindo a lateral da lâmina do microscópio. Levante a agulha acima do nível do ferrolho e remova-a para carregar.
5. Encha o tubo capilar com corante usando a menor ponta de pipeta disponível (ponta P2 ou P10) ou por ação capilar colocando a extremidade traseira da agulha em um tubo microcentrífuga de 1,5 mL junto com o corante.
6. Recarregue a agulha preenchida no suporte e teste o fluxo do dextrano injetando um bit em uma gota de óleo de halocarbonetos na superfície de uma lâmina de microscópio.
   NOTA: Uma agulha bem quebrada não vazará sem adicionar pressão, e a taxa de fluxo pode ser ajustada conforme a pressão aplicada ao êmbolo da seringa.

5. Montagem dos embriões e injeção de corante

1. Selecione embriões de estágio 16 ou 17 (controle e mutante) usando a morfologia do intestino médio como marcador de estadiamento.
2. Crie uma linha recortada em um prato de suco de maçã usando um revestimento de espessura 22 x 22 #2. Alinhe aproximadamente 25 embriões em estágio no prato de suco de maçã, com suas extremidades posteriores tocando a linha e a superfície ventral voltada para cima.
3. Aplique um pedaço de fita dupla face em um engobe de cobertura #2 de 22 x 22. Toque a fita na linha do embrião e esfregue levemente a capa para mover os embriões da placa para a fita dupla face na capa (Figura 2B).
4. Prenda a cobertura a uma lâmina de microscópio adicionando uma gota de óleo de halocarbonetos à lâmina e usando ação capilar para criar uma ligação. Oriente a cobertura mais próxima do lado do ferrolho oposto a qualquer parte coberta de fosco. Ressece os embriões por 3-5 minutos em um recipiente com dessecante ou no ar em uma bancada de laboratório por 10-15 minutos (Figura 2C-E). Cubra completamente os embriões com óleo de halocarbono.
   NOTA: Os embriões ficarão um pouco menos turgícidos após a dessecação, mas não estarão fortemente flácidos. Os embriões mostrados na Figura 2E foram deixados para secar ao ar por 15 minutos em uma sala com 42% de umidade relativa a 21,2 °C.
5. Monte a lâmina com os embriões no microscópio invertido com os embriões voltados para cima (de longe do objetivo). Alinhe o micromanipulador de modo que a agulha fique voltada para a extremidade posterior dos embriões em um ângulo o mais próximo possível da paralelidade aos embriões (Figura 2G). Ajuste o eixo z do micromanipulador de modo que a ponta da agulha fique alinhada ao ponto médio do embrião (ao longo do eixo dorsal-ventral).
6. Injete os embriões movendo rapidamente o estágio para dentro da agulha, de modo que a ponta da agulha entre no hemocel do embrião. Injete uma pequena quantidade de corante (~0,2-0,5 nL) usando uma seringa de 10, 25 ou 50 mL. Retire rapidamente a agulha, mova a fase para o próximo embrião e repita o processo. Injete o máximo de embriões possível em 10 minutos.
   NOTA: É importante que a agulha seja inserida cerca de 25% do caminho para dentro do embrião para que o contraste não seja injetado diretamente no espaço perivitelino, que é contínuo com o lúmen do intestino anterior e posterior. O contraste injetado deve parecer "inflar" o embrião, tornando-o mais turgido. A injeção excessiva resultará em uma bolha de contraste e hemolinfa saindo do local da injeção e deve ser evitada.
7. Adicione óleo de halocarbonetos adicional e cubra os embriões com uma capa de 22 x 22 #2 #2. O óleo adicional de halocarbonetos forma uma camada mais uniforme entre as duas coberturas, impedindo que os embriões sejam esmagados.

6. Imagem e análise de dados

1. Realize imagens em um microscópio composto fluorescente ou confocal (10x ou 20x objetivos de ar são suficientes para obter resultados inequívocos). No confocal e em conjunto z, a imagem por cerca de um quarto da profundidade (ao longo do eixo ventral dorsal) do embrião revelará se o dextrano marcado entrou no lúmen da traqueia e do intestino posterior (é necessário reorientar os embriões com superfície ventral no topo para ver as glândulas salivares).
   NOTA: Os exemplos mostrados na Figura 3 foram tirados em um microscópio confocal com uma lente seca HC PL APO 10x/0.4 CS2 com intensidade laser de 2.0 e ganho de 13.6 para o laser de 561 nm. Fatias de 24 z foram obtidas com um tamanho de passo z de 2,4 nm (veja a Tabela de Materiais).
2. Deixe o embrião injetado envelhecer por 10 minutos e então examine o lúmen da traqueia, glândula salivar ou intestino posterior para acúmulo do dextrano marcado. Registre o genótipo e o estágio de cada embrião e se há acúmulo de dextrano marcado em algum órgão tubular. Note quaisquer embriões em que o espaço perivitelino também seja fortemente tingido com corante, pois estes podem representar embriões que foram inadvertidamente injetados nesse espaço.

Resultados

Os protocolos apresentados aqui são usados para investigar a organização e função das pSJs em tecidos ectodérmicos em embriões de Drosophila estágio 16. Esses protocolos são aplicáveis apenas a pSJs e não podem ser usados para interrogar sSJs. Uma mutação em um gene que resulta na falha em localizar outras proteínas pSJ na região pSJ em embriões do estágio 16 e na criação de uma junção oclusora no estágio 16 está em um gene central pSJ ou em um gene pSJ acessório. A principal diferença e...

Discussão

Aqui apresentamos um protocolo para identificar proteínas pSJ centrais e acessórias usando dois ensaios relativamente simples que podem ser realizados em laboratórios modestamente designados com capacidades de microscopia de fluorescência. O primeiro ensaio examina a organização molecular da pSJ em epitélios polarizados maduros usando imagens confocais de embriões mutantes fixos. O segundo ensaio testa a integridade da função de oclusão do pSJ injetando moléculas de dextrano marcadas com...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo capilar para agulhas (Boro 1 X 0,5/Fibra)	FHC	30-30-1
Microscópio confocal	Leica	Stellaris 5
Cobrir vidro com espessura 22 x 22 para injeções	Fisher Scientific	12-540-B
Cobertura de vidro 22 x 30 com espessura de 1,5 para imagem	Corning	2980-233
Tubo de cultura para imunocoloração (6 x 50 mm) & nbsp;	Fisher Scientific	14-958-A
Gaula de coleta de embriões	Genesee Scientific	59-100
Estereoscópio de fluorescência	Leica	MZ10 F
Óleo de halocarbonetos (700)	Genesee Scientific	59-131
Heptano	Fisher Scientific	H350-4
Microscópio de fluorescência invertida	Leica	DMi8
Cestos de malha para embriões decoriionizantes	Genesee Scientific	46-101
Metanol	Fisher Scientific	A412-4
Micromanipulador	Narishige	MN151
Lâminas de microscópio	Fisher Scientific	12-544-2
Puxador de agulha	Instrumentos David Kopf	Modelo 720
Soro de Burro Normal	Jackson ImmunoRecherch	017-000-121
Malha de nylon (120 um)	Genesee Scientific	57-102
Lente objetiva HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1	Leica	11506537
Lente objetiva HC PL APO 10x/0.40 CS2	Leica	15506407
Lente objetiva HC PL APO 40x/1.30 CS2	Leica	15506358
Placas de Petri 60 x 15 mm	Corning	351007
Balanço plataforma	Globe Scientific	GTR-FS
Anticorpo primário (Coracle)	DSHB	C566.9
Anticorpo primário (Coracle)	DSHB	C615.16
Anticorpo primário (E. cadherina)	DSHB	DCAD2
Anticorpo primário (Mcr)	Laboratório de enfermaria, CWRU	Policlonal de porquinho-da-índia
Rodamina rotulada como dextrano de 10 kDa	Sondas Moleculares	D1824
Anticorpo secundário (anti-porquinho-da-índia Cy3)	Jackson ImmunoRecherch	706-165-148
Anticorpo secundário (Cy2 anti-rato donkey)	Jackson ImmunoRecherch	715-225-151
Anticorpo secundário (anti-rato de burro Cy5)	Jackson ImmunoRecherch	712-175-150
Agitador de mesa	New Brunswick Scientific	Agitador de plataforma C2
Tegosept (metil 4-hidroxibenzoato)	TCI	H0216
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151500
Frascos para fixação (20 ml frascos de cintilação líquida WHEATON)	Fisher Scientific	03-341-73C
Whatman 3MM  Artigo sobre Cromatografia	Fisher Scientific	05-716-6H
Ações de mosca	Genótipo completo	estoque	Fonte
cor4	w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO	52232	BDSC
W1118	w[1118]	5905	BDSC
Solução	Receita
10x PBS	Misture 90 g de NaCl, 20 g de Na2HPO4 e 8,3 g de NaH2PO4.H2O e dH20 a 1L. Esterilize com o filtro. Dilua para 1X com dH2O para as etapas de lavagem na imunocoloração.
Solução 10% Triton X-100	Misture 1 ml de Triton X-100 a 9 ml de dH2O em um balancim plataforma até dissolver. Armazene em temperatura ambiente.
50% de água sanitária	Misture 10 ml de água sanitária comercial (hipoclorito de sódio 7,5%) com 10 ml de água antes de descoriar os embriões.
Pratos de suco de maçã	Ferva 15 g de ágar Drosophila em 725 ml de dH2O. Adicione 25 g de açúcar e 250 ml de suco de maçã e misture até que esteja tudo ilibado. Deixe a solução esfriar até 55°C e depois adicione 1,3 g de tegosept e misture suavemente. Despeje em placas de Petri de 60 x 15 e deixe esfriar. Armazene em 4°C.
Solução de bloqueio	Misture 9,8 ml de 1X PBS com 100 ul de 10% de Triton X-100 e 100 ul de Soro de Burro Normal em um tubo cônico de 15.
Solução de lavagem embrionária	Prepare 10 vezes a solução de lavagem embrionária misturando 70 g de NaCl e 2 ml de Triton X-100 a 1L de dH2O. Dilua para 1X com dH2O para a solução funcional.
Corrigir	Pré-aqueça 10 ml de 1X PBS no micro-ondas. Adicione 0,4 g  de paraformaldeído e pipeta para misturar. Adicione 10 ul de NaOH 14N para dissolver a velocidade. Coloque em um bloco de calor de 90°C até dissolver. Quando não restar paraformaldeído sólido, adicione 10 ul de 14N HCL para ajustar o pH para neutro. Sempre use jaleco, luvas e óculos ao usar paraformaldeído.
Mídia de montagem	Misture 9 ml de glicerol e 1 ml de base 1M Tris pH 8,0. Adicione 0,05 g de n-propil-galato,   Misture e aqueça para dissolver. Aliquot 0,5 ml em tubos eppendorf.
Solução de dextrano de rodamina	Faça uma solução de corante fresca dissolvendo Dextrano 10 kDa marcado com Rodamina em 1 mg/ml em fosfato de sódio 0,5M, pH 7,5 e 5 mM de cloreto de potássio.
Pasta de fermento	Misture 50 g de levedura comercial (Red Star) com uma pitada de sacarose e água suficiente para fazer uma pasta espessa. Armazene em 4°C.