Gastrectomia em Sleeve em Camundongos Usando Clipes de Ligadura Descartáveis

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que utiliza um clipe de ligadura descartável para criar um modelo de gastrectomia com manga de camundongo. Esse modelo demonstra baixa mortalidade pós-operatória, menor tempo operatório e resultados terapêuticos comparáveis às técnicas tradicionais de sutura.

Resumo

Modelos atuais de camundongos de gastrectomia em manga (SG) dependem fortemente da sutura manual — um procedimento tecnicamente exigente, com tempos operacionais prolongados, alta mortalidade perioperatória e curva de aprendizado acentuada. Isso limita seu acesso a pesquisadores não cirúrgicos. Para resolver esse gargalo, desenvolvemos um protocolo SG simplificado usando clipes de ligadura descartáveis, comumente empregados em cirurgia gastrointestinal clínica. Em camundongos obesos C57BL/6J induzidos pela dieta, a abordagem baseada em clipe reduziu o tempo médio operatório em >50% (20,9 ± 3,2 vs. 43,9 ± 3,0 min) e melhorou significativamente a sobrevivência em 12 semanas em comparação com a sutura tradicional. O método alcançou resultados metabólicos equivalentes, incluindo perda de peso sustentada, melhora da tolerância à glicose, aumento da sensibilidade à insulina e redução da esteatose hepática. Notavelmente, o modelo não requer expertise microcirúrgica especializada ou dispositivos de grampeamento, que muitas vezes não estão disponíveis para aplicações murinas. Recomendamos esse método baseado em clipes para pesquisadores, especialmente aqueles sem treinamento cirúrgico avançado, que priorizam a eficiência e a reprodutibilidade do procedimento em estudos mecanicistas de cirurgia bariátrica. Para cirurgiões que buscam tradução clínica direta, técnicas baseadas em sutura continuam sendo preferíveis, embora com um manejo perioperatório mais rigoroso.

Introdução

A cirurgia bariátrica é amplamente reconhecida como a intervenção mais eficaz para obesidade extrema e suas complicações^{associadas 1}. O modelo de gastrectomia em manga de camundongos (SG) é uma ferramenta valiosa para estudar as mudanças fisiopatológicas e os potenciais mecanismos associados à cirurgia bariátrica. Esse modelo é vantajoso porque permite o uso de cepas de camundongos geneticamente modificadas, como aquelas com knockouts genéticos ou superexpressão. Modelos de camundongos fáceis de replicar, que permitem controle rigoroso das condições experimentais e facilitam a manipulação experimental são essenciais para a tradução^{clínica 2}.

O modelo SG murino convencional utiliza técnicas baseadas em sutura para fabricar uma bolsa gástrica tubular. Essa metodologia envolve múltiplas etapas cirúrgicas precisas e normalmente requer grande proficiência técnica. Técnicas representativas incluem SG-camada^{única 3,4} e SG-Lembert ^5,6, com tempo cirúrgico médio de aproximadamente 30 a 45^{min 7}. Consequentemente, realizar a SG em uma coorte de dez camundongos geralmente requer de 5 a 7,5 horas de tempo cirúrgico. Em estudos envolvendo múltiplas coortes experimentais, as sessões cirúrgicas cumulativas podem se estender por 2 a 3 dias consecutivos. Prazos processuais prolongados podem introduzir restrições logísticas e variabilidade nas condições perioperatórias, o que afeta a consistência experimental e o monitoramento pós-operatório. Pesquisadores exploraram abordagens alternativas para desenvolver modelos mouse-SG mais acessíveis. As abordagens com assistência de grampeador (SG-grampeador^)7,8 e baseada em clipe (SG-clip)^9,10,11 representam melhorias notáveis. Esses métodos simplificam aspectos específicos da formação da bolsa gástrica e reduzem as demandas técnicas associadas à sutura manual, apoiando assim uma adoção mais ampla em ambientes de pesquisa com diferentes níveis de experiência cirúrgica. A técnica SG-stapler enfrenta limitações práticas em aplicações murinas devido à disponibilidade limitada de dispositivos de grampeamento de tamanho adequado, o que leva ao seu uso mais frequente em modelos de ratos. Quanto à abordagem SG-clip, estudos anteriores geralmente utilizavam um a dois clipes de titânio complementados com pontos^{auxiliares 9,10,11}. A superfície interna lisa dos clipes de titânio padrão proporciona uma aposição tecidal subótima, exigindo fixação suplementar para garantir a confiabilidade do procedimento e integridade gástrica.

Baseando-se nas características dos modelos SG-stapler e SG-clip, este protocolo apresenta um modelo SG murino desenvolvido usando clipes de ligação descartáveis. Esses clipes são comumente usados em colecistectomia, apendicectomia e outras cirurgias gastrointestinais. Nesses procedimentos, eles prendem de forma segura tecidos como o ducto cístico residual, a raiz apendental e os vasos sanguíneos, eliminando a necessidade de reforço adicional dos pontos. Existem tamanhos adequados para o comprimento da barriga de um rato. Esse novo modelo SG-clip é simples, confiável e demonstra eficácia terapêutica comparável à do modelo tradicional de sutura.

Notavelmente, a SG baseada em sutura continua sendo preferível quando a pesquisa visa replicar técnicas cirúrgicas clínicas, investigar efeitos biomecânicos ou biológicos específicos da sutura, ou exigir máxima precisão anatômica. Para pesquisadores com habilidades avançadas em microcirurgia, métodos de costura manual espelham procedimentos humanos e, portanto, são mais adequados para fidelidade translacional. Em contraste, o modelo de clipe de ligação oferece uma alternativa eficiente, eficiente e acessível que mantém o rigor experimental enquanto amplia a aplicabilidade da SG murina em diversos ambientes de pesquisa — especialmente quando a expertise cirúrgica é limitada.

Protocolo

Este protocolo segue as Diretrizes Internacionais de Ética em Bem-Estar Animal e foi aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Experimental e Ética Animal da Universidade Jinan (Número de Aprovação: 20240227-0073).

NOTA: Trinta camundongos machos C57BL/6J do tipo selvagem (oito semanas de idade), pesando 22-25 g, foram alojados em um ambiente específico livre de patógenos (FPS), com temperatura ambiente de 20-26 °C e 12/12 horas alternando dia e noite. Após se aclimatarem a uma dieta rica em gordura por 4 semanas, os camundongos foram aleatoriamente designados para os grupos SC (SG com clip), SS (SG com sutura) e SH (sham), com 10 camundongos em cada grupo.

1. Preparação pré-operatória

1. Mude para uma dieta líquida por 2 dias e não jejue antes da cirurgia.
   NOTA: A transição pré-operatória para uma dieta líquida pode facilitar o esvaziamento de alimentos sólidos do estômago dos camundongos, reduzindo assim a contaminação intraoperatória. Além disso, promove uma melhor adaptação à nutrição líquida pós-operatória, garantindo uma ingestão adequada de energia.
2. Fixe a almofada térmica na mesa de cirurgia equipada com uma máscara anestésica e ajuste a temperatura para ~37 °C.
3. Limpe a mesa com álcool 75%.
4. Extraia 1 mL de 100 mL de soro fisiológico normal para dissolver o pó de penicilina. Em seguida, injete toda a solução dissolvida de penicilina nos 99 mL restantes de soro fisiológico normal para preparar uma solução de penicilina com concentração de 800.000 UI/100 mL.
5. Anestesie os camundongos com 3% de isoflurano e 0,5 l/min de oxigênio por aproximadamente 30 s e então coloque a cabeça em uma máscara anestésica, mantendo a concentração de isoflurano em 1,5%.
6. Esterilize a pele do peito e do abdômen com solução de Anerdian e cubra com uma toalha estéril.

2. Procedimentos cirúrgicos

1. Laparotomia mediana: Levante a pele cerca de 2 cm abaixo do processo xifoide e faça uma incisão de 1,5 cm ao longo da linha média. Corte a área livre de músculos ao longo da linha alba apenas o suficiente para caber o retrator (aproximadamente 1,5 cm).
2. Externalização do estômago: Usando um cotonete úmido, empurre o cólon e parte do intestino delgado em direção à cavidade pélvica. Levante delicadamente a barriga até a incisão abdominal com pinças de ponta romba e cubra com uma toalha nova cortada de gaze úmida. Disseque cuidadosamente o ligamento hepatogástrico, o ligamento gastrosplénico e a conexão vascular parcial do seio gástrico com o pâncreas e corte com um eletrocoagulador.
   NOTA: A colocação oportuna de cortinas novas ou algodão umedecidos durante a externalização gástrica e a incisão podem reduzir efetivamente a contaminação pelo conteúdo gástrico.
3. Determinar a extensão da resseção ao longo da maior curvatura do estômago, com o fundo do fundo 3 mm distal ao esôfago e o antro 3 mm proximal ao píloro.
4. Para o grupo SC:
   1. Coloque o clipe descartável da ligadura com um aplicador ao longo da extensão predeterminada da ressecção; Redetermine cuidadosamente a distância da posição do clamp entre o esôfago e o pilo, depois clampe.
      NOTA: Antes do clipping, a linha de resseção deve ser confirmada colaborativamente tanto pelo assistente quanto pelo operador para garantir margens de resseção precisas.
   2. Pré-posicione um algodão umedecido ao redor do estômago para evitar a contaminação da cavidade abdominal com derramamento de conteúdo gástrico; em seguida, corta rapidamente aproximadamente 80% do tecido gástrico no lado de maior curvatura do clipe de ligadura.
   3. Esterilize a incisão três vezes com swabs Anerdian e limpe uma vez com um swab salino (Figura 1).
5. Para o grupo SS:
   1. Clampe o corpo gástrico ao longo da extensão predeterminada da ressecção.
   2. Pré-posicione um algodão umedecido ao redor do estômago para evitar a contaminação da cavidade abdominal com derramamento de conteúdo gástrico; Depois, use tesoura oftálmica para cortar rapidamente aproximadamente 80% do tecido gástrico no lado com maior curvatura.
   3. Abra a pinça e limpe o conteúdo gástrico com swabs salinos.
   4. Suture a incisão duas vezes usando pontos cirúrgicos absorvíveis 6-0 com uma técnica contínua de camada única. Realize a primeira sutura contínua inserindo a agulha perpendicular à borda da incisão, a uma distância de 2-3 mm, passando por toda a espessura da parede gástrica e saindo em um ponto equidistante do lado contralateral. Fixe o ponto inicial com um nó cirúrgico, continue o ponto usando mordidas alternadas de 2 mm sob tensão uniforme para evitar franzimentos ou espaços do tecido, e termine com um nó quadrado (3-4 arremessos).
   5. Realize a segunda sutura contínua paralela à primeira usando um padrão deslocado para aumentar a cobertura e manter espaçamento e tensão consistentes da mordida, evitando sobreposição ou torção.
      NOTA: O avermelhamento de algodão ou gaze indica sangramento significativo, especialmente no local da incisão gástrica; é necessária eletrocoagulação adequada da incisão antes da sutura para alcançar a hemostasia.
   6. Esterilize a incisão três vezes com swabs Anerdian e limpe uma vez com um swab salino (Figura 2).
6. Para o grupo SH:
   1. Realize apenas a operação de clampagem do estômago e libere após 10 minutos.
   2. Retorne o estômago à cavidade abdominal na posição correta e suture a musculatura própria e a pele com pontos cirúrgicos 5-0, esterilize e termine o procedimento.
      NOTA: Todos os camundongos foram operados dentro de uma semana para facilitar o monitoramento eficaz do peso e da ingestão de alimentos pós-operatórios.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Coloque os camundongos em uma caixa de indução com oxigênio puro. Eles podem ser despertados após cerca de 2 minutos. Retire os ratos e coloque-os em uma bolsa térmica. Observe de perto o estado de consciência e a respiração, depois devolve-os à gaiola quando puderem se mover.
2. Administre uma única injeção subcutânea de solução salina de glicose (5% de glicose e 4,5% de cloreto de sódio) em dose de 20 mL/kg.
3. Administrar uma injeção subcutânea de meloxicam na dosagem de 4 mg/kg (concentração: 0,4 mg/mL) imediatamente antes dos camundongos recuperarem a consciência após a cirurgia. Repita essa injeção a cada 24 horas por três dias consecutivos.
4. Forneça a solução nutricional da Abbott e uma dieta rica em gordura nos três primeiros dias após a cirurgia; Substitua a solução nutricional por água potável no quarto dia pós-operatório.
5. Administre penicilina (30.000 U/kg) intramuscularmente por 3 dias consecutivos após a cirurgia para evitar infecção.
6. Observe os camundongos diariamente para detectar condições gerais e ofereça tratamento sintomático rápido conforme necessário.

4. Indicadores de detecção

NOTA: A sobrevivência por 4 semanas sem complicações pós-operatórias significativas em camundongos é considerada cirurgia bem-sucedida.

1. Registre o peso e a duração da cirurgia no momento da operação, e monitore o peso, a ingestão de alimentos, a taxa de mortalidade e a ocorrência de complicações graves toda semana para cada grupo durante 12 semanas pós-operatórias.
2. Realize avaliações metabólicas e de trânsito intestinal, como teste de tolerância à glicose intraperitoneal (ipGTT), teste de tolerância à insulina (ITT) e teste de trânsito do intestino delgado na semana 12.
   1. Para ipGTT: Mouse rápido por 12 horas. Corte um segmento de 1 mm da ponta da cauda e meça a glicose no sangue em jejum (tempo 0). Administrar uma solução de glicose a 20% intraperitonealmente em uma dose de 2 g/kg de peso corporal. Meça os níveis de glicose no sangue em 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a administração.
   2. Para a ITT: Mouse rápido por 6 horas. Meça os níveis de glicose no sangue em jejum. Administrar solução de insulina (0,075 U/mL) por injeção intraperitoneal em uma dose de 0,5 U/kg de peso corporal. Meça os níveis de glicose no sangue em 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a injeção.
   3. Para trânsito intestinal delgado: Ratos rápidos por 12 horas. Administre uma suspensão de pó de carbono a 10% via gavage oral em uma dose de 10 mL/kg de peso corporal. Após 30 minutos, eutanasie os ratos. Extire o intestino delgado intacto do píloro até a extremidade proximal do ceco. Meça a razão de trânsito intestinal como a distância do piloro até a borda de ataque da suspensão de carbono dividida pelo comprimento total do intestino delgado.
3. Sacrifique-se os camundongos para observar a estrutura anatômica do estômago em manga e a morfologia do intestino delgado.
4. Tinga as amostras de fígado com coloração de hematoxilina-eosina (HE) e coloração óleo vermelho O, e colete as amostras de sangue para a detecção de colesterol total sérico (TC), triglicerídeos (TG) e ácidos graxos livres (FFA).

5. Análise Estatística

1. Expresse todas as variáveis contínuas (peso corporal, ingestão de alimentos, razão de trânsito do intestino delgado, níveis de glicose no sangue e parâmetros sorológicos) como média ± desvio padrão.
2. Analise dados longitudinais de peso corporal e ingestão de alimentos usando medidas repetidas bidirecionais ANOVA (fatores: grupo e tempo).
3. Analise as razões de trânsito do intestino delgado e os parâmetros sorológicos usando ANOVA unidirecional.
4. Para dados do teste de tolerância à glicose intraperitoneal (ipGTT) e teste de tolerância à insulina (ITT), calcule a área sob a curva (AUC) de cada sujeito e compare os valores do grupo AUC usando ANOVA unidirecional.
5. Realize comparações pós-hoc por pares com correção de Bonferroni após resultados significativos de ANOVA.
6. Defina significância estatística como p < 0,05. Realize todas as análises estatísticas usando o GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA).

Resultados

O critério para o sucesso cirúrgico foi definido como camundongos sobrevivendo por mais de 4 semanas após a cirurgia sem apresentar complicações graves. Mortes ocorridas após a quarta semana pós-operatória são atribuídas a complicações. Durante 12 semanas consecutivas de observação pós-operatória, uma morte foi registrada no grupo SC no 24º dia pós-operatório devido a feridas e infecção abdominal causadas por pontos, enquanto os nove camundongos restantes sobreviveram até a 12ª semana. N...

Discussão

Um modelo murino SG foi estabelecido usando clipes de ligadura descartáveis, resultando em um procedimento cirúrgico simples, eficiente e reproduzível. A técnica baseada em clipe demonstrou consistentemente eficácia terapêutica comparável à do modelo convencional de sutura baseada em sutura, ao mesmo tempo em que reduziu significativamente o tempo operatório e melhorou as taxas de sobrevivência pós-operatória.

A técnica cirúrgica para o modelo de sutura SG do ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução anerdiana	Prosperich	HC-3566	Esterilize a pele do tórax e do abdômen
75% de álcool	Macklin	E885996-500ml	Limpe a mesa cirúrgica
Máquina de anestesia animal	YuyanBio	Yuyan-ABS	Equipamento de anestesia de camundongos
Aplicador	HangzhouKangji	Φ 10 mm e multiplicações; 330 mm	Aplicador descartável de clipe de ligadura
Prendedora descartável para ligadura	HangzhouKangji	KJ-JZJ02XL	Crie uma manga gástrica
Lápis eletrocirúrgico	YuyanBio	Gemini (alimentado por bateria)	Hemostaste eletrocoagulante durante a operação.
Garantir	Laboratórios Abbott	H20181147	Dieta líquida
Glicosímetro e tiras de teste	ACCU-CHEK	Me Guie	Monitoramento da glicose no sangue
Software GraphPad	San Diego, CA, EUA	GraphPad Prism 9	Estatísticas e análise de dados
Bolsa térmica	RTtech	RT-jr01	Mantenha uma temperatura corporal quente para o camundongo durante a cirurgia
Dieta rica em gordura	Research Diets, Inc	D12492	60 kcal% de gordura
Isoflurano	RWD	R510-22	Medicamentos anestésicos
Meloxicam	Aladdin	M129228-25g	Medicamentos analgésicos pós-operatórios
Instrumentos microcirúrgicos	Beyotime	FS500	Realizar cirurgia animal
Retrator de rato	CHIU POK	CP-ckq	Retração cirúrgica abdominal em camundongos
Suturas cirúrgicas	Jinhuan Medical	CR537/KCR631	Suturas cirúrgicas