Artigo de método

Visualização em Tempo Real do Impacto do Meio Nutritivo no Desenvolvimento de Biofilmes de Pseudomonas aeruginosa Usando um Sistema Microfluídico

DOI:

10.3791/69997

⸱

15 de maio de 2026

 ,  , 
1School of Mechanical, Aerospace and Civil Engineering, University of Sheffield, 2School of Chemical, Materials and Biological Engineering, University of Sheffield

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo avalia a influência das composições de meios nutritivos ricos (TSB) e mínimos (FAB) no desenvolvimento de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa PAO1 e PA14 em um ambiente de fluxo em regime estacionário em um microcanal.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A bactéria patogênica Pseudomonas aeruginosa é uma das principais causas de infecções nosocomiais, e sua crescente resistência aos antimicrobianos a tornou uma ameaça significativa à saúde pública. Este artigo apresenta um protocolo abrangente detalhando o uso de um sistema microfluídico para a visualização e quantificação em tempo real do desenvolvimento de biofilmes em duas cepas principais de P. aeruginosa , PAO1 e PA14. O método emprega placas de microcanais multicanal opticamente transparentes para submeter culturas bacterianas a um fluxo contínuo e constante de meio, incluindo caldo de soja tríptico (TSB) ou caldo anaeróbico mínimo e meticuloso modificado (FAB) com diferentes concentrações de fontes de carbono, imitando assim condições encontradas nos ambientes clínicos. Ao longo de um período de 24 horas, a imagem automatizada em tempo real captura o crescimento e maturação dos biofilmes na forma de cobertura da área de superfície, espessura e rugosidade superficial do biofilme, de maneira altamente reproduzível. O objetivo experimental é usar os resultados para demonstrar que a formação de biofilmes para ambas as cepas é significativamente impactada por mudanças na composição do meio nutritivo. O objetivo desse protocolo visualizado é fornecer um método para que pesquisadores estudem a dinâmica dos biofilmes sob condições de fluxo laminar estacionário, e os insights obtidos poderiam ser aproveitados para desenvolver estratégias alternativas não antimicrobianas para erradicar biofilmes de P . aeruginosa em estágio inicial em ambientes nosocomiais.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O objetivo desse método é observar o impacto de dois meios culturais diferentes, ou seja, caldo de soja tríptico (TSB) e caldo anaeróbico mínimo modificado (FAB), no crescimento de biofilme de duas cepas de Pseudomonas aeruginosa , a saber, PAO1 e PA14. Embora P. aeruginosa PAO1 e PA14 sejam cepas de referência laboratoriais comuns, a cepa PA14 infecta uma proporção maior de hospedeiros, desde plantas atéinvertebrados 1. O caldo nutritivo TSB é um meio de cultivo de uso geral com 2,5 g/L de glicose como fonte de carbono e é capaz de cultivar uma ampla variedade de bactérias devido à sua composição de caseína e peptonas de soja para nitrogênio orgânico e um suprimento natural de açúcar, além de cloreto de sódio para manter o equilíbrioosmótico 2. O meio mínimo de FAB, em contraste, é formulado com concentrações mínimas (redução de 50 vezes) de uma única fonte de carbono, em níveis de 0,05 g/L para explorar os requisitos de crescimento das bactérias anaeróbias. Tanto as deformações PAO1 quanto PA14 foram expostas a fluxo laminar unidirecional, resultando em uma tensão de cisalhamento de parede baixa de 0,01 Pa. Esse valor de tensão de cisalhamento está frequentemente presente em locais colonizados por P. aeruginosa, incluindo os brônquios de pacientes com fibrose cística e o trato gastrointestinal. O crescimento do biofilme foi medido ao longo de um período de 24 horas avaliando em tempo real a porcentagem de cobertura da área de superfície do biofilme, espessura e média aritmética da rugosidade da superfície.

Os biofilmes de P. aeruginosa são responsáveis por uma porcentagem significativa de infecções nosocomiais e são uma das principais causas de morte em pessoas com fibrosecística 3,4,5. Investigações anteriores sobre o impacto dos níveis de fontes de carbono no desenvolvimento de biofilmes bacterianos negligenciaram o papel crítico do fluxo hidrodinâmico durante o desenvolvimento do biofilme, utilizaram valores de tensão de cisalhamento que não representam os locais de infecção por P. aeruginosa, ou realizaram apenas análises cinéticas e morfológicaspós-experimento 6,7. Essas limitações são abordadas nesse método utilizando imagens em tempo real do desenvolvimento de biofilmes, sob condições de fluxo em regime estacionário dentro de um canal microfluídico que replica de perto ambientes fisiológicos encontrados em pacientes com fibrose cística.

Esse método oferece vantagens significativas em relação a técnicas alternativas utilizadas para estudar o desenvolvimento de biofilmes. A aplicação de imagens em tempo real durante o período de crescimento do biofilme de 24 horas garante que o biofilme em desenvolvimento não seja perturbado, pois não são necessárias secagens ou alterações químicas, evitando alterações em sua composição e produzindo resultados mais representativos do que métodos que exigem manipulaçãoda amostra 8. Além disso, aplicando condições de fluxo hidrodinâmico constante e variando as concentrações de fontes de carbono em grande magnitude, esse procedimento replica com maior precisão os ambientes fisiológicos encontrados nos locais de infecções nosocomiais por P. aeruginosa. Isso o torna um método mais representativo em comparação com aqueles que utilizam ensaios estáticos, como placas de microtitulação de 96 poços ou cupons, que não capturam o impacto crítico do fluxo de fluidos no desenvolvimento debiofilmes 9,10,11.

O dispositivo microfluídico utilizado foi escolhido especificamente porque suas dimensões são semelhantes às de partes do pulmão, como bronquíolos ebrônquios 12. Além disso, as infecções por P. aeruginosa são uma grande preocupação para pacientes com queimaduras graves, onde os níveis de glicose podem variar significativamente em relação à faixa normaldo paciente de 13,14.

Embora esse protocolo utilize especificamente duas cepas de P. aeruginosa, o método também é aplicável a investigações sobre o desenvolvimento inicial de outras bactérias que causam infecções ou colonizam áreas sob condições semelhantes. Além disso, outras composições de meios nutritivos, bem como condições de fluxo (por exemplo, fluxos pulsáteis e oscilantes, ou valores de cisalhamento de parede mais altos) também podem ser investigados usando a mesma metodologia.

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Protocolo

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1. Limpeza de vidros

  1. Submerga duas garrafas de vidro de 200 mL para serem usadas como mídia e ágar, e três garrafas de vidro de 1 L em um banho de ácido clorídrico (HCl) a 10% por aproximadamente 5 minutos em temperatura ambiente.
    ATENÇÃO: Ácido clorídrico é corrosivo. Realize todo o manuseio de ácido em uma exaustão química enquanto usa equipamentos de proteção individual adequados (jaleco, luvas e proteção ocular).
  2. Em seguida, retire os vidros do banho de HCl e enxágue duas vezes com água da torneira e uma vez com água destilada (dH 2O).

2. Preparação de mídia para caldo de soja tríptico

  1. Prepare a solução TSB, pese 6 g/200 mL de pó TSB usando um barco de pesagem limpo e um balanço de precisão.
    NOTA: A composição do pó de TSB utilizado é a seguinte: Dextrose (2,5 g∙L-1), fosfato de dipotássio (2,5 g∙L-1), digestão pancreática da caseína (17 g∙L-1), digestão papaica da farinha de soja (3,0 g∙L-1) e cloreto de sódio (5,0 g∙L-1).
  2. Meça 200 mL dedH 2Ousando um cilindro medidor e despeje em uma das garrafas de vidro previamente limpas.
  3. Adicione os 6 g de TSB ao frasco de vidro limpo contendo os 200 mL dedH 2O, fele bem o frasco e misture por aproximadamente 2 minutos para dissolver o pó, criando o meio de solução TSB.
  4. Autoclave solução de meio TSB por 15–20 minutos a uma temperatura de 121 °C e pressão de 1,5 atm, para esterilizar a solução.
    NOTA: (ponto de pausa) A solução de TSB pode ser armazenada em temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) entre os usos e usada em experimentos futuros.

3. Preparação meticulosa de meio de caldo anaeróbico

  1. Prepare a solução FAB de meio traço de metal.
    1. Use barcos de pesagem separados e limpos e uma espátula, e uma balança de precisão ao pesar massas entre 0,5 e 210 g, e uma balança analítica ao pesar massas entre 0,001 e 0,5 g. Meça os seguintes componentes e suas quantidades: CaSO4,2H 2O(200 mg∙L-1), FeSO4,7H 2O (200 mg∙L-1), MnSO4. H2O (20 mg∙L-1), CuSO 4,5H2O (20 mg∙L-1), ZnSO4,7H 2O (20 mg∙L-1), CoSO4,7H 2O (10 mg∙L-1), NaMoO4. H2O (10 mg∙L-1), eH 3BO 3 (5 mg∙L-1) 7,9.
    2. Adicione cada um dos componentes em um frasco de vidro limpo de 1 L, contendo 1 L de dH2O, e misture cuidadosamente com odH2O.
    3. Adicione 1 mL da mistura a cada um dos dois frascos de vidro esterilizados restantes de 1 L com 1 L de dH2Oe misture bem.
  2. Prepare 20 mM de FAB suplementado com citrato de sódio para culturas durante a noite
    1. Meça os seguintes componentes e suas quantidades usando barcos de pesagem separados e limpos e uma espátula, uma balança de precisão ao pesar massas entre 0,5-200 g e uma balança analítica ao pesar massas entre 0,001-0,5 g: citrato de sódio (20 mM), (NH4)2SO4 (2 g∙L-1), Na2HPO 4,2H 2O (6 g∙L-1), KH2PO4 (3 g∙L-1), NaCl (3 g∙L-1), MgCl2 (93 mg∙L-1) e CaCl2 (11 mg∙L-1)7,9.
    2. Adicione todos os componentes em um dos frascos de vidro esterilizados restantes de 1 L, contendo 1 L de dH2Ocom 1 mL de solução de metal traço.
    3. Misture bem.
  3. Prepare 0,3 mM de FAB suplementado com glicose para o crescimento do biofilme.
    1. Substitua os 20 mM de citrato de sódio por 0,3 mM de glicose. Use os mesmos componentes e massas listados no passo 3.2.1.
    2. No frasco de vidro de 1 L limpo restante, adicione os componentes de 0,3 mM de glicose FAB a 1 mL dedH2Ocom 1 mL de solução de metal traço e misture bem.
  4. Autoclave por 15-20 minutos a uma temperatura de vapor de 121 °C e pressão de 1,5 atm, para esterilizar o meio.
    NOTA: (ponto de pausa) A solução de meio fabril pode ser armazenada em temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) entre os usos e usada em experimentos futuros.

4. Preparação de ágar TSB

  1. Meça 8 g/200 mL de ágar TS usando a balança de precisão e barcos de pesagem lavados e espátula.
  2. Meça 1 g/200 mL de ágar bacteriológico de grau, em um barco separado, usando a mesma balança de precisão.
  3. Usando um cilindro medidor, meça 200 mL de dH2O e despeje na garrafa final de vidro previamente limpa.
  4. Despeje ambos os componentes do ágar nos 200 mL dedH2Oe misture bem.
  5. Autoclave por 15–20 minutos a uma temperatura de 121 °C e pressão de 1,5 atm, para esterilizar o meio.
    NOTA: (ponto de pausa) O ágar de TSB pode ser armazenado em temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) entre os usos e requer reaquecimento antes de uso em experimentos futuros.

5. Cultivo da placa de Petri Pseudomonas Aeruginosa

  1. Derreta ágar no micro-ondas por aproximadamente 5 minutos, ou até a solução ficar líquida.
  2. Abra e desinfete uma superfície de armário de segurança classe II com solução de etanol a 70%, pronta para uso. Realize todas as etapas abaixo nesta seção dentro deste gabinete de segurança classe II.
  3. Meça 25 mL de solução de ágar em um frasco de 50 mL e despeje em uma placa de Petri de 90 mm, esperando o ágar firmar.
  4. Recupere estoques congelados de P. aeruginosa , PAO1 e PA14 do freezer a -80 °C. Coloque estoques na incubadora a 37 °C por aproximadamente 5 minutos, ou até que o conteúdo esteja completamente descongelado.
  5. Mergulhe o laço de inoculação dentro de qualquer um dos estoques descongelados de P. aeruginosa e espalhe a amostra sobre o ágar.
  6. Repita o passo 5.5 para a outra cepa de P. aeruginosa , criando duas culturas separadas de placas de Petri de P. aeruginosa , uma com a cepa PAO1 e outra com a cepa PA14.
  7. Rotule cada placa de Petri com a cepa de P. aeruginosa , data de renascimento e iniciais, depois coloque na incubadora por 16–18 horas a 37 °C.
    NOTA: (PONTO DE PAUSA) AS PLACAS DE Petri P. aeruginosa PAO1 e PA14 podem ser armazenadas a 4 °C por um período de armazenamento de até 4 semanas e usadas em experimentos futuros.

6. Estoques de glicerol PAO1 e PA14 de Pseudomonas aeruginosa

  1. Abra e desinfete um armário de segurança classe II para uso, selecione oito frascos de 50 mL para conter as culturas noturnas.
  2. Utilizando o meio FAB de citrato de sódio previamente fabricado e citrato de sódio (seção 3), despeje 5 mL de meio TSB em quatro dos oito frascos e o meio FAB mínimo de citrato de sódio nos quatro restantes.
  3. Utilizando as placas de Petri previamente incubadas e um laço de inoculação, toque cinco colônias separadas na placa de Petri PAO1 de P. aeruginosa e transfira para um dos frascos do TSB. Repita isso para o meio FAB de citrato de sódio e para a placa de Petri da cepa P. aeruginosa PA14.
  4. Submerga um laço de inoculação limpo diretamente nos quatro frascos restantes de TSB e citrato de sódio para FAB, formando os controles.
  5. Incube todos os oito frascos em uma incubadora agitada por 16–18 horas a 200 RPM e 37 °C e marque claramente.
  6. Retire os frascos de cultura, certifique-se de que os inoculados com P. aeruginosa estejam turvos e os usados como controles permaneçam limpos.
  7. Centrifuge os quatro frascos inoculados com P. aeruginosa a 4000 × g por 5 minutos a 20 °C para separar P . aeruginosa do meio de cultura. Certifique-se de que a centrífuga esteja equilibrada.
  8. Desconsidere o sobrenadante e ressuspenda o pellet de P. aeruginosa após centrifugação com 1 mL de solução contendo 15% de glicerol, com 150 μL de glicerol e 850 μL de TSB fresco ou meio FAB de citrato de sódio.
  9. Transfira culturas ressuspensas para frascos de 1 mL e coloque no freezer de -80 °C.
    NOTA: (PONTO DE PAUSA) Estoques de glicerol podem ser armazenados a -80 °C para armazenamento a longo prazo e usados em experimentos futuros.

7. Medição da densidade óptica de culturas durante a noite

  1. Repita os passos 6.1–6.5, apenas para dois frascos de meio TSB, com um como controle e o outro com a cepa PAO1 P. aeruginosa .
  2. Pipete 1 mL de meio TSB em um frasco de espectrofotômetro de 1 mL, dentro de um gabinete de segurança classe II, e transfira 0,9 mL de meio TSB para o segundo frasco, suplementando com 0,1 mL da cultura noturna.
  3. Ajuste o espectrofotômetro para um comprimento de onda de luz de 600 nm e, usando o frasco do espectrofotômetro TSB de 1 mL para calibrar a máquina, meça a densidade óptica do frasco de suspensão15 de 0,1 mL.
    1. Se a absorvância medida não indicar 0,1, recalcule o volume de suspensão necessário.
      NOTA: O volume de suspensão necessário para alcançar uma leitura de absorvância de 0,1 (V1) pode ser calculado usando a leitura inicial de absorção do frasco de suspensão de 0,1 mL, C1, a absorção desejada para a qual a suspensão está sendo ajustada, C2, e o volume de suspensão concentrada durante a noite desejado, V2:
      C1V1 = C2V2
      No exemplo acima, se C1 = 3,59, C2 = 0,1 e V2 = 10 mL, o volume de suspensão noturna desejado seria 0,279 mL em uma solução de 10 mL.
  4. Meça 10 mL de meio TSB em um frasco de 50 mL e remova o mesmo volume de meio TSB que o volume de suspensão necessário para criar uma suspensão de 10 mL 0,1 OD 600 nm. Usando a cultura noturna, adicione o volume de suspensão calculado e o vórtice por aproximadamente 5 s para misturar.
  5. Transfira 1 mL da suspensão ajustada de 10 mL para um frasco de espectrofotômetro e meça novamente a absorvância para garantir que seja 0,1.
  6. Repita os 7,1–7,5 acima para o meio PA14 e TSB, e para ambas as cepas de P. aeruginosa e para o meio citrato de sódio FAB.

8. Contagem celular viável

  1. TransfiradH 2Opara uma placa de Petri quadrada dentro de um armário de segurança classe II e use uma pipeta multicanal para transferir 180 μL para as colunas 2–9 de uma placa de poliestireno transparente de 96poços 16.
  2. Transfira a suspensão 0,1 OD 600 de 10 mL para uma placa de Petri quadrada separada e, usando a pipeta multicanal, transfira 200 μL da suspensão para a coluna 1 da placa de poliestireno de 96 poços.
  3. Transferir mais de 20 μL de suspensão usando a pipeta multicanal da coluna 1 da placa de poliestireno de 96 poços para o canal 2, seguido pela transferência de 20 μL de suspensão diluída no canal 2 para o canal 3, repetindo para o canal nove, criando diluições de suspensão de 10-1 para 10-8.
  4. Transfira 50 mL de ágar TS (seção 4 e passo 5.1), em um armário de segurança classe II usando um frasco, para uma placa de Petri quadrada e deixe até que o ágar fique turvo.
  5. Transfira 10 μL de cada poço ao longo das colunas 2–9 para a placa de Petri de ágar TS em formação de coluna, usando uma pipeta multicanal, garantindo que as colunas não entrem em contato entre si.
  6. Incube o ágar TS por 24 horas a 37 °C, após esperar até que as diluições transferidas se estabilizem.
  7. Calcule as unidades formadoras de colônias (UFC) por mililitro (mL) determinando se a placa de Petri é contável (entre 30 e 300 colônias).
  8. Determinar o fator de diluição da suspensão de 10 mL utilizada; nesse caso, a suspensão foi diluída para 1/10 (0,1 OD 600).
  9. Calcule os fatores de diluição individuais de cada coluna banhada. Essa é a quantidade de suspensão diluída adicionada a cada coluna dividida pelo volume total da coluna após a adição da suspensão. No caso da coluna 2 da placa de 96 poços (coluna 1 da placa de Petri), 20 μL/200 μL = 1/10.
  10. Calcule o fator de diluição total da série multiplicando os fatores individuais de diluição de cada uma das colunas.
    NOTA: Neste caso, como 20 μL foram transferidos de cada coluna para a próxima, fazendo o volume total de cada poço da coluna 200 μL, cada diluição individual em série foi 1/10. Fazendo com que a diluição total da série seja 1 × 10-8.
  11. Determine o fator de diluição do revestimento à medida que a diluição é transferida da placa de 96 poços para a placa de Petri. Para determinar CFU/mL, divida o volume de cada coluna revestida (10 μL) por 1 mL. Neste caso: figure-protocol-1.
  12. Determine o fator de diluição final multiplicando o fator de diluição da suspensão original (0,1) pelo fator de diluição total da série (1 × 10-8) e o fator de diluição do placagem (figure-protocol-2).
  13. Calcule a CFU∙mL-1 na amostra original, multiplique a CFU na placa pelo inverso do fator de diluição final.
    NOTA: Neste caso, se 200 CFU fossem contados, isso significaria realizar 200 × 1/1 × 10-8, resultando em CFU/mL sendo 2 × 1010 CFU∙mL-17.

9. Configuração do sistema microfluídico e execução experimental

  1. Inocule 5 mL de caldo de meio de cultura com cada cepa de P. aeruginosa para formar uma cultura durante a noite e incubar por 16–18 horas a 37 °C.
  2. Configure o sistema microfluídico e o software associado.
    1. Ative os componentes do sistema microfluídico na seguinte ordem: fonte de alimentação, controlador do sistema microfluídico, câmera CMOS, aquecedores de caixa, microscópio, computador e monitores associados.
    2. Ative o software microfluídico e inicie a interface do módulo de controle correspondente inserindo o código de barras multicanal 0–2 Pa, de 48 poços, associado à placa multicanal, quando solicitado, encontrado na lateral da placa multicanal.
  3. Estabeleça o procedimento de inoculação com poço multicanal de placas com P. aeruginosa .
    1. Ajuste a densidade óptica da cultura noturna para 0,1 OD600.
    2. Transfira 50 μL de suspensão 0,1 OD 600 para o poço de saída de cada um dos seis canais em paralelo dentro de um gabinete de segurança classe II.
      NOTA: Seis canais foram executados em paralelo ao mesmo tempo para maximizar a probabilidade de identificação anômala do resultado.
    3. Substitua a tampa multicanal de 48 poços e transfira-a para o palco móvel situado dentro da incubadora do sistema e prenda-o.
  4. Estabeleça o procedimento de inoculação multicanal com canal de placas com P. aeruginosa .
    1. Semeie os canais microfluídicos usando o módulo de controle do sistema microfluídico selecionando: Manual > Colunas 1–4 > Fluido: TSB a 37 °C > Cisalhamento Máximo (Pa): 0,1 (1 dyne∙cm-2 = 0,1 Pa) e selecione um poço de saída do diagrama de placa multicanal 0–2 Pa de 48 poços.
    2. Selecione o botão de abortar para interromper o fluxo após 2–4 segundos e deixe a placa por 30 minutos, para garantir que as células se fixem ao substrato do canal antes de iniciar o fluxo contínuo.
      NOTA: Uma duração de 30 minutos permite que a força gravitacional ajude a aderir a bactéria planctônica P. aeruginosa à parede inferior do canal. Esse período varia dependendo da bactéria e do tipo de meio nutritivo.
    3. Remova a placa multicanal do estágio móvel da incubadora e transfira 1 mL de TSB fresco para o poço de entrada de cada um dos seis canais em um gabinete de segurança classe II.
    4. Transfira a placa multicanal para o palco móvel dentro da incubadora e fixe-a no lugar.
  5. Configure o AutoRun.
    1. Certifique-se de que o fluxo utilizado ao longo dos experimentos de 24 horas seja relevante para onde P. aeruginosa é encontrada na natureza, navegando para a tensão de cisalhamento manual >: 0,01 Pa, e registre a vazão volumétrica (μL⋅h-1) exibida. Certifique-se de que esse valor, para a placa de microcanal de 48 poços, seja 8,2 μL⋅h-1.
    2. Converta a vazão volumétrica para m3∙s-1, calcule a área da seção transversal do canal (m2) e determine a velocidade do fluxo quando sob uma tensão de cisalhamento hidrodinâmica de 0,01 Pa.
      NOTA: Usando e rearranjando a equação da vazão volumétrica do fluido, a velocidade do fluido através do canal pode ser calculada:
      figure-protocol-3
      Onde U é a velocidade do fluido (m∙s-1) e A é a área da seção transversal do microcanal (m2) dos canais na placa multicanal.
    3. Calcule o número de Reynolds de escoamento usando a densidade, ρ, e a viscosidade dinâmica, μ, do meio TSB, e certifique-se de que ele esteja dentro de uma faixa de fluxo de fluido onde os biofilmes de P. aeruginosa sejam encontrados. Para uma tensão de cisalhamento hidrodinâmica de 0,01 Pa, certifique-se de que o número de Reynolds seja 0,0117 e 0,0165 para meios TSB e FAB, respectivamente. Se estiver fora dessa faixa, verifique se as condições do fluido estão definidas para TSB.
      figure-protocol-4
      Onde Dh é o diâmetro hidráulico do microcanal utilizado, obtido usando:
      figure-protocol-5
      Onde, w, e h, representam a largura (m) e a altura (m) do microcanal utilizado.
    4. Calcule o comprimento de revelação do fluido para garantir que o fluxo do fluido dentro da região de aquisição da imagem esteja totalmente revelado.
      NOTA: O comprimento de revelação do fluido laminar através de um canal pode ser calculado usando o número de Reynolds, Re, e o diâmetro hidráulico dos canais, Dh:
      Ldev = 0,06ReDh
    5. Configurar o autorun: Editar AutoRun > Protocolo Configuração > duração: 24 horas, com repetição de 1 e tensão de cisalhamento de 0,01 Pa. Salve o protocolo.
    6. Crie uma nova sequência na aba Configuração de Sequência aplicando o protocolo recém-criado com uma repetição, nos canais 1–6 e selecione fluido: TSB a 37 °C. Salve essa sequência.
  6. Configure a aquisição de imagem usando a janela de Aquisição Multidimensional .
    1. Selecione Aquisição Multidimensional usando o software do sistema, depois o botão ativo (canto inferior esquerdo da janela de Aquisição Multidimensional ). Navegue pelo palco do microscópio para visualizar os canais 1–6 usando o botão de visualização ao vivo e ampliações da câmera de 5× a 40× na tela sensível ao toque do microscópio, mostrando um canal no campo de visão da câmera por vez.
    2. Prepare a câmera para aquisição de imagem: Aquisição Multidimensional > Salvamento: selecione um diretório para as imagens a serem salvas > Timelapse: Duração: 24 h, a mesma duração do fluxo hidrodinâmico > Intervalo de tempo: Tempo entre cada imagem adquirida, definido para 10 min.
    3. Insira as configurações da câmera selecionando Comprimento de onda > Iluminação: campo claro 50% câmera 50%: preto e branco > exposição automática: cada aquisição > adquirir: todo ponto de tempo > foco automático: nunca.
    4. Determine as posições das câmeras para capturar as imagens do biofilme ajustando a ampliação para 20×, produzindo um campo de visão com dimensões 665,6 μm × 665,6 μm e navegue até o centro da região de visualização do canal, onde o número do canal será gravado no centro.
    5. Adicione a posição do palco para que seja capturada pela câmera, navegue até o Palco e selecione o botão de adição para adicioná-lo ao diretório.
      1. Repita isso para pontos a montante a 0,9984 mm e pontos a jusante a 3,00¹⁹ mm da entrada da região de visualização do canal, onde a posição representa o ponto central do campo de visão da câmera.
        NOTA: Essas posições de imagem foram selecionadas para fornecer representações do crescimento do biofilme ao longo da região de visualização, garantindo que o fluxo interno esteja totalmente desenvolvido. Isso resulta em três imagens adquiridas para cada microcanal, neste caso, resultando em 18 imagens tiradas a cada 10 minutos.
  7. Realizar execução experimental
    1. Na janela do módulo de controle do sistema, selecione AutoRun > Run Setup > Sequence: selecione a sequência 0.01 Pa criada e depois selecione iniciar.
    2. Imediatamente em seguida, navegue até a janela de Aquisição Multidimensional > Adquirir. Isso inicia a aquisição das 18 imagens a cada 10 minutos do procedimento experimental de 24 horas, produzindo 2610 imagens quando o experimento termina.
      NOTA: A seção acima foi reproduzida em mais seis microcanais aproximadamente 48 horas após o experimento inicial com condições idênticas.

10. Acumulação de Z-stack

  1. Ao final de cada execução experimental, selecione três canais e obtenha z-stacks de três seções ao longo deles com ampliação de 40×, abrindo a Aquisição Multidimensional > Main: desmarque todas as opções, exceto 'Série Z'.
  2. Navegue para a série Z após uma seção ao longo de um canal ter sido selecionada dentro da Aquisição Multidimensional e altere > Configurações interativas: Incremento: 0,5 e desmarque ambas as caixas.
  3. Use o botão de foco do microscópio e gire até o biofilme ficar fora de foco, e insira a distância z selecionando Definir Topo para Corrente. Repita esse procedimento, mas girando o botão de foco na direção oposta e selecionando Definir Fundo para Corrente. Isso dá ao microscópio o alcance para capturar a pilha z.
  4. Selecione uma pasta na janela de Salvar para salvar a pilha z e selecione Adquirir no canto inferior direito da janela para iniciar a aquisição.

11. Análise pós-experimento de imagens e dados

  1. Obtenha dados de porcentagem de cobertura de área de superfície de biofilme.
    1. Carregue as imagens adquiridas no software do sistema escolhendo: Ferramentas de análise > Revise Dados Multidimensionais > selecione Arquivo Base > Selecione Diretório: navegue até e selecione a pasta com as imagens salvas > Ver > Comprimento de Onda 1 e, na seção quadrada central exibindo horizontalmente o número de imagens adquiridas, clique com o botão direito na pequena caixa cinza no topo, canto esquerdo.
    2. Carregue as imagens de cada seção do canal, uma a uma, escolha Posição do palco: selecione a posição para visualizar > Carregar Imagem. Salve a série de imagens como um arquivo TIFF.
    3. Limite a imagem selecionando Imagem Limiar > Limite Automático para Objetos Escuros destacando o biofilme, depois contorne a imagem usando a ferramenta Região Retangular .
      NOTA: O controle deslizante no lado esquerdo da imagem com limiar pode ser movido para cima e para baixo para alterar a intensidade do limiar e diferenciar melhor entre biofilme e fundo. Se a imagem tiver sombras, contorne a seção sem, pois as sombras podem ter sido destacadas por padrão, alterando os valores de medição.
    4. Obtenha dados sobre a porcentagem de cobertura de área de superfície do biofilme na imagem durante o experimento de 24 horas selecionando as Medições de Região de Medida >> Região de Medida Padrão MM na janela do software do sistema para gerar uma tabela de dados sobre o biofilme destacado dentro da borda retangular, incluindo a Área Limiar % (Threshold Area). Selecione Abrir Log para abrir e salvar um arquivo de log e F9: Log Data para inserir os dados no arquivo de log.
    5. Abra uma planilha e, usando os dados de biofilme de 24 horas para cada seção de canal, crie um gráfico mostrando a porcentagem de cobertura da área de superfície do biofilme ao longo de 24 horas.
  2. Obtenha a espessura do biofilme e a rugosidade média aritmética da superfície.
    1. Salvei a pilha z para Fiji (ImageJ) arrastando o arquivo salvo para a barra de controle Fiji e convertendo para uma imagem de 8 bits: Imagem > Tipo > 8 bits.
    2. Aumente o contraste entre o biofilme e a superfície do canal para eliminar qualquer ruído indesejado: Imagem > Ajuste > Brilho/Contraste.
    3. Limite a imagem, definindo o valor do pixel do biofilme 255 (branco) e o valor do pixel de fundo 0 (preto): Imagem > Ajustar > Threshold.
    4. Defina a escala da imagem, analise > defina a escala > distância em pixels: 2048 > Distância conhecida: 332,8 > Proporção de aspecto do pixel: 1,0 > Unidade de comprimento: μm.
      NOTA: A distância conhecida é de 332,8 μm, pois a câmera Hamamatsu usada possui um campo de visão de 2048 × 2048 pixels, com cada pixel tendo um tamanho de 6,5 μm e imagens tiradas com ampliação de 40 ×.
    5. Analise a pilha Z usando uma macropersonalizada 18 (Arquivo Suplementar 1) que calcula e soma a área de superfície do biofilme em cada fatia da pilha z e usa os valores da escala de entrada para calcular a espessura da série, permitindo que o volume seja encontrado. Alternativamente, encontre a espessura do biofilme dividindo o volume calculado pela área superficial.
    6. Obtenha os valores médios aritméticos de rugosidade superficial do biofilme de cada série z baixando o plugin SurfCharJ (não Fiji) e salve-o na pasta de plugins .
    7. Faça upload da pilha z para o ImageJ arrastando a pilha salva para a barra de controle e convertendo-a para uma imagem de 32 bits: Tipo > Imagem: 32 bits.
    8. Crie um gráfico de superfície, mostrando a variação nos valores de cinza ao longo da superfície da pilha: Analise > Perfil de Gráfico > Mais: Gráfico de Alta Resolução. Converta o gráfico de alta resolução para 32 bits.
    9. Obtenha o valor médio aritmético da rugosidade da superfície iniciando o plugin SurfCharJ: Plugins > SurfCharJ > Cálculo de rugosidade: Comprimento médio de amostragem (): 10.
      NOTA: O plugin SurfCharJ usa os vários valores cinza ao longo da superfície da pilha z para calcular a rugosidade média aritmética da superfície. Uma tabela contendo parâmetros de rugosidade superficial será produzida, sendo o único parâmetro de interesse a média aritmética da rugosidade da superfície, Ra. Os valores da tabela precisarão ser convertidos em micrômetros a partir dos pixels.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta seção descreve os resultados representativos ao aplicar o procedimento do protocolo acima. Todos os experimentos foram realizados com pelo menos três réplicas biológicas independentes, cada uma consistindo em seis canais paralelos, e os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Barras de erro em todos os grafos representam desvio padrão, conforme definido nas legendas das figuras.

O crescimento das deformações PAO1 e PA14 a 37 °C, em mei...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As várias etapas críticas que formam esse protocolo em conjunto permitem uma análise mais abrangente e precisa da formação do biofilme do que métodos alternativos e mais tradicionais. Um componente chave é o uso de uma placa de microcanais de 48 poços, com canais em microescala de dimensões 350 μm × 70 μm × 4 mm (L × H × L). Essas dimensões replicam especificamente as condições de fluxo e microambientes encontrados em ambientes hospitalares, como cateteres urinários ou bronquíolos pulmon...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer à Escola de Engenharia Mecânica, Aeroespacial e Civil (MAC) da Universidade de Sheffield pelo financiamento.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
(NH4)2SO4Acros Organics7783-20-2Para meio FAB modificado
Placa microcanal 0-2 Pa de 48 poços - revestimento de vidroMicrossistemas Celulares910-0047-5PackMicrocanais para fluxo de mídia e crescimento de biofilme
com imagem em tempo real
-80 ° C FreezerThermo Fisher Scientific1.16057E+15Para armazenar estoques de glicerol até uso adicional
Agar, grau bacteriológicoAcros Organics443570010Para placas de ágar - cultivo de bactérias
Balanço AnalíticoVWRVWRI611-2297Para medir componentes dos meios utilizados
AutoclavePriorclave4304Para esterilizar vidrarias
BioFlux 1000HTI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell- microsistemas/dispositivo/bioflux-1000ht-
sistema de cisalhamento/ 		Para experimentos de fluxo em microcanais e crescimento de biofilme
Módulo de Controle BioFluxI& L Biosystemshttps://il-biosystems.com/cell-
microsistemas/dispositivo/bioflux-1000ht- sistema de cisalhamento-fluxo/ 		Configurar e monitorar o fluxo de mídia e o crescimento de biofilmes nos microcanais
BioFlux Montage SoftwareI& L Biosystemshttps://il-
biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf		Configurar e monitorar o fluxo de mídia e o crescimento de biofilmes nos microcanais
CaCl2Fisher Scientific10043-52-4Para meio FAB modificado
CaSO4.2H2OChemCruzA1719Para solução de 1 L de metais mínimos
Placa de Poliestireno Transparente de 96 poçosCorning, CoadjuvanteCLS7007Para contagem celular viável
CoSO4.7H2OSigma-Aldrich10026-24-1Para solução de 1 L de metais mínimos
CuSO4.5H2OHoneywell209198-100GPara solução de 1 L de metais mínimos
Válvulas Eppendorf 3810XEppendorf30125150Para estoques de glicerol de P. aeruginosa
FeSO4.7H2OVWR International Ltd.284005EPara solução de 1 L de metais mínimos
Fiji (ImageJ)Institutos Nacionais de Saúdehttps://imagej.net/software/fiji/downloa
ds		Processamento de imagem Z-stack
GlicoseSigma-Aldrich50-99-7Para FAB Medium modificado com glicose
GlicerolSigma-Aldrich56-81-5Para estoques de glicerol de P. aeruginosa
H3BO3Fisher Scientific10043-35-3Para solução de 1 L de metais mínimos
Câmera Hamamatsu Orca-Flash 4.0 Modelo C11440-
42U		HamamatsuC11440-42UPara fluxo de microcanais e crescimento de biofilme
experimentos de imagem em tempo real
KH2PO4Biorreagentes Fisher7778-77-04Para meio FAB modificado
Álcool MetiladoSigma-Aldrich2857Para limpar o armário de microbiologia antes e depois < uso do br/>
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100GPara meio FAB modificado
Gabinete de Microbiologia Classe IIThermo Fisher Scientific42111226Realizar os passos do protocolo sem
bactérias, caldo ou ágar contaminantes
Mini IncubadoraLabnet InternationalSN03171014Para descongelar PAO1 e PA14 após -80 °C; Freezer C e
para crescimento inicial de placas de ágar bacterianas em 24 horas
MnSO4. H2OSigma-Aldrich10034-96-5Para solução de 1 L de metais mínimos
Na2HPO4.2H2OSigma-Aldrich10102-40-6Para meio FAB modificado
NaClSigma-AldrichS5886-500GPara meio FAB modificado
NaMoO4. H2OSigma-Aldrich10102-40-6Para solução de 1 L de metais mínimos
Equilíbrio de PrecisãoVWRVWRI611-2299Para medir componentes dos meios utilizados
Centrífuga refrigeradaHeraeus40289841Separando a cultura de P. aeruginosa do supernadante
para estoques de glicerol
Cuvetas Semi-MicroLaboratórios AlphaX72053Para medições de densidade óptica
Incubadora de TremoresINFORS HThttps://infors- ht.com/en/products/incubator- shakers/multitron-padrãoPara culturas noturnas
Citrato de sódioSigma-Aldrich71498-250GPara o meio FAB modificado com citrato de sódio
Anéis de inoculação plástica estéreisMicroespecificação15782105Para P. aeruginosa, a inoculação PAO1 e PA14 em placas de ágar e tubos de falcão
Ágar de Soja Tríptico, vegitoneMillipore14432-500G-FPara placas de ágar - cultivo de bactérias
Caldo de Soja TripticoSigma-AldrichT8907Meio de cultivo desidratado - 6 g/200 mL
Dispensador de Água Tipo 1Thermo Fisher ScientificSN42103311Para água distiled
ZnSO4.7H2OFisher Scientific7446-20-0Para solução de 1 L de metais mínimos

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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