Este protocolo avalia a influência das composições de meios nutritivos ricos (TSB) e mínimos (FAB) no desenvolvimento de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa PAO1 e PA14 em um ambiente de fluxo em regime estacionário em um microcanal.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Este protocolo avalia a influência das composições de meios nutritivos ricos (TSB) e mínimos (FAB) no desenvolvimento de biofilmes de Pseudomonas aeruginosa PAO1 e PA14 em um ambiente de fluxo em regime estacionário em um microcanal.
A bactéria patogênica Pseudomonas aeruginosa é uma das principais causas de infecções nosocomiais, e sua crescente resistência aos antimicrobianos a tornou uma ameaça significativa à saúde pública. Este artigo apresenta um protocolo abrangente detalhando o uso de um sistema microfluídico para a visualização e quantificação em tempo real do desenvolvimento de biofilmes em duas cepas principais de P. aeruginosa , PAO1 e PA14. O método emprega placas de microcanais multicanal opticamente transparentes para submeter culturas bacterianas a um fluxo contínuo e constante de meio, incluindo caldo de soja tríptico (TSB) ou caldo anaeróbico mínimo e meticuloso modificado (FAB) com diferentes concentrações de fontes de carbono, imitando assim condições encontradas nos ambientes clínicos. Ao longo de um período de 24 horas, a imagem automatizada em tempo real captura o crescimento e maturação dos biofilmes na forma de cobertura da área de superfície, espessura e rugosidade superficial do biofilme, de maneira altamente reproduzível. O objetivo experimental é usar os resultados para demonstrar que a formação de biofilmes para ambas as cepas é significativamente impactada por mudanças na composição do meio nutritivo. O objetivo desse protocolo visualizado é fornecer um método para que pesquisadores estudem a dinâmica dos biofilmes sob condições de fluxo laminar estacionário, e os insights obtidos poderiam ser aproveitados para desenvolver estratégias alternativas não antimicrobianas para erradicar biofilmes de P . aeruginosa em estágio inicial em ambientes nosocomiais.
O objetivo desse método é observar o impacto de dois meios culturais diferentes, ou seja, caldo de soja tríptico (TSB) e caldo anaeróbico mínimo modificado (FAB), no crescimento de biofilme de duas cepas de Pseudomonas aeruginosa , a saber, PAO1 e PA14. Embora P. aeruginosa PAO1 e PA14 sejam cepas de referência laboratoriais comuns, a cepa PA14 infecta uma proporção maior de hospedeiros, desde plantas atéinvertebrados 1. O caldo nutritivo TSB é um meio de cultivo de uso geral com 2,5 g/L de glicose como fonte de carbono e é capaz de cultivar uma ampla variedade de bactérias devido à sua compos....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
1. Limpeza de vidros
2.....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Esta seção descreve os resultados representativos ao aplicar o procedimento do protocolo acima. Todos os experimentos foram realizados com pelo menos três réplicas biológicas independentes, cada uma consistindo em seis canais paralelos, e os dados são apresentados como média ± desvio padrão. Barras de erro em todos os grafos representam desvio padrão, conforme definido nas legendas das figuras.
O crescimento das deformações PAO1 e PA14 a 37 °C, em mei.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
As várias etapas críticas que formam esse protocolo em conjunto permitem uma análise mais abrangente e precisa da formação do biofilme do que métodos alternativos e mais tradicionais. Um componente chave é o uso de uma placa de microcanais de 48 poços, com canais em microescala de dimensões 350 μm × 70 μm × 4 mm (L × H × L). Essas dimensões replicam especificamente as condições de fluxo e microambientes encontrados em ambientes hospitalares, como cateteres urinários ou bronquíolos pulmon.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Os autores não têm nada a revelar.
Os autores gostariam de agradecer à Escola de Engenharia Mecânica, Aeroespacial e Civil (MAC) da Universidade de Sheffield pelo financiamento.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (NH4)2SO4 | Acros Organics | 7783-20-2 | Para meio FAB modificado |
| Placa microcanal 0-2 Pa de 48 poços - revestimento de vidro | Microssistemas Celulares | 910-0047-5Pack | Microcanais para fluxo de mídia e crescimento de biofilme com imagem em tempo real |
| -80 ° C Freezer | Thermo Fisher Scientific | 1.16057E+15 | Para armazenar estoques de glicerol até uso adicional |
| Agar, grau bacteriológico | Acros Organics | 443570010 | Para placas de ágar - cultivo de bactérias |
| Balanço Analítico | VWR | VWRI611-2297 | Para medir componentes dos meios utilizados |
| Autoclave | Priorclave | 4304 | Para esterilizar vidrarias |
| BioFlux 1000HT | I& L Biosystems | https://il-biosystems.com/cell- microsistemas/dispositivo/bioflux-1000ht- sistema de cisalhamento/ | Para experimentos de fluxo em microcanais e crescimento de biofilme |
| Módulo de Controle BioFlux | I& L Biosystems | https://il-biosystems.com/cell- microsistemas/dispositivo/bioflux-1000ht- sistema de cisalhamento-fluxo/ | Configurar e monitorar o fluxo de mídia e o crescimento de biofilmes nos microcanais |
| BioFlux Montage Software | I& L Biosystems | https://il- biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf | Configurar e monitorar o fluxo de mídia e o crescimento de biofilmes nos microcanais |
| CaCl2 | Fisher Scientific | 10043-52-4 | Para meio FAB modificado |
| CaSO4.2H2O | ChemCruz | A1719 | Para solução de 1 L de metais mínimos |
| Placa de Poliestireno Transparente de 96 poços | Corning, Coadjuvante | CLS7007 | Para contagem celular viável |
| CoSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 10026-24-1 | Para solução de 1 L de metais mínimos |
| CuSO4.5H2O | Honeywell | 209198-100G | Para solução de 1 L de metais mínimos |
| Válvulas Eppendorf 3810X | Eppendorf | 30125150 | Para estoques de glicerol de P. aeruginosa |
| FeSO4.7H2O | VWR International Ltd. | 284005E | Para solução de 1 L de metais mínimos |
| Fiji (ImageJ) | Institutos Nacionais de Saúde | https://imagej.net/software/fiji/downloa ds | Processamento de imagem Z-stack |
| Glicose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | Para FAB Medium modificado com glicose |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Para estoques de glicerol de P. aeruginosa |
| H3BO3 | Fisher Scientific | 10043-35-3 | Para solução de 1 L de metais mínimos |
| Câmera Hamamatsu Orca-Flash 4.0 Modelo C11440- 42U | Hamamatsu | C11440-42U | Para fluxo de microcanais e crescimento de biofilme experimentos de imagem em tempo real |
| KH2PO4 | Biorreagentes Fisher | 7778-77-04 | Para meio FAB modificado |
| Álcool Metilado | Sigma-Aldrich | 2857 | Para limpar o armário de microbiologia antes e depois < uso do br/> |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | Para meio FAB modificado |
| Gabinete de Microbiologia Classe II | Thermo Fisher Scientific | 42111226 | Realizar os passos do protocolo sem bactérias, caldo ou ágar contaminantes |
| Mini Incubadora | Labnet International | SN03171014 | Para descongelar PAO1 e PA14 após -80 °C; Freezer C e para crescimento inicial de placas de ágar bacterianas em 24 horas |
| MnSO4. H2O | Sigma-Aldrich | 10034-96-5 | Para solução de 1 L de metais mínimos |
| Na2HPO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 10102-40-6 | Para meio FAB modificado |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886-500G | Para meio FAB modificado |
| NaMoO4. H2O | Sigma-Aldrich | 10102-40-6 | Para solução de 1 L de metais mínimos |
| Equilíbrio de Precisão | VWR | VWRI611-2299 | Para medir componentes dos meios utilizados |
| Centrífuga refrigerada | Heraeus | 40289841 | Separando a cultura de P. aeruginosa do supernadante para estoques de glicerol |
| Cuvetas Semi-Micro | Laboratórios Alpha | X72053 | Para medições de densidade óptica |
| Incubadora de Tremores | INFORS HT | https://infors- ht.com/en/products/incubator- shakers/multitron-padrão | Para culturas noturnas |
| Citrato de sódio | Sigma-Aldrich | 71498-250G | Para o meio FAB modificado com citrato de sódio |
| Anéis de inoculação plástica estéreis | Microespecificação | 15782105 | Para P. aeruginosa, a inoculação PAO1 e PA14 em placas de ágar e tubos de falcão |
| Ágar de Soja Tríptico, vegitone | Millipore | 14432-500G-F | Para placas de ágar - cultivo de bactérias |
| Caldo de Soja Triptico | Sigma-Aldrich | T8907 | Meio de cultivo desidratado - 6 g/200 mL |
| Dispensador de Água Tipo 1 | Thermo Fisher Scientific | SN42103311 | Para água distiled |
| ZnSO4.7H2O | Fisher Scientific | 7446-20-0 | Para solução de 1 L de metais mínimos |
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Este artigo foi publicado
Vídeo em breve