Este protocolo descreve o método para configurar o ensaio de formação da mamosfera para estudar a estano do câncer induzida pelo Inibidor da Apoptose 5 (Api5) em células epiteliais mamárias não tumorigênicas. Lisados coletados de mamosferas de geração primária são analisados para diferentes marcadores de caule para avaliar a indução de propriedades semelhantes às células-tronco.
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Artigo de método
Ensaio da Mamomosfera Revela Estalo Induzido por Api5 em Linhas Celulares Epiteliais da Mama Não Tumorigênicas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O câncer de mama continua sendo o câncer mais prevalente entre as mulheres no mundo todo, com as maiores taxas de incidência e mortalidade padronizadas por idade. Apesar dos avanços nas terapias voltadas para o câncer de mama, 20% das pacientes apresentam recaída da doença, o que pode ser atribuído a uma população de células-tronco cancerígenas (CSCs) resistentes à terapia. Esses CSCs podem sobreviver a tratamentos convencionais permanecendo em estágio de repouso ou persistir devido à resseção incompleta da massa tumoral, resultando em recidiva em estágio posterior. Por isso, pesquisas recentes têm se concentrado em identificar, isolar e direcionar essa população resistente de células. In vitro, o ensaio de formação da mamosfera serve como um robusto sistema de cultura em suspensão tridimensional para enriquecer e propagar células semelhantes a troncos dentro de populações epiteliais mamárias. Aqui, apresentamos uma abordagem utilizando o ensaio da mamosfera para avaliar o fenótipo semelhante a células-tronco cancerígenas que é habilitado em células epiteliais mamárias não tumorigênicas pela superexpressão do Inibidor da Apoptose 5 (Api5). O protocolo envolve a propagação de mamosferas por passagens seriadas para avaliar a eficiência da formação da mamosfera e a capacidade de autor-renovação. Além disso, lisados proteicos coletados de mamosferas são sondados para identificar marcadores de caule estabelecidos por meio de imunoblot. Este ensaio permite a investigação de novos reguladores, como o Api5, de propriedades semelhantes às células-tronco cancerígenas em populações de células epiteliais mamárias. A abordagem descrita pode ser adaptada para estudos comparativos de intervenções moleculares ou para triagem de agentes terapêuticos que visam CSCs in vitro.
Introdução
O aumento dos cânceres de mama resistentes à quimioterapia levou a uma ênfase crescente na identificação e alvo da causa subjacente da resistência à terapia e da recaída, uma população de células cancerígenas conhecida como células-tronco cancerígenas. Essas células são caracterizadas por sua capacidade de evitar a diferenciação e permanecer quietas, permitindo que resistam a diferentes modalidades de tratamentodo câncer 1,2. Diversos métodos podem ser empregados para identificar células-tronco do câncer de mama, incluindo o ensaio de formação damamosfera
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Protocolo
1. Revestimento de placas de cultura de tecidos com poli(2-hidroxietil metacrilato), pHEMA
- Dissolva 1,2 g de pHEMA (peso molecular ̴ 300.000) em 100 mL de etanol 95% mexendo constantemente a 65 °C para preparar uma solução de pHEMA a 1,2% (veja a Tabela de Materiais).
- Recubra as placas padrão de cultura de tecidos com pHEMA aplicando 1 mL por poço de uma placa de 6 poços. O volume da solução de pHEMA pode ser ajustado com base no tamanho do vaso da cultura de tecido.
- Deixe as placas secarem no forno a 40 °C em condições estéreis.
- Expõe as placas à luz UV por 15 minutos, seguida de três lavagen....
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Resultados
Para avaliar a eficiência da formação da mamomosfera sob condições não aderentes, células MCF10A dissociadas de controle e sobreexpressão de Api5 foram semeadas em placas revestidas com poliHEMA conforme o protocolo. Células Api5 superexpressas demonstraram um aumento de 1,58 vezes na eficiência média de formação da mamosfera do que os controles (Figuras 1B,C). Esse aumento demonstra que uma maior expressão de Api5 incrementa a proporção de progenitores semelhantes a células.......
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Discussão
Enquanto culturas monocamadas de linhagens celulares cancerígenas estabelecidas ou células derivadas de tumores forneçam insights sobre as diversas vias moleculares que regulam os fenótipos do câncer, pesquisas focadas em células-tronco cancerígenas não podem ser conduzidas em culturas bidimensionais. Como acredita-se que as células-tronco cancerígenas sejam um fator importante que contribui para a recaída após as estratégias de tratamento atuais, é necessário estabelecer ensaios robusto.......
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Divulgações
Os autores declaram que não há potencial conflito de interesses.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por uma bolsa da SERB-POWER (SPG/2021/002661-G) e parcialmente pelo financiamento do IISER, Pune Core. O S.B. foi financiado pela bolsa da UGC-SRF. Gostaríamos de agradecer ao Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, EUA) por fornecer generosamente as células MCF10A e ao Dr. Abhijith K (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd.) por suas valiosas contribuições sobre o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C humidified incubator | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| Anti-Bmi1 Rabbit pAb | ABclonal | A13472 | 1:1000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature |
| Anti-Nanog Rabbit mAb | ABclonal | A22625 | 1:5000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Oct3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Sox2 Antibody (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Invitrogen | 12587010 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL stock in dH2O |
| DMEM/F12 | Thermo | 11330032 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL stock in dH2O |
| Ethanol absolute 99.9% | Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany | 58051 L05 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | SRL | 43272 | |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965126 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050122 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Qualigens | Q29145 | Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0) |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL stock in ethanol |
| ImageJ | Image processing software | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate | Merck | WBKLS0500 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid |
| Nikon Eclipse TS-100 microscope | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A cells | Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) | ||
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830-5G | |
| Plotting software | GraphPad Prism 10 | ||
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA) | Santacruz | sc-253284 | 1.2% pHEMA in 95% ethanol |
| Sodium chloride (NaCl) | SRL | 41721 | |
| Sodium deoxycholate | Amresco | 0613-100G | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | SRL | 54468 | |
| Sodium fluoride (NaF) | HiMedia | RM1081-500G | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris buffer | SRL | 71033 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML |
Referências
- Li, X., et al. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).
- Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional th....
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Reimpressões e permissões
