Este protocolo descreve o método para configurar o ensaio de formação da mamosfera para estudar a estano do câncer induzida pelo Inibidor da Apoptose 5 (Api5) em células epiteliais mamárias não tumorigênicas. Lisados coletados de mamosferas de geração primária são analisados para diferentes marcadores de caule para avaliar a indução de propriedades semelhantes às células-tronco.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Ensaio da Mamomosfera Revela Estalo Induzido por Api5 em Linhas Celulares Epiteliais da Mama Não Tumorigênicas
Neste artigo
Resumo
Resumo
O câncer de mama continua sendo o câncer mais prevalente entre as mulheres no mundo todo, com as maiores taxas de incidência e mortalidade padronizadas por idade. Apesar dos avanços nas terapias voltadas para o câncer de mama, 20% das pacientes apresentam recaída da doença, o que pode ser atribuído a uma população de células-tronco cancerígenas (CSCs) resistentes à terapia. Esses CSCs podem sobreviver a tratamentos convencionais permanecendo em estágio de repouso ou persistir devido à resseção incompleta da massa tumoral, resultando em recidiva em estágio posterior. Por isso, pesquisas recentes têm se concentrado em identificar, isolar e direcionar essa população resistente de células. In vitro, o ensaio de formação da mamosfera serve como um robusto sistema de cultura em suspensão tridimensional para enriquecer e propagar células semelhantes a troncos dentro de populações epiteliais mamárias. Aqui, apresentamos uma abordagem utilizando o ensaio da mamosfera para avaliar o fenótipo semelhante a células-tronco cancerígenas que é habilitado em células epiteliais mamárias não tumorigênicas pela superexpressão do Inibidor da Apoptose 5 (Api5). O protocolo envolve a propagação de mamosferas por passagens seriadas para avaliar a eficiência da formação da mamosfera e a capacidade de autor-renovação. Além disso, lisados proteicos coletados de mamosferas são sondados para identificar marcadores de caule estabelecidos por meio de imunoblot. Este ensaio permite a investigação de novos reguladores, como o Api5, de propriedades semelhantes às células-tronco cancerígenas em populações de células epiteliais mamárias. A abordagem descrita pode ser adaptada para estudos comparativos de intervenções moleculares ou para triagem de agentes terapêuticos que visam CSCs in vitro.
Introdução
O aumento dos cânceres de mama resistentes à quimioterapia levou a uma ênfase crescente na identificação e alvo da causa subjacente da resistência à terapia e da recaída, uma população de células cancerígenas conhecida como células-tronco cancerígenas. Essas células são caracterizadas por sua capacidade de evitar a diferenciação e permanecer quietas, permitindo que resistam a diferentes modalidades de tratamentodo câncer 1,2. Diversos métodos podem ser empregados para identificar células-tronco do câncer de mama, incluindo o ensaio de formação damamosfera 3,4,5, a classificação celular baseada nos marcadores de superfície celular 6,7, isolamento baseado nas propriedades do fluxo, ensaios in vivo de tumorigenicidade7 e a avaliação de moduladores nucleares de células-tronco como Oct48, Nanog9, Sox210 eBMI 11. Normalmente, identificar e isolar células-tronco cancerígenas envolve uma combinação de uma ou mais dessas abordagens.
O inibidor da apoptose 5 (Api5) é uma proteína antiapoptótica que foi encontrada como aumentada em vários tipos de câncer, incluindo câncer de mama 12,13,14, câncer de colo do útero 15,16,17, leucemia linfoide crônicade células B 18 e câncer de pulmão não de pequenas células 19. Altos níveis de Api5 foram associados à resistência à quimioterapia no colo doútero 16 e ao câncer de mama triplo negativono 12. Há evidências crescentes de que resistência e recaída à terapia são frequentemente impulsionadas por células-troncocancerígenas 20,21. Um estudo interessante de Song et al.22 revelou que a superexpressão de Api5 em células de câncer cervical resulta em níveis elevados de Narag, contribuindo para o aumento da estanque do câncer. Estudos anteriores do nosso laboratório mostraram que a superexpressão de Api5 leva à transformação de células epiteliais mamárias não tumorigênicas cultivadas em culturas 3D suportadas por Matrigel. Essas células transformadas apresentam polaridade perturbada, aumento da proliferação, crescimento independente da ancoragem e um fenótipo parcial semelhante à transição epitelial para mesenquimata (EMT). As mudanças fenotípicas observadas com a superexpressão de Api5 em culturas 3D foram mantidas após dissociar os esferoides em culturas monocamada14. Considerando que o Api5 é aumentado em cânceres de mama triplo negativos resistentes à quimioterapia, especulamos que o Api5 também pode regular as propriedades de cautelagem do câncer em células epiteliais mamárias.
Nesse contexto, descrevemos o ensaio de formação da mamosera para identificar células-tronco cancerígenas a partir de células epiteliais mamárias dissociadas 3D não tumorigênicas transformadas pela superexpressão de Api5, seguido por western blotting para marcar células-tronco para confirmar a identidade dessas células. O ensaio da mamosfera envolve o cultivo de células epiteliais mamárias sob condições não aderentes e não diferenciadas, o que permite o enriquecimento de células semelhantes a troncos/progenitoras em estruturas tridimensionais conhecidas como mamosferas. Células epiteliais mamárias que não possuem propriedades semelhantes às do caule normalmente passam por anoikis; no entanto, células com características semelhantes às do caule dão origem amamosferas 4,5. Esse método foi originalmente desenvolvido por Dontu etal 3 e é inspirado no ensaio de neurosfera, que é usado para estudar e identificar células-tronco neurais e progenitores23. O ensaio da mamasfera descrito aqui permite a avaliação da atividade das células-tronco e da capacidade de autorrenovação em meios mínimos suplementados com B27 sem vitamina A e fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF). Células dissociadas 3D superexpressas por Api5 são semeadas de forma esparsa em placas revestidas com poli(2-hidroxietil metacrilato) (pHEMA). Isso permite que as células cresçam em condições não aderentes, de modo que cada mamosfera subsequente seja de origem clonal. As mamosferas são deixadas crescer até o sétimo dia, após o qual a eficiência da formação da mamosfera é calculada. Para distinguir células-tronco verdadeiras de células-tronco não-tronco que perdem sua capacidade proliferativa com o tempo, gerações subsequentes de formação de mamosfera são realizadas. A passagem serial das mamosferas envolve dissociar as esferas coletadas da geração primária e replacar as células individuais para formar mamosferas de geração secundária (e subsequente). Isso determina se as células podem iniciar a formação de esferas repetidamente e é quantificado como a capacidade de autorrenovação das células5.
Esse método pode ser utilizado para identificar células-tronco do câncer de mama em células epiteliais mamárias tumorigênicas ou transformadas. O método também pode ser adaptado para isolar células-tronco de câncer de mama a partir de amostras de pacientes. O sistema pode ajudar a identificar novos alvos contra células-tronco do câncer de mama que podem estar associadas à resistência à quimioterapia.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Revestimento de placas de cultura de tecidos com poli(2-hidroxietil metacrilato), pHEMA
- Dissolva 1,2 g de pHEMA (peso molecular ̴ 300.000) em 100 mL de etanol 95% mexendo constantemente a 65 °C para preparar uma solução de pHEMA a 1,2% (veja a Tabela de Materiais).
- Recubra as placas padrão de cultura de tecidos com pHEMA aplicando 1 mL por poço de uma placa de 6 poços. O volume da solução de pHEMA pode ser ajustado com base no tamanho do vaso da cultura de tecido.
- Deixe as placas secarem no forno a 40 °C em condições estéreis.
- Expõe as placas à luz UV por 15 minutos, seguida de três lavagens com o soro fosfatado tamponado (DPBS) de Dulbecco, antes de usá-las para preparar o ensaio de formação da mamosfera.
2. Semeadura de mamosferas de geração primária
- Cultura 3D de células MCF10A dissociadas (controle e superexpressão de Api5) obtida por dissociação de culturas 3D do dia 16 no meio de crescimento14.
NOTA: Composição do meio de crescimento: DMEM com alta glicemia, sem piruvato de sódio, suplementado com soro de cavalo a 5%, 10 μg/mL de insulina, 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF), 100 ng/mL de toxina da cólera e 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina (veja Tabela de Materiais). - Remova o meio gasto, lave as células com 1 mL de DPBS, depois adicione 500 μL de tripsina-EDTA 0,05% e incube a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% deCO2 por 12-15 minutos até que todas as células estejam tripsinizadas.
- Depois que todas as células forem deslocadas, adicione 2 mL de meio de ressassim para neutralizar a atividade da tripsina e gire a suspensão celular a 112 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.
NOTA: Composição do meio de ressalto: DMEM de alta glicemia, sem piruvato de sódio, suplementado com soro de cavalo a 20% e 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina. - Aspire o sobrenadante e ressuspenda a pastilha celular em 1 mL de meio mamosférico. Passe a suspensão da célula por uma agulha de 25 G para obter uma suspensão de célula única.
NOTA: Composição do meio da mamosfera: DMEM/F12 suplementado com 20 ng/mL fator de crescimento epidérmico (EGF), 1 suplemento × B27 sem vitamina A e 200 unidades/mL de penicilina-estreptomicina (veja Tabela de Materiais). - Usando um hemocitometro, conte o número de células e calcule o volume de suspensão celular necessário para semear 0,2 × 104 células por poço.
NOTA: Mantenha uma baixa densidade de semeadura para determinar com precisão a eficiência da formação da mamosfera, minimizando assim o impacto da agregação celular. Ao coletar lisados proteicos para imunobloting, a densidade celular pode ser aumentada até 2,5 × 10,5 células por poço. - Dilua o volume necessário de suspensão celular em 2 mL de meio mamomosférico e seme em cada poço de uma placa de 6 poços. As células semente em triplicação para cada condição.
- Incube a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por 7 dias.
- Após sete dias em cultura, conte manualmente o número de mamosferas com diâmetro superior a 50 μm em cada poço, seja usando um microscópio equipado com graticule ou uma grade de quadrantes sob um microscópio óptico.
- Fotografe as mamosferas usando uma câmera digital instalada em um microscópio óptico com ampliação de 20x.
- Calcule a eficiência de formação da mamosfera (MFE) usando a seguinte fórmula5
3. Semeadura de mamosferas de geração secundária
- Colete as mamosferas formadas na primeira geração em um tubo de 15 mL e centrifuge a 300 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Aspire o sobrenadante, deixando o pellet de mamosera para trás.
- Lave o pellet com DPBS.
- Adicione 200 μL de 0,05% de tripsina-EDTA ao pellet da mamosfera e incube a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5%CO2 por 2-3 minutos. Passe as mamosferas na solução de tripsina por uma agulha de 25 G três vezes para obter uma suspensão de célula única.
- Adicione 0,5 mL de meio de ressuspensão para neutralizar a atividade da tripsina e gire a suspensão celular a 112 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em 0,5 mL de meio mamosférico.
- Usando um hemocitometro, conte o número de células e calcule o volume de suspensão celular necessário para semear 0,2 × 104 células por poço.
NOTA: Mantenha uma baixa densidade celular para avaliar a capacidade de autorrenovação, minimizando assim o efeito da agregação celular. - Dilua o volume necessário de suspensão celular em 2 mL de meio mamomosférico e seme em cada poço de uma placa de 6 poços. As células semente em triplicação para cada condição.
- Incube a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por 7 dias.
- Após 7 dias em cultura, conte o número de mamosferas com diâmetro maior que 50 μm em cada placa usando um microscópio equipado com graticula ou uma grade de quadrante.
- Fotografe as mamosferas usando uma câmera digital instalada em um microscópio óptico com ampliação de 20x.
- Calcule a capacidade de autorrenovação usando a seguinte fórmula5
4. Western blot para detectar as mudanças nos marcadores de pluripotência após a superexpressão de Api5
- Colete as mamosferas formadas na primeira geração em um tubo de 15 mL e centrifuge a 300 × g por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Aspire o sobrenadante, deixando o pellet de mamosera para trás.
- Lave o pellet com DPBS.
- Colete o pellet em um tampão RIPA gelado para obter o lisato proteico e realize a imunoblotting de acordo com o protocolopadrão 24.
NOTA: Composição do tampão RIPA: 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% dodecilsulfato de sódio (SDS), 1 mM de ácido etilenediaminotetraacético (EDTA), 1 mM de fenilmetilsulfonilo fluoreto (PMSF), 10 mM de fluoreto de sódio, 1 mM ortovanato de sódio. - Sonde marcadores de caule - Oct3/4, Nanog, Sox2 e Bmi1, e controle de carga GAPDH (veja Tabela de Materiais para diluições de anticorpos).
- Quantifique os níveis de proteínas usando análise densitométrica no ImageJ. Selecione a região de interesse nas imagens de Western blot e gere um perfil de densidade para cada faixa.
- Normalize as densidades relativas da proteína de interesse em relação às do GAPDH para cada faixa. Calcule a mudança de dobra para cada proteína.
- Plote a mudança de dobras nos níveis de proteína usando qualquer software de plotagem.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Para avaliar a eficiência da formação da mamomosfera sob condições não aderentes, células MCF10A dissociadas de controle e sobreexpressão de Api5 foram semeadas em placas revestidas com poliHEMA conforme o protocolo. Células Api5 superexpressas demonstraram um aumento de 1,58 vezes na eficiência média de formação da mamosfera do que os controles (Figuras 1B,C). Esse aumento demonstra que uma maior expressão de Api5 incrementa a proporção de progenitores semelhantes a células...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Enquanto culturas monocamadas de linhagens celulares cancerígenas estabelecidas ou células derivadas de tumores forneçam insights sobre as diversas vias moleculares que regulam os fenótipos do câncer, pesquisas focadas em células-tronco cancerígenas não podem ser conduzidas em culturas bidimensionais. Como acredita-se que as células-tronco cancerígenas sejam um fator importante que contribui para a recaída após as estratégias de tratamento atuais, é necessário estabelecer ensaios robusto...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram que não há potencial conflito de interesses.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por uma bolsa da SERB-POWER (SPG/2021/002661-G) e parcialmente pelo financiamento do IISER, Pune Core. O S.B. foi financiado pela bolsa da UGC-SRF. Gostaríamos de agradecer ao Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, EUA) por fornecer generosamente as células MCF10A e ao Dr. Abhijith K (Ahammune Biosciences Pvt. Ltd.) por suas valiosas contribuições sobre o manuscrito.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C humidified incubator | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| Anti-Bmi1 Rabbit pAb | ABclonal | A13472 | 1:1000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature |
| Anti-Nanog Rabbit mAb | ABclonal | A22625 | 1:5000 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Oct3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| Anti-Sox2 Antibody (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 dilution, overnight incubation at 4 °C |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Invitrogen | 12587010 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| Cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL stock in dH2O |
| DMEM/F12 | Thermo | 11330032 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-144 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL stock in dH2O |
| Ethanol absolute 99.9% | Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany | 58051 L05 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | SRL | 43272 | |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | Invitrogen | 11965126 | |
| Horse Serum | Invitrogen | 16050122 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Qualigens | Q29145 | Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0) |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL stock in ethanol |
| ImageJ | Image processing software | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate | Merck | WBKLS0500 | |
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid |
| Nikon Eclipse TS-100 microscope | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A cells | Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA) | ||
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF) | Sigma | 78830-5G | |
| Plotting software | GraphPad Prism 10 | ||
| Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA) | Santacruz | sc-253284 | 1.2% pHEMA in 95% ethanol |
| Sodium chloride (NaCl) | SRL | 41721 | |
| Sodium deoxycholate | Amresco | 0613-100G | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | SRL | 54468 | |
| Sodium fluoride (NaF) | HiMedia | RM1081-500G | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris buffer | SRL | 71033 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML |
Referências
- Li, X., et al. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).
- Creighton, C. J., et al. Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).
- Dontu, G., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells. Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).
- Grimshaw, M. J., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).
- Shaw, F. L., et al. A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Ponti, D., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5511 (2005).
- Kim, R. J., Nam, J. S. OCT4 expression enhances features of cancer stem cells in a mouse model of breast cancer. Lab Anim Res. 27 (2), 147-152 (2011).
- Lu, X., Mazur, S. J., Lin, T., Appella, E., Xu, Y. The pluripotency factor nanog promotes breast cancer tumorigenesis and metastasis. Oncogene. 33 (20), 2655-2664 (2014).
- Leis, O., et al. Sox2 expression in breast tumours and activation in breast cancer stem cells. Oncogene. 31 (11), 1354-1365 (2012).
- Paranjape, A. N., et al. Bmi1 regulates self-renewal and epithelial to mesenchymal transition in breast cancer cells through Nanog. BMC Cancer. 14 (1), 785(2014).
- Bousquet, G., et al. High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target. Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).
- Basset, C., et al. Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome. Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).
- Kuttanamkuzhi, A., Panda, D., Malaviya, R., Gaidhani, G., Lahiri, M. Altered expression of anti-apoptotic protein Api5 affects breast tumorigenesis. BMC Cancer. 23 (1), 374(2023).
- Cho, H., et al. Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer. BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).
- Jang, H. S., et al. API5 induces cisplatin resistance through FGFR signaling in human cancer cells. Exp Mol Med. 49 (9), e374(2017).
- Song, K. H., et al. Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression. BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).
- Krejci, P., et al. The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia. J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).
- Koci, L., et al. Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo. Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).
- Phi, L. T. H., et al. Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment. Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).
- Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).
- Song, K. H., et al. API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis. Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).
- Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).
- Eyre, R., et al. Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
