Perfilamento de mutações do DNA do receptor do fator de crescimento epidérmico em células raras circulantes usando um sistema de isolamento celular e PCR digital por gotículas

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para ilustrar o isolamento de células cancerígenas raras a partir de uma amostra artificial contendo sangue total e com células de câncer de pulmão com picos. O protocolo utiliza uma plataforma de isolamento de células semi-automatizada e sem rótulos. Células enriquecidas são posteriormente analisadas para mutações nos receptores do fator de crescimento epidérmico usando PCR digital de gotículas.

Resumo

Mutações encontradas no gene do fator de crescimento epidérmico (EGFR) são fundamentais para determinar os tratamentos mais eficazes para pacientes com câncer de pulmão. Testes de rotina para mutações no EGFR podem assumir a forma de biópsias tumorais ou análise de ctDNA do plasma de pacientes com câncer de pulmão. Embora o teste de amostras de sangue de pacientes com câncer de pulmão seja realizado rotineiramente para fornecer informações sobre a presença ou recorrência do câncer de pulmão, por meio da detecção de ctDNA ou CTC, normalmente não envolve a análise molecular subsequente das células capturadas. A detecção de mutações individuais no gene EGFR presentes em células tumorais raras circulantes (CTCs) pode oferecer insights adicionais sobre a eficácia potencial das terapias direcionadas e, além disso, sobre o prognóstico do paciente, especialmente em câncer de pulmão não de pequenas células (NSCLC). Infelizmente, a raridade dessas células tumorais circulantes e a falta de procedimentos otimizados para interrogar suas informações genômicas representam um desafio significativo para a detecção.

O objetivo deste protocolo é ilustrar o potencial realista de capturar CTCs do sangue total e avaliar seu conteúdo molecular usando ddPCR. Uma plataforma semi-automatizada de isolamento celular baseada em tamanho foi usada para capturar células tumorais circulantes, que foram posteriormente recuperadas para análise molecular posterior. Para determinar a presença de mutações específicas de EGFR no DNA genômico das células capturadas, foi realizada a ddPCR utilizando ensaios para EGFR pT790M e EGFR pL858R.

Duas linhas celulares separadas de câncer de pulmão (A549 e H1975) foram ativamente enriquecidas a partir de sangue total e a quantificação precisa das mutações presentes nas linhas celulares H1975 foi realizada usando ddPCR.

Introdução

Com a contínua pesquisa translacional sobre o valor das biópsias líquidas e publicações recentes ilustrando especificamente o valor clínico do monitoramento por ctDNA na seleção^{terapêutica 1} , as biópsias líquidas estão amadurecendo. As biópsias líquidas oferecem um método alternativo e menos invasivo para monitoramento e prognóstico do câncer em comparação com os métodos convencionais de biópsia de tecido. Pesquisas extensas têm se concentrado no DNA fragmentado encontrado no sangue (DNA livre de células, cfDNA), e especificamente no subcompartimento derivado do tumor, conhecido como DNA tumoral circulante (ctDNA). O ctDNA tem sido amplamente estudado nas últimas duas décadas e demonstrou conter mutações genéticas específicas do tumor, por exemplo, SNVs e variantes estruturais, além de marcadores de metilação e um padrão distinto de fragmentos quando comparado ao cfDNA não tumoral. Essas características específicas do ctDNA agora são utilizadas para monitorar o status molecular dos pacientes com câncer durante a detecção precoce, resposta terapêutica, doença residual mínima (DRM) e resistência ao status terapêutico. De forma semelhante, células tumorais circulantes (CTCs), destacadas do local tumoral primário para vasos sanguíneos, evoluíram recentemente como biomarcadores promissores cuja existência e quantidade no sangue mostraram uma correlação próxima com a progressão da doença e o potencial de recidiva. Embora os primeiros estudos iniciais sobre CTCs tenham se baseado principalmente na expressão e enumeração de marcadores^{proteicos 2}, houve avanços significativos no estudo dos CTCs em nível molecular, incluindo a detecção de mutações genômicas no receptor de estrogênio 1 (ESR1) para câncer de mama e no gene do fator de crescimento epidérmico (EGFR) para vários tipos de câncer.

As mutações do EGFR são fundamentais tanto para a determinação da patogênese e prognóstico, quanto para decidir os tratamentos mais eficazes para pacientes com câncer de^{pulmão 3}. Testes rotineiros para mutações no EGFR podem ser feitos por biópsias sólidas de tumor no diagnóstico ou progressão ou, mais recentemente, amostragem de ctDNA do plasma de pacientes com câncer de pulmão recaído/^{refratário 4}. No entanto, ao contrário das abordagens baseadas em ctDNA, a análise de material genômico derivado do CTC permite a avaliação direta de células tumorais intactas e seus perfis mutacionais. Juntamente com estudos com ctDNA MRD, a detecção de mutações dentro do gene EGFR de CTCs raros pode fornecer uma compreensão adicional sobre a potencial eficácia dos regimes de tratamento e, além disso, sobre o prognóstico do paciente, especialmente em câncer de pulmão não de pequenas células (NSCLC). A raridade dos CTCs e a falta de protocolos simplificados que utilizem instrumentos amigáveis para clínicas constituem um sério obstáculo para uma adoção mais ampla. Essa limitação destaca a necessidade de um fluxo de trabalho padronizado e acessível que permita tanto o isolamento eficiente do CTC quanto a análise molecular a jusante. Portanto, o objetivo deste estudo é apresentar um fluxo de trabalho reprodutível para o enriquecimento de células tumorais circulantes e a subsequente detecção de mutações no EGFR, utilizando uma abordagem combinada de isolamento celular e PCR digital.

O Sistema de Isolamento de Células Genesis com lâminas microfluídicas de captura celular pode capturar CTCs em um processo semi-automatizado com alta viabilidade e alta eficiência de captura, baseado em seu tamanho maior e reduzida deformabilidade em comparação com a população primária de glóbulos brancos e^{vermelhos 5,6}. CTCs capturados podem então ser recuperados das lâminas de captura celular microfluídicas por fluxo reverso para fora da lâmina para análises genômicas posteriores. Para determinar a presença de mutações específicas do EGFR no DNA genômico das células capturadas, foi realizada a ddPCR em DNA genômico derivado do CTC usando ensaios para EGFR T790M e L858R.

Esse protocolo, utilizando uma amostra modelo de CTC e ensaios ddPCR comercialmente disponíveis, foi projetado para exemplificar um ponto de entrada para a detecção direcionada de mutações associadas ao câncer em CTCs. Esse protocolo oferece uma abordagem prática para detectar mutações associadas ao câncer em células tumorais circulantes e pode apoiar pesquisas adicionais em aplicações de biópsias líquidas.

Protocolo

Declaração ética:

Amostras de sangue foram obtidas de fontes autorizadas para uso em pesquisa, e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os doadores antes da coleta da amostra. Todos os protocolos experimentais envolvendo amostras de sangue humano foram revisados e aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional de um fornecedor de sangue, a Discovery Life Sciences (Alabama, EUA). Todos os procedimentos envolvendo amostras de sangue humano foram realizados de acordo com os padrões éticos do comitê institucional de pesquisa e com a Declaração de Helsinque.

1. Enriquecimento de células cancerígenas usando sistema semi-automatizado de isolamento celular

Nota: Esta seção descreve o enriquecimento das células tumorais circulantes (CTCs) usando uma plataforma semi-automatizada de isolamento celular, seguida pela detecção de mutações em EGFR por PCR digital de gotículas. Uma amostra modelo de CTC é usada para demonstrar a viabilidade, e a validação do ensaio é recomendada antes da aplicação clínica. Duas linhagens celulares de câncer de pulmão não de pequenas células (NSCLC) foram usadas: NCI-H1975 (mutações EGFR L858R/T790M) e A549 (tipo selvagem EGFR), que serviram como controle negativo para a detecção de mutações.

1. Amostra de Sangue
   1. Garanta que o consentimento informado seja obtido dos doadores de sangue/pacientes antes da coleta de sangue. Obter aprovação do Conselho de Revisão Institucional (IRB), quando necessário, para pesquisas envolvendo espéramos humanos, incluindo sangue.
   2. Para testes de viabilidade, obtenha uma amostra de sangue de um fornecedor externo autorizado apenas para uso em pesquisa.
   3. Colete sangue periférico em tubos de ácido etilenediaminêmico (EDTA) e processe a amostra pelo protocolo de enriquecimento Genesis em até 48 horas.
      Observação. Para análise a jusante e protocolo de enriquecimento Genesis, válvulas EDTA são recomendadas. Streck e tubo EDTA podem ser usados para imunocoloração em lâmina com protocolos de Enumeração Gênesis (direta/indireta).
   4. Armazene amostras de sangue coletadas em tubos EDTA a 2–8 °C até o uso. Para isolamento de células Genesis, não é necessário pré-tratamento e pode ser usado sangue total de até 10 mL para o protocolo de enriquecimento.
2. Amostra Modelo CTC/Preparação de Amostra Clínica
   1. Prepare uma solução de estoque celular em concentração de 100–1.000 células em meio de cultura celular apropriado de 10 μL ou em um tampão de soro salino tamponado com fosfato (PBS). Pule essa etapa se amostras clínicas estiverem em uso.
      NOTA: As concentrações de pico utilizadas neste estudo são maiores do que os níveis clínicos tipicamente observados de CTC e são destinadas apenas para fins de demonstração de métodos.
   2. Adicione os 10 μL da solução de estoque celular em até 10 mL de sangue total de um doador saudável para preparar uma amostra modelo de CTC. Para amostras clínicas, não inclua células cancerígenas nas amostras de sangue total dos pacientes.
   3. Misture a amostra de sangue com um volume igual de PBS (1x) e agite suavemente em um balanço de sangue em temperatura ambiente até o uso. Se o armazenamento exceder uma hora, armazene a 4 °C.
3. Enriquecimento CTC
   1. Ligue o Sistema de Isolamento de Células Genesis e espere o sistema ser inicializado. Isso pode levar até 5 minutos.
   2. Coloque o pote de resíduos na posição na base dos compartimentos da estação e prenda o tubo do pote de resíduos ao recipiente de lixo.
   3. Pressione o tubo na válvula de pressão até sentir que ele encaixa no lugar e conecte o tubo do Sistema Genesis na saída do pote de lixo.
   4. Execute um Auto-Teste pressionando "iniciar" na tela inicial e tocando no 'Auto-Teste' na tela.
   5. Quando o Autoteste estiver concluído, selecione '2.0 Kit Enrichment' nas opções selecionadas do protocolo.
   6. Siga as instruções na tela, preencha os campos de entrada de dados necessários e conclua o procedimento de Primer e Montagem. A primagem bem-sucedida usando etanol 70% e PBS 1x proporciona o melhor desempenho de captura celular e recuperação para a extração de DNA. A preparação leva cerca de 20 minutos para ser concluída.
   7. Certifique-se de que o programa correto de enriquecimento (2.0 Kit Enrichment) esteja selecionado e que todas as conexões e posicionamentos dos slides dos tubos estejam devidamente fixados antes de iniciar a execução. Evite introduzir bolhas de ar durante a carga da amostra, pois isso pode afetar a consistência do fluxo e a eficiência da captura.
   8. Dispense delicadamente a amostra do modelo preparada a partir do Passo 1.2.3 (Amostra CTC Modelo/Preparação da Amostra Clínica) no funil de entrada e continue o protocolo de Enriquecimento pressionando 'Retomar' na tela do sistema.
   9. Quando a captura do CTC é concluída, o sistema semi-automatizado de isolamento de células solicitará ao usuário que remova o pote de resíduos e reconecte o reservatório de priming.
   10. Desconecte o tubo do Sistema Genesis do pote de resíduos e pipote 4 mL de tampão de diluição para o reservatório de priming.
   11. Conecte o adaptador de refluxo ao reservatório de priming e reconecte ao tubo do Sistema Genesis. Pressione Retomar na tela para continuar o protocolo de Enriquecimento. Isso libera as células capturadas no slide microfluídico para o funil de entrada aplicando o retorno.
   12. Colete as células recuperadas pipetando do funil de entrada para um tubo Eppendorf de 5,0 mL. Certifique-se de coletar todas as amostras aquosas no funil de entrada, que frequentemente podem ultrapassar 4 mL.
   13. Centrifuge a amostra recuperada a 600 g por 5 minutos para pelletar as células capturadas antes da lise celular.
   14. Remova cuidadosamente o sobrenadante e prossiga para o protocolo de extração de DNA (Seção 1.4).
4. Extração de DNA
   Atenção: O DNAzol BD é prejudicial se entrar em contato com a pele ou for ingerido. Evite contato com pele e olhos. Use apenas em ambientes de exaustores químicos e não respire névoa/vapor/spray. Em caso de contato com a pele, lave imediatamente com água.
   1. Adicione 1 mL de DNAzol BD diretamente no tubo a partir do Passo 1.3.14.
   2. Transfira todo o volume da amostra para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL de DNA Eppendorf LoBind e agite vigorosamente.
   3. Incube o tubo em temperatura ambiente por 5 minutos. Faça vórtice vigorosamente no tubo e incube em temperatura ambiente por pelo menos 4 minutos.
   4. Garanta a mistura completa durante as etapas de lise e precipitação para maximizar a recuperação do DNA. O tratamento opcional com RNase pode ser incluído se a contaminação por RNA for uma preocupação.
   5. Adicione 400 μL de isopropanol diretamente à mistura de amostra de lisado de células BD de DNAzol.
   6. Centrifuge o tubo a 10.000 g por 6 minutos para precipitar o DNA.
   7. Após a centrifugação, remova o sobrenadante e adicione suavemente 0,5 mL de DNAzol BD ao DNA em pellets.
   8. Faça vórtice no tubo até que a pastilha de DNA esteja completamente dispersa.
   9. Centrifuge a mistura a 10.000 g por 5 minutos.
   10. Remova o sobrenadante e lave a pastilha de DNA pipetando 1 mL de etanol a 75%.
   11. Repita os passos 9–10 para um total de duas lavagens.
   12. Remova qualquer etanol residual no fundo do tubo usando uma micropipeta.
       NOTA: Certifique-se de que o pellet não fique completamente seco.
   13. Adicione 20 μL de água deionizada (DI) livre de DNase-/RNase para solubilizar o DNA das amostras de CTC.
   14. Quantifique o DNA de fita dupla (dsDNA) na amostra usando kits de quantificação de dsDNA, como o Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit ou o Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis.
   15. Armazene as amostras de DNA extraídas a 4 °C ou -20 °C para evitar a degradação.
       Ponto de Pausa: As amostras de DNA extraídas podem ser armazenadas a -20 °C para armazenamento de curto prazo ou a -80 °C para armazenamento de longo prazo antes de prosseguirem para análises posteriores.

2. Análise de mutações EGFR usando ddPCR

A PCR digital é um método adequado para detectar mutações raras com alta sensibilidade e precisão. Os ensaios de detecção de mutação dddPCR fornecidos em um único tubo normalmente incluem uma sonda marcada com FAM direcionada a um alelo mutante e uma segunda sonda rotulada com HEX direcionada a um alelo do tipo selvagem.

1. Configuração da reação e geração de gotículas
   1. Descongelação ddPCR Supermix, ddPCR Ensaios de Detecção de Mutação em gelo.
   2. Faça vórtice em cada tubo para garantir que o conteúdo seja homogêneo, pois pode se formar um gradiente de concentração durante o armazenamento a -20 °C.
   3. Centrifuge brevemente para sedimentar o conteúdo no fundo do tubo e coloque-o sobre o gelo.
   4. Prepare amostras de DNA extraídas na concentração desejada antes de preparar a mistura de reação conforme a receita da Tabela 1.
   5. Faça uma pré-mistura contendo supermistura, ensaios e enzimas de restrição, além de água para todas as amostras necessárias para teste, e adicione o DNA da amostra individualmente como último componente da reação. Certifique-se de que a concentração final das amostras de DNA seja de 50 fg a 100 ng.
      Nota: A fragmentação do DNA por digestão de restrição antes da geração de gotículas é recomendada para melhorar a precisão, reduzir a viscosidade e melhorar o acesso ao molde. Recomenda-se a digestão direta usando 2–5 U de enzima de restrição durante a configuração da ddPCR. Para ensaios de mutação pontual EGFR (T790M/L858R), recomenda-se MseI; consulte as fichas de dados do ensaio para enzimas compatíveis antes de personalização. Fichas de dados estão disponíveis para download para ensaios individuais no portal de ensaios digitais Bio-Rad (Bio-Rad Droplet Digital PCR Assaysings | Início)
   6. Prepare um controle negativo para pelo menos um poço, contendo apenas molde do tipo selvagem em concentração semelhante à concentração de amostras desconhecidas.
   7. Faça vórtice nos tubos de reação para misturar completamente e centrifuge brevemente para sedimentar todas as amostras no fundo de cada tubo de reação. Deixe os tubos de reação se equilibrarem em temperatura ambiente por 2 minutos.
   8. Carregue 20 μL de cada mistura de reação em um poço de amostra de um cartucho microfluídico (Cartucho DG8), seguido por 75 μL de óleo de geração de gotículas para sondas nos poços de petróleo.
   9. Cubra o cartucho com uma junta e coloque-o no Gerador de Gotículas QX200.
   10. Pressione o botão no topo do Gerador de Gotículas para fechar a tampa. Quando a tampa é fechada, a geração de gotículas começa automaticamente. Esse procedimento combina as amostras e o óleo nos microcanais do cartucho microfluídico para criar uma emulsão de ~20.000 gotículas do tamanho de nanolitros para cada amostra.
2. Amplificação por PCR (condições de ciclo térmico)
   1. Programe as condições de ciclo térmico em um ciclador térmico conforme recomendado na Tabela 2
   2. Quando a geração de gotas é concluída, todas as luzes do instrumento ficam verde-fixas. Abra o instrumento pressionando novamente o botão do Gerador de Gotículas e remova o suporte do cartucho e o cartucho.
   3. Remova a junta descartável e aspire 45 μL de gotículas do cartucho, tomando cuidado para garantir um leve ângulo na ponta da pipeta para evitar o rasgamento das gotículas.
   4. Dispense gotas nas placas ddPCR de 96 poços e sele a placa com a vedação térmica da placa PCR usando o selador de placas PCR PX1.
   5. Após selar a placa de 96 poços contendo as gotas, transfira cuidadosamente a placa de 96 poços para o ciclador térmico preparado na Etapa 2.2.1 e inicie o ciclo térmico.
3. Leitura de gotículas e análise de dados
   1. Inicie o instrumento ddPCR Droplet Reader (QX200 Droplet Reader ou QX600 Droplet Reader) e um computador conectado onde o QX Manager Software está instalado e configurado.
   2. Após a etapa de ciclo térmico concluída, mova a placa selada de 96 poços para um instrumento Leitor de Gotas.
   3. Open QX Manager Software para configurar um novo layout de placas baseado em projeto experimental. Clique na aba 'Adicionar Placa' e o software ativará o botão Configurar Placa. Clique em 'Configurar Placa' para atribuir detalhes da amostra à placa.
   4. Preencha os detalhes da placa e das informações do poço, selecione os poços, designe a condição da amostra, tipo de experimento, nome(s) alvo(s), tipo(s) de alvo(s) e referência: ch1 para FAM e ch2 para cor HEX.
   5. Clique em 'Aplicar' para carregar o poço e, quando terminar, selecione 'OK'.
   6. Quando o layout da placa estiver completo para todas as amostras, selecione 'Executar' para iniciar o processo de leitura de gotas.
   7. Após a coleta dos dados, selecione amostras no seletor de poços sob 'Analisar' e defina o limiar apropriado para o Ensaio de Detecção de Mutações ddPCR para distinguir sinais mutantes de selvagem.
   8. Para ensaios de mutação duplex como os usados neste protocolo, os limiares podem ser definidos automaticamente usando as configurações padrão do software do gerenciador QX (referência à figura nos resultados).
   9. Alternativamente, os limiares podem ser definidos manualmente usando os métodos de mira ou laço, garantindo que limiares ou limites de laço separem agrupamentos positivos e negativos e sejam posicionados com base nas localizações dos agrupamentos definidas tanto pelos controles positivos quanto negativos incluídos em cada execução.
      NOTA: Os limiares devem ser estabelecidos de forma consistente entre amostras dentro de um lote, usando controles positivos e negativos, para garantir a chamada reprodutível da mutação.
   10. A concentração reportada é o número de cópias por μL da reação final 1x ddPCR.

Resultados

O sistema de isolamento celular Genesis com lâminas microfluídicas de captura celular isolou em média 84% das células cancerígenas com picos em amostras de sangue a uma concentração de 25–250 células·^mL-1 (Figura 3A). Essa alta eficiência de captura demonstra a eficácia da etapa de enriquecimento para isolar células tumorais raras circulantes de amostras de sangue total. A imunocoloração opcional de células capturadas em lâminas microfluídicas de captura celular usando o protocolo de enumeração do sistema demonstrou identificação celular rara usando dois anticorpos positivos contra citoceratina, DAPI para identificar células nucleadas e um anticorpo negativo contra CD45, que é expresso na maioria dos glóbulos brancos, mas normalmente não é expresso em CTCs (Figura 3B). Esse padrão de coloração confirma a identificação bem-sucedida das células tumorais circulantes, excluindo os glóbulos brancos de fundo.

Ensaios de detecção de mutações ddPCR permitiram a identificação e o perfil de mutações EGFR em células cancerígenas enriquecidas. Este estudo demonstrou a detecção de mutações de gDNA em células, inicialmente enriquecidas pela plataforma Genesis, usando ddPCR e Ensaios de Detecção de Mutações. Os gráficos ddPCR (Figura 4) das linhas celulares cancerígenas A549 (tipo selvagem EGFR) e H1975 (L858R/T790M) para as duas mutações EGFR testadas mostraram que a ddPCR pode detectar sensibilmente mutações presentes na linhagem celular H1975 após disparar para o sangue total e o subsequente enriquecimento via plataforma Genesis. Sinais positivos de mutação foram observados em células H1975, enquanto nenhum sinal de mutação foi detectado em células A549, confirmando a especificidade do ensaio. As amostras adulteradas com a linha celular controle A549 não apresentaram mutação, confirmando que a detecção de mutações em L858R e T790M está especificamente associada à linhagem celular H1975. Essa demonstração do isolamento de CTC na plataforma Genesis, seguida de análise molecular utilizando ddPCR, pode oferecer uma poderosa ferramenta diagnóstica molecular para estudos de biópsia líquida e estudos pré-clínicos usando amostras clínicas para monitorar a progressão da doença e tratamentos personalizados. No geral, esses resultados demonstram que o fluxo de trabalho combinado de enriquecimento e ddPCR pode detectar e quantificar de forma confiável mutações no EGFR em células tumorais circulantes.

Figura 1: Fluxo de trabalho de biópsia líquida para perfilar mutações de DNA EGFR em câncer de pulmão. (A) Ilustração da heterogeneidade tumoral mostrando diferentes perfis de mutação EGFR detectados usando biópsia de tecido convencional e células tumorais circulantes (CTCs) a partir de biópsias líquidas. (B) Fluxo de trabalho esquemático para o perfil de mutações de DNA do EGFR em células tumorais circulantes usando biópsia líquida. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Demonstração do perfil de mutação do DNA do EGFR usando amostras artificiais. (A) Preparação de uma amostra modelo de CTC por meio do spiking de linhagens celulares de câncer de pulmão com status definido de mutação EGFR em sangue total de um doador saudável. (B) Fluxo de trabalho ilustrando a detecção de mutações de DNA do EGFR em células tumorais circulantes usando plataformas comercialmente disponíveis. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Isolamento sem marcação e identificação de células tumorais circulantes. (A) Eficiência de captura de linhagens celulares de câncer de pulmão (A549 e H1975) disparadas em amostras de sangue total de doadores saudáveis usando uma plataforma semi-automatizada de isolamento de células raras. (B) Imunocoloração de células capturadas mostrando células tumorais positivas à citoceratina. Barra da escala = 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Perfil de mutação EGFR usando PCR digital baseado em gotículas. Gráficos de amplitude bidimensional mostrando a detecção de mutações de EGFR em células cancerígenas enriquecidas após lise celular e extração de DNA. As células A549 (tipo selvagem) apresentam ausência de sinais específicos de mutação, enquanto as células H1975 exibem sinais positivos para mutações EGFR L858R e T790M. O ensaio permite a detecção e quantificação sensíveis de populações de DNA mutante e selvagem. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Componente	Volume por reação (μl)	Concentração final
2x ddPCR Supermix para Sondas (sem dUTP)	10	1x
Primers/sondas 20x target (FAM) e wild-type (HEX)	1	1x
Enzima de restrição, diluída (Msel)	1	2-5 U/reaction
Amostra-alvo e/ou água livre de DNase (NTA)	Variável	Variável
Volume total	20	-

Tabela 1: Configuração da reação para detecção de mutações por PCR digital baseada em gotículas. Composição e concentrações finais dos reagentes usados para detectar mutações raras do EGFR em amostras de DNA derivadas de células cancerígenas.

Etapa do ciclo térmico*	Temperatura	Tempo	Taxa de Rampa	Número de ciclos
	(ºC)		(ºC/s)
Ativação enzimática	95	10 min	2	1
Desnaturação	94	30 segundos	2	40
Recozimento/extensão	55	1 min	2	40
Desativação enzimática	98	10 min	2	1
Resfriamento	4	30 min	2	1
Segurar (opcional)	4	∞ (infinito)	1	1
Use uma tampa aquecida ajustada para 105ºC e ajuste o volume da amostra para 40μl para o C1000 Touch Thermal Cycler com o Módulo de Reação de Poço de 96 Profundidades.

Tabela 2: Condições de ciclo térmico para amplificação digital de PCR. Parâmetros de ciclo térmico usados para amplificação de alvos de mutação EGFR usando um ciclador térmico com módulo de reação de 96 poços.

Discussão

A presença de células tumorais circulantes no sangue de pacientes com tumores sólidos tem sido um tema de investigação por mais de 60 anos⁷ e foi reconhecida como biópsia líquida primária desde antes de sua primeira inclusão no termo coletivo em 2010^. No entanto, CTCs são raros e difíceis de isolar seletivamente do sangue^{total 9}. No entanto, existem inúmeros métodos para capturar e enriquecer CTCs, como ilustrado pelas seguintes revisões^10,11, abrangendo abordagens físicas/microfluídicas, bem como métodos de seleção de marcadores na superfície celular. Muitos desses métodos são demorados, trabalhosos e frequentemente envolvem múltiplas etapas/sistemas para alcançar a seletividade exigida.

A captura de CTCs do sangue total neste protocolo depende de seu tamanho (> 8 μm) e da ausência de deformidade no fundo dos glóbulos vermelhos e brancos fenotipicamente normais que passam pelos poros microfluídicos dentro das lâminas de captura celular microfluídica. Portanto, a carga correta da amostra, o primer adequado da lâmina e a prevenção de entupimentos são passos críticos para manter a eficiência da captura e a recuperação da amostra.

Para que o fluxo de trabalho seja bem-sucedido, o gerenciamento das amostras de sangue é o fator-chave; garantir que sangue fresco seja utilizado para o processamento da amostra e manter as condições corretas de transporte e armazenamento para prevenir hemólise. A degradação dos glóbulos vermelhos ou glóbulos brancos impactará, respectivamente, a qualidade da captura do CTC e a sensibilidade da detecção de quaisquer variantes genômicas raras. Se houver hemólise, coagulação ou degradação visível da amostra, a amostra não deve ser processada, pois essas condições podem reduzir a recuperação do CTC e a sensibilidade à detecção de mutações a jusante.

Como as CTCs podem estar presentes em níveis inferiores a 1 CTC por 10 milhões de glóbulos brancos no sangue total, é essencial capturar o maior volume permitido para o enriquecimento. As lâminas de captura celular microfluídica podem acomodar 10 mL de sangue em linha com tubos padrão de captura de sangue, como Streck e EDTA, que normalmente armazenam ~7,5–10 mL de sangue. A redução do volume sanguíneo coletado impactará diretamente a sensibilidade à captura do CTC e a subsequente detecção de variantes genômicas. Obter volumes além dessa rotina a partir de pacientes em tratamento pode ser desafiador tanto clinicamente quanto eticamente. Além de aumentar o volume em mais de 10ml ou utilizar amostras de leucaferese diagnóstica para aumentar as populações de glóbulos brancos/^{CTC em 12}, aumentar a sensibilidade com volumes maiores está além do escopo da plataforma Genesis atualmente.

O protocolo foi executado conforme descrito na SOP padrão, mas com cuidado para garantir a coleta de sangue fresco, mistura abrangente de EDTA com sangue na coleta e armazenamento cuidadoso do sangue coletado antes do uso, ilustrando o potencial desse protocolo para ser utilizado em um ambiente clínico onde procedimentos operacionais padrão rotineiros são valorizados. No entanto, como esse protocolo foi demonstrado usando amostras artificiais, é necessária validação com amostras clínicas de pacientes antes da implementação clínica rotineira.

A sensibilidade na detecção de mutações dentro de uma população de CTC depende tanto da presença de CTCs em uma amostra padrão de sangue total quanto da subsequente detecção de mutações somáticas dentro dessa população de CTC, que depende da frequência da mutação na subpopulação de CTC. Esses dois fatores de confusão limitarão, em última análise, a sensibilidade geral na detecção de mutações em uma população capturada de CTC; tendo maior impacto em amostras de detecção precoce, em comparação com amostras em estágio tardio, que provavelmente apresentam maior contagem de CTC e populações de CTC com mutações mais elevadas.

Estudos atuais de biópsia líquida baseada em sangue são fortemente tendenciosos para DNA tumoral circulante presente no plasma como indicação da presença tumoral. Normalmente, a detecção do ctDNA baseia-se na presença de marcadores genômicos específicos do tumor, como SNVs, variantes estruturais, MSI-H, TMB e CGP. CTCs, como biomarcador menos utilizado e igualmente viável em biópsias líquidas, são conhecidos por libertar na corrente sanguínea devido ao crescimento e potencialmente metástases^{de tumores.} A análise dos CTCs é focada principalmente nos marcadores da superfície celular usados para sua captura ou validação pós-captura, utilizando painéis de anticorpos estabelecidos ou personalizados, por exemplo, pan-Citoqueratina, Vimentina, PD-L1, EpCAM, etc. Em contraste, a análise molecular das CTCs é limitada em adoção devido aos desafios de enriquecer e capturar seletivamente as CTCs do sangue total, seguidas por uma análise precisa da subpopulação das CTCs. O método atual utiliza um fluxo de trabalho padronizado que incorpora protocolos estabelecidos para captura de CTC, seguido de análise molecular usando ddPCR com ensaios prontos para mutações genômicas patologicamente relevantes conhecidas em amostras de sangue total artificiais. Essa abordagem é significativa porque permite o perfilamento de mutações diretamente a partir de CTCs enriquecidos, complementando as abordagens de biópsia líquida baseadas em ctDNA plasmático.

Utilizando a abordagem atual, CTCs raros capturados podem ser investigados tanto por sua presença no sangue total quanto pela presença de marcadores genômicos patologicamente relevantes na população de CTC. Estudos demonstraram o valor de avaliar tanto o perfil de ctDNA de pacientes com câncer quanto o reservatório CTC circulando em paralelo ao^{ctDNA 13}, com a avaliação de ambas as fontes de mutações expandindo o cenário molecular geral de pacientes individuais. Isso tem potencial para o desenvolvimento de paradigmas de testes de patologia dentro do escopo da pesquisa translacional inicialmente, mas, em última análise, em um ambiente clínico. O novo paradigma incorporaria tanto a presença de CTC como indicação de presença/progressão do câncer quanto mutações patológicas presentes nas células capturadas por CTC, potencialmente indicando expansão clonal ou resistência^{terapêutica 14}. A implicação disso é que o desenvolvimento de metástase e expansão clonal, seguido por resistência subsequente a medicamentos, poderia ser monitorado tanto no nível de ctDNA quanto no nível de CTC em conjunto, impactando diretamente a escolha da terapia em estágios avançados do câncer.

Aplicações futuras podem incluir a adaptação desse fluxo de trabalho a mutações adicionais associadas ao câncer e o teste de seu desempenho em amostras clínicas longitudinais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Instrument (Referido como "Sistema semiautomatizado de isolamento de células")
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Instrumento
QX200 Droplet Reader ou QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 ou 12013328	Instrumento (Referido como "Instrumento Droplet Reader")
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Instrumento
C1000 Touch Thermal Cycler com Módulo de Reação de Poço Profundo 96	Bio-Rad Laboratories	1851197	Instrumento
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Instrumento
Celselect Slides			Consumível (Referido como Microfluidic Cell Capture Slides)
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Consumível
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Reagente
Enzima de restrição MseI	New England Biolabs	R0525S	Reagente
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	Ensaio
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	Ensaio
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q33230	Kit de ensaio
Cartuchos DG8 para QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Consumível
Óleo de Geração de Droplet para Probes	Bio-Rad Laboratories	1863005	Consumível
Óleo de Geração de Droplet Automatizada para Probes	Bio-Rad Laboratories	1864110	Consumível (opcional)
ddPCR Supermix para Probes (Sem dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Reagente
PCR Plate Heat Seal	Bio-Rad Laboratories	1814040	Fechamento de folha perfurável
Tubo de microcentrífuga DNA LoBind, 1,5 ml	Eppendorf	022431021	Consumível
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories	12001925	Consumível