Method Article

Método de Co-cultura Tridimensional para o Estudo de Interações Indiretas entre Diferentes Tipos Celulares ao Longo de uma Membrana Basal Reconstituída

DOI:

10.3791/70027

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April 17th, 2026

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1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, 2Beatrice Hunter Cancer Research Institute, 3Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional & University Research Institute for Health Sciences (IUNICS), Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa) & University of the Balearic Islands, 4Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03), Instituto Salud Carlos III, 5Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

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Este artigo detalha um método simples para a co-cultura tridimensional de dois tipos celulares separados por uma membrana basal reconstituída que requer pouco equipamento especializado e pode ser facilmente analisada por diversas técnicas experimentais.

Abstract

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A cocultura tridimensional (3D) é uma técnica em rápida evolução para pesquisadores que buscam estudar com precisão as interações célula-célula usando experimentos in vitro . As limitações da cultura celular em monocamadas, incluindo interações limitadas entre o ambiente celular e extracelular e a morfologia celular perturbada, são abordadas simulando o ambiente celular in vivo . Utilizando um andaime para fornecer suporte estrutural e incluindo componentes da matriz extracelular biologicamente ativa, culturas 3D apresentam comportamentos e morfologias mais congruentes com o tecido. Incorporar múltiplos tipos celulares nesse tipo de ambiente 3D permite o estudo das interações célula-célula dentro de um sistema modelo biomimético. Uma ampla gama de tecnologias de co-cultura 3D surgiu, cada uma com suas próprias vantagens e desafios. Frequentemente, essas tecnologias exigem equipamentos especializados, uma configuração complexa ou conhecimento técnico específico. Além disso, existem alguns métodos padronizados para estudar interações indiretas entre células entre dois tipos celulares separados por uma membrana basal reconstituída. Aqui, descrevemos um método de co-cultura 3D que requer apenas habilidades técnicas fundamentais e utiliza materiais mais amplamente aplicáveis para recapitular com sucesso interações indiretas célula-célula através de uma membrana basal. Uma monocamada de células é coberta por uma camada de matriz extracelular, na forma de Matrigel, e um segundo tipo celular é semeado por cima. A cocultura resultante é mantida por cinco dias, momento em que as células são analisadas quanto a alterações morfológicas por imunofluorescência ou extraídas da cocultura para análises genômicas, transcriptômicas ou proteômicas mais detalhadas. Esse protocolo é ideal para estudar o impacto da comunicação célula-célula no comportamento celular quando o contato físico é proibido por uma membrana basal. À medida que os pesquisadores continuam a optar por métodos de cultura celular mais relevantes para o in vivo , uma abordagem simplificada é necessária para evitar altas barreiras de entrada.

Introduction

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A cultura celular in vitro é uma técnica de pesquisa robusta, rápida e amplamente utilizada. Embora os métodos tradicionais de cultura celular sejam poderosos, eles diferem muito de um ambiente in vivo. A natureza espacialmente restrita da cultura celular monocamada leva a mudanças na expressão gênica, morfologia e bioquímica 1,2,3. Técnicas de cultura tridimensional (3D) abordam essa disparidade, pois as células são cultivadas em um andaime que simula a matriz extracelular (MEC) presente em órgãos e tecidos. Em cultura 3D, as células apresentam morfologia e comportamento mais parecidos com os observados in vivo 4,5 No entanto, a cultura 3D sozinha não recapitula totalmente os muitos componentes de um microambiente in vivo porque carece de contribuições de outros tiposcelulares 6.

As interações diretas (contato entre células) e indiretas entre células desempenham um papel importante no comportamento das células in vivo 7,8. Recapitular essas interações requer modelos de co-cultura 3D, onde múltiplos tipos de células são cultivados juntos em um ambiente 3D. Usando essas técnicas, um ambiente de crescimento semelhante ao in vivo pode ser estabelecido in vitro, melhorando a relevância biológica dosresultados 9,10. No entanto, quanto mais específico for o ambiente exigido para um experimento específico, mais complexa se torna a metodologia. Há uma falta de um sistema modelo padronizado que possa ser usado para estudar interações célula-célula entre células separadas por uma matriz de membrana basal. Assim, esse protocolo foi projetado para simular interações célula-célula que ocorrem em uma matriz de membrana basal de maneira robusta e reprodutível. Adaptada de um modelo de cultura 3D previamenteestabelecido 11, a técnica utiliza uma camada de Matrigel, doravante chamada de gel ECM, para separar fisicamente dois tipos celulares diferentes em cultura, permitindo a passagem de fatores secretados. Originalmente, foi projetado para estudar o impacto indireto dos adipócitos nas células mesenquimais do câncer de mama, mas pode ser facilmente modificado para acomodar uma variedade de tipos celulares. Deve-se considerar cuidadosamente se esse método é apropriado para um determinado desenho experimental. Esse método não permite interação direta célula-célula e, portanto, deve ser limitado a modelar cenários in vivo que envolvam comunicação indireta entre células através de uma matriz de membrana basal. Por exemplo, esse sistema não seria ideal para modelar as interações entre células T citotóxicas e células tumorais, já que elas comumente interagem diretamente. Em vez disso, considere cenários biológicos em que uma membrana basal separa naturalmente os dois tipos celulares de interesse. Por exemplo, esse método pode ser aplicado ao estudo das interações entre células tumorais e células endoteliais vasculares antes da intravasação.

Um método alternativo comum de co-cultura 3D envolve o uso de chips microfluídicos especializados, ou "organ-on-a-chip (OoC)". Sistemas OoC são poderosos e podem ser adaptados para experimentos individuais, mas exigem tempo e recursos significativos dedicados ao design de chips, seleção de materiais, equipamentos periféricos, otimização e coletade dados 12,13. Além disso, atualmente não existe nenhum material ou método padrão que possa fornecer os sinais biológicos e físicos da matriz da membrana basal sem interferir no fluxomicrofluídico 14. Assim, aplicar a tecnologia OoC aos estudos das interações célula-célula através da membrana basal apresenta desafios adicionais. O método descrito neste protocolo busca oferecer uma alternativa padronizada que mantenha relevância e acessibilidade biológicas.

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Protocol

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Este protocolo (Figura 1A) descreve um sistema de co-cultura 3D projetado para recapitular as interações célula-célula através de uma matriz de membrana basal. A análise a jusante é possível usando microscopia confocal (Figura 1B) ou colheita células dentro da cocultura (Figura 1C). Ao usar uma construção em 'sanduíche', onde uma camada de gel de ECM é encaixada entre duas populações celulares, o protocolo não requer aparelhos especializados e pode ser realizado com conhecimento fundamental das técnicas modernas de cultura celular.

1. 3D Preparação da cocultura

NOTA: O protocolo descrito é uma aplicação representativa do método de co-cultura 3D usando adipócitos 3T3-L1 e células de câncer de mama MDA-MB-231. O uso de diferentes tipos celulares exigirá otimização da densidade de semeadura celular e pré-testes dos lotes de gel ECM para garantir a eficácia. Este protocolo aborda o uso de controle sem adipócitos e controle condicionado de mídia. Mais controles podem ser necessários dependendo do objetivo experimental.

  1. Cultura celular e preparação de soluções
    1. Adquirir e estabelecer culturas de linhas celulares de câncer de mama pré-adipócitos 3T3-L1 e MDA-MB-231. Cultivar e manter independentemente todas as células usando técnica asséptica em um gabinete de segurança biológica classe II e métodos padrão de cultura celularaderente 15. Manter células 3T3-L1 no Meio Águia Modificado (DMEM) da Dulbecco, suplementado com 10% (v/v) de Soro de Bezerro Neonatal (NBCS) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL). Manter as células MDA-MB-231 em RPMI 1640 suplementadas com 10% de Soro Bovino Fetal (FBS) e 1% de Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL).
      NOTA: Nunca permita que células 3T3-L1 ultrapassem 80% de confluência durante a manutenção, e não use culturas além do número da 20ª passagem.
    2. Adquirir ou preparar uma solução padrão de 1x soro salino tamponado com fosfato (PBS) com 137 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mMNa 2HPO 4, 1,8 mMKH 2PO4, pH 7,4.
    3. Prepare 50 mL de solução de lavagem de PBS-glicina adicionando 0,375 g de glicina a 50 mL de PBS para uma concentração final de glicina de 100 mM. Armazene a solução a 4 °C por até 12 meses.
    4. Prepare 10 mL de tampão de permeabilização adicionando 50 μL de Triton X-100 a 9,5 mL de PBS. Preencha até 10 mL para uma concentração final de 0,5% (v/v) do Triton X-100. Armazene a 4 °C e use em até 1 mês.
    5. Prepare 50 mL de tampão de imunofluorescência (IF) adicionando 50 μg de albumina sérica bovina (BSA), 100 μL de Triton X-100 e 25 μL de Tween-20 a 45 mL de PBS. Preencha até 50 mL para uma concentração final de 0,1% (v/v) BSA, 0,2% (v/v) Triton X-100 e 0,05% (v/v) Tween-20. Armazene a 4 °C e use em até 1 mês.
    6. Prepare 10 mL de tampão bloqueador adicionando 1 mL de soro animal a 9 mL de tampão de jejum intermitente para uma concentração final de 10% de soro. Armazene a 4 °C e use em até 1 mês.
      NOTA: A identidade da espécie do soro depende da espécie hospedeira dos anticorpos fluorescentes secundários usados (ver 2.2.4).
    7. Descongele o gel ECM (concentração total de proteína ~9-9,5 mg/mL) a 4 °C durante a noite. Prepare alíquotas de 500 μL em tubos microcentrífugas de 1,5 mL e armazene a -20 °C.
      NOTA: O gel de ECM é altamente variável e deve ser verificado para induzir o comportamento esperado em cada tipo celular. Diferentes tipos celulares podem exigir diferentes concentrações de proteínas ou rigidez da matriz.
      NOTA: Sempre use pontas e recipientes de pipeta pré-refrigerados ao manusear gel ECM para evitar polimerização em temperatura ambiente. Sempre mantenha o gel ECM no gelo durante o manuseio.
  2. Diferenciação de adipócitos
    1. Semeie de 50.000 a 80.000 pré-adipócitos 3T3-L1 em 0,5 mL de meio de crescimento padrão em 2 poços de uma lâmina de câmara de 4 poços. Os poços vazios serão usados para controles sem adipócitos e meios condicionados.
      NOTA: Culturas celulares de lâmina de câmara são propensas a perturbações mecânicas. Evite aspiração a vácuo do meio e utilize uma técnica suave de pipeteamento com pipetas manuais.
    2. Semeie de 50.000 a 80.000 pré-adipócitos 3T3-L1 em 0,5 mL de meio de crescimento padrão em um único poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços. Isso será usado para coletar mídia condicionada para o controle do meio condicionado.
    3. Permita que ambas as culturas atinjam 100% de confluência em 24 horas.
    4. Inicie a adipogênese substituindo o meio de crescimento por meio de iniciação da adipogênese, consistindo em DMEM suplementado com 10% de FBS, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) e 1 μM dexametasona. Incubar as células por 48 horas a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 .
    5. Após 48 horas, substitua o meio gasto por um novo meio de progressão da adipogênese, composto por DMEM com 10% de FBS e 10 μg/mL de insulina. Incubar as células por mais 48 horas a 37 °C em uma incubadora com 5% de CO2 .
    6. Antes de continuar com a cocultura 3D, confirme visualmente a presença de gotículas lipídicas em >60% das células. Se o acúmulo de gotículas lipídicas for lento, substitua o meio de progressão por DMEM suplementado com 10% de FBS e monitore o conteúdo lipídico a cada 24 horas.
  3. Sobreposição e manutenção da cocultura 3D
    1. Descongelar o gel ECM a 4 °C durante a noite antes de continuar com a sobreposição.
      NOTA: Para evitar efeitos de variabilidade de lote para lote, recomenda-se usar o mesmo lote de gel ECM para todos os experimentos dentro de um único estudo.
    2. Após a diferenciação bem-sucedida dos 3T3-L1s, remove-se o meio de cultura gasto, deixando um pequeno tampão de ~50 μL de meio.
    3. Adicione cuidadosamente 110 μL de gel ECM a cada poço contendo adipócitos da lâmina da câmara, tomando cuidado para não perturbar a monocamada de adipócitos.
      NOTA: O gel de ECM solidifica rapidamente em temperatura ambiente. Para evitar polimerização prematura da matriz, sempre mantenha o gel ECM no gelo e use pontas pré-resfriadas a -20°C.
    4. Adicione 110 μL de gel ECM ao poço vazio de controle sem adipócitos. Para garantir uma distribuição uniforme do Matrigel, adicione a gota nos cantos do poço e no meio do poço. Use a ponta da pipeta para espalhar suavemente o Matrigel sobre a superfície da cultura sem raspar.
    5. Incube a lâmina por 1h a 37 °C para permitir que o gel de ECM polimerize.
    6. Durante essa etapa de incubação, colete e conte as células MDA-MB-231
      OPCIONAL: Veja o passo 1.4 para detalhes sobre a marcação fluorescente dessas células.
    7. Prepare uma suspensão diluída de células MDA-MB-231 a 30.000 células/mL em meio de crescimento mamário contendo gel ECM (v/v) a 2%.
      NOTA: A densidade ideal de semeadura de células varia entre os tipos de célula e deve ser otimizada antes da experimentação. NOTA: O meio de crescimento mamário é um meio comercial de cultura celular otimizado para células epiteliais mamárias. Contém 0,4% de extrato de hipófise bovina, 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico (humano recombinante), 5 μg/mL de insulina (humana recombinante) e 0,5 μg/mL de hidrocortisona. O meio de cocultura deve ser escolhido cuidadosamente para atender às necessidades de ambos os tipos celulares.
    8. Uma vez que o gel ECM estiver polimerizado, adicione suavemente 450 μL de suspensão MDA-MB-231 a cada poço. Isso resulta em uma contagem total de células de 13.500 células/poço.
      NOTA: Uma sobreposição desigual da suspensão celular sobre o gel é uma possibilidade nesta etapa. Avalie visualmente os lados da câmara e toque suavemente em todos os lados para distribuir uniformemente.
    9. À cultura de adipócitos na placa de 24 poços, adicione 450 μL de meio de crescimento mamário contendo gel ECM (v/v) a 2%. Colhe e troque o substrato a cada 48 horas.
    10. Mantenha a co-cultura por no máximo 5 dias, com mudanças de mídia a cada 48 horas.
      NOTA: Evite aspiração a vácuo e use pipeteamento suave. O descolamento do gel ECM é um possível problema que pode surgir durante a manutenção da cocultura.
    11. Para o poço de controle de meio condicionado, o adipócito colhido diluído (do passo 1.3.9) condicionou o meio 1:1 com meio fresco antes de substituir o meio de cocultura gasto nos dias 2 e 4.
      NOTA: Neste ponto, o período de cocultura está encerrado e deve ser analisado seja fixando e corando as culturas para determinar morfologia e expressão dos marcadores (ver seção 2) ou extraindo células do ambiente de co-cultura e preparando células para análise a jusante (ver seção 3).
  4. Marcagem de células fluorescentes (Opcional)
    NOTA: A marcação das células sobrepostas pode ser realizada antes da etapa 1.3.7 para ajudar a identificar células sobrepostas durante a captura da imagem por imunofluorescência.
    1. Prepare uma solução de 5 mM de Succinimidil Éster de Diacetato de Carboxifluoresceína (CFSE) dissolvendo 10 mg de CFSE em 4,22 mL de DMSO. Armazene alíquotas de 500 μL a -20 °C, protegidas contra luz.
    2. Após contar as células a partir do passo 1.3.6, lave as células uma vez com 5 mL de PBS. Resuspenda o pellet resultante em 1x PBS até uma concentração final de 1.000.000 de células/mL.
    3. Adicione 1 μL de 5 mM de CFSE por mL de suspensão celular para alcançar uma concentração final de trabalho de 5 μM. Incube a suspensão da célula por 20 min em temperatura ambiente, protegida da luz.
    4. Apague a coloração CFSE adicionando 5 volumes de meio de cultivo. Incube mais 5 minutos em temperatura ambiente.
    5. Faça células de pellet e lave duas vezes com PBS para remover o CFSE residual. Resuspenda células em meio de crescimento mamário pré-aquecido. Incube por mais 10 minutos em temperatura ambiente para garantir que não reste corante.
    6. Sementes células marcadas fluorescentemente conforme descrito no passo 1.3.7. O restante do protocolo pode ser executado conforme descrito.

2. Imunofluorescência

  1. Fixação
    NOTA: Para evitar a despolimerização do gel ECM e a perda de amostras durante a lavagem, permita que todos os reagentes se equilibrem à temperatura ambiente por ~30 minutos antes do uso.
    1. Após 5 dias de co-cultura, substitua o meio por 500 μL de PBS.
      NOTA: Os passos 2.1.2 a 2.3.7 podem ser realizados em condições não estéreis.
    2. Remova PBS e substitua por 2% de paraformaldeído (PFA) em PBS (preparado fresco) em temperatura ambiente por 10 minutos.
      NOTA: O gel ECM é sensível ao PFA e pode levar ao descolamento da camada de gel.
      ATENÇÃO: O PFA se decompõe em formaldeído com o tempo. Evite inalar fumaça, garanta ventilação adequada e sempre use o equipamento de proteção individual adequado (ou seja, luvas, jaleco, proteção ocular) ao manipular PFA.
    3. Remova o PFA e lave os poços com 500 μL de solução de lavagem PBS-Glicina por 15 minutos em temperatura ambiente, com agitação suave.
      NOTA: O uso de lavagem com PBS-Glicina é fundamental para evitar que aldeídos livres produzam fluorescência de fundo. Não lave em PBS sem glicina.
    4. Repita o passo 2.1.3 duas vezes para um total de três lavagens. Veja a 2.1.5 para as condições de armazenamento, pule para a etapa 2.2.2 se não for necessário.
    5. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado por até 1 semana, e a lâmina pode ser armazenada a 4 °C. Para armazenar a lâmina, encha todos os poços com 1 mL de PBS e fele a tampa da lâmina da câmara com uma fita fina de parafilme. Coloque a lâmina plana em um recipiente à prova de luz, sobre um tecido delicado e molhado para garantir que as culturas não sequem.
  2. Coloração por anticorpos
    1. Leve as lâminas previamente armazenadas à temperatura ambiente, retire PBS e lave os poços com 500 μL de PBS fresco por 15 minutos com agitação suave. Pule essa etapa se continuar direto a partir da etapa 2.1.4.
    2. Permeabilizar as células com 500 μL de tampão de permeabilização por 15 minutos em temperatura ambiente, sem agitação.
    3. Lave poços com 500 μL de PBS, com 15 minutos de agitação suave. Repita duas vezes para um total de 3 lavagens.
    4. Adicione 500 μL de tampão bloqueador a cada poço e incube por 1 hora em temperatura ambiente com agitação suave.
      NOTA: Certifique-se de que a espécie fonte do soro no tampão bloqueante corresponda à espécie hospedeira do anticorpo secundário. Neste protocolo, usamos soro de burro e anticorpos secundários de burro.
    5. Dilua anticorpos primários de interesse no tampão de jejum intermitente, conforme as recomendações do fabricante. Remova o tampão bloqueante e adicione 300 μL de solução diluída de anticorpos a cada poço.
    6. Sele a tampa do ferrolho da câmara com parafilme e coloque o lâmino em um recipiente à prova de luz. Incube durante a noite a 4 °C com agitação suave.
    7. Lave poços com 500 μL de tampão de FI, com 15 minutos de agitação suave. Repita duas vezes para um total de 3 lavagens.
    8. Diluir o anticorpo secundário apropriado marcado fluorescentemente no tampão de FI, conforme recomendações do fabricante. Adicione 300 μL de diluição secundária de anticorpos a cada poço e incube por 1h em temperatura ambiente com agitação suave.
      NOTA: Evite exposição prolongada à luz após essa etapa para limitar o fotodescolorimento.
    9. Repita o passo 2.2.7.
    10. Diluir uma solução original de 300 μM de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1:800 em PBS. Adicione 300 μL a cada poço e incube por 20 minutos, em temperatura ambiente, com agitação suave.
    11. Lave as células com 500 μL de PBS por 5 minutos com agitação suave. Repita uma vez.
  3. Montagem do ferrolho
    1. Remova o máximo possível de PBS residual sem perturbar as culturas. Substitua a tampa e separe a câmara do ferrolho de vidro usando a ferramenta fornecida pelo fabricante do lâmpo da câmara.
    2. Usando um papel de seda delicado, limpe as bordas da lâmina para remover resíduos de PBS sem perturbar o gel ECM.
    3. Aplique lentamente o selante de silicone ao redor das bordas do ferrolho usando uma seringa e uma agulha de 18G. Deixe o silicone firmar por 3 minutos.
    4. Enquanto o silicone firma, adicione 1-2 gotas de meio antidescoloração em cada poço. Evite bolhas. Se bolhas forem formadas, use uma pipeta para removê-las cuidadosamente sem danificar a cultura.
    5. Depois que o silicone endurecer, abaixe suavemente uma cobertura de vidro em um ângulo raso. Use pinças ou uma ponta de pipeta para expulsar as bolhas de ar enquanto a capa de cobertura é abaixada. Use uma pressão suave para evitar quebrar a cobertura.
    6. Coloque o filtro em um recipiente à prova de luz em temperatura ambiente e deixe firmar durante a noite. A lâmina pode então ser armazenada a 4 °C, e o protocolo pausado por até 1 semana.
      NOTA (Opcional): Para melhor vedar os slides, aplique esmalte transparente nas bordas da capa 1 hora após o coverslipping.
    7. Slides de imagem usando um microscópio confocal de fluorescência com ampliação de 10-20x. Capture cinco campos aleatórios de visão para minimizar o viés do operador.

3. Coleta de coculturas para análise a jusante

NOTA: A colheita de células ou biomoléculas é incompatível com imunofluorescência. Recomenda-se cultivar coculturas destinadas a outras análises a jusante em placas padrão de cultura de 24 poços, utilizando as mesmas concentrações e volumes celulares descritos nas seções 1 e 2.

  1. Extração celular
    1. Remova o substrato gasto e lave suavemente os poços com PBS gelado. Repita uma vez para um total de duas lavagens.
    2. Usando uma ponta de pipeta de grande calibre, adicione 1 mL de solução de recuperação de células geladas, doravante chamada de solução de recuperação. Pipete suavemente para cima e para baixo para desestabilizar a camada de gel ECM. Transfira líquido para um tubo microcentrífuga de 1,5 mL.
      NOTA: A solução de recuperação celular é uma solução não enzimática comercialmente disponível, projetada para liberar suavemente células embutidas em gel ECM. É uma composição proprietária e pode ser incompatível com certos tipos de células. Como alternativa, a despolimerização enzimática do gel ECM pode ser considerada usando proteases suaves como Dispase ou Accutase. Isso exigirá incubações a 37 °C juntamente com otimização do tempo de incubação.
    3. Adicione 250 μL de solução de recuperação gelada a cada poço para coletar quaisquer células restantes. Transfira para o tubo correspondente da microcentrífuga.
    4. Inverta os tubos 4-5 vezes para misturar.
    5. Transfira os tubos para gelo e incube por 60 minutos com agitação suave. A cada 10 minutos, inverta os tubos 2-3 vezes para evitar que o conteúdo dos tubos se decante.
    6. Tubos de centrífuga a 300 x g por 5 min a 4 °C
    7. Verifique a presença de uma pastilha de célula visível. Remova cuidadosamente o sobrenadante e adicione 1 mL de 1x PBS gelado. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos a 4 °C. Repita uma vez para um total de duas lavagens. Espere que o pellet contenha 80-90% das células inicialmente semeadas, mantendo as proporções de cada tipo de célula constantes.
      NOTA: Neste ponto, o pellet celular pode ser lisado para coletar proteínas ou ácidos nucleicos. Pellets lisados podem ser armazenados a -80 °C, e o protocolo pode ser pausado por 3 meses. Lise é incompatível com a versão 3.2.
  2. Preparação de suspensão de célula única
    1. Resuspenda o pellet em 200 μL de 0,25% de tripsina-EDTA. Depois, incube a 37 °C por 3-4 minutos.
    2. Adicione 600 μL de meio de crescimento completo para extinguir a digestão da tripsina.
    3. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Remova o sobrenadante e adicione 500 μL de PBS em temperatura ambiente.
    4. Centrifuge a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. Repita uma vez para um total de duas lavagens.
    5. Resuspenda o pellet em 80 μL de PBS com 0,04% de BSA, suspensão por filtro usando um filtro de célula de 40 μm.
    6. Dilua 5 μL de suspensão em 5 μL de azul de tripano. Conte células e avalie a viabilidade em um hemacitômetro. As células agora estão prontas para análise a jusante.

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Results

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Para demonstrar a eficácia desse protocolo no estudo dos efeitos das interações célula-célula através de uma membrana basal, as Figuras 2 e 3 foram reaproveitadas de uma publicação anterior (Pallegar et al.16) como resultados representativos. As Figuras 4 e 5 são dados inovadores e foram geradas para mostrar a adaptabilidade desse protocolo a cél...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A ausência de interações complexas entre células na cultura celular tradicional destaca a necessidade de modelos aprimorados de órgãos e tecidos para estudar com mais precisão as respostas de medicamentos e a progressão da doença in vivo. O desenvolvimento de sistemas de co-cultura 3D contribuiu para preencher essa lacuna ao permitir o estudo das consequências das interações célula-célula sem a necessidade de estudos in vivo 9,12

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Disclosures

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O desenvolvimento do método foi parcialmente financiado pela Sociedade de Pesquisa do Câncer. A GRK foi apoiada com financiamento fornecido pela Bolsa de Pós-Graduação Carol Ann Cole da Sociedade Canadense do Câncer, por meio do Programa de Treinamento em Pesquisa em Câncer do Instituto de Pesquisa do Câncer Beatrice Hunter. O PMMB foi apoiado pela bolsa do programa MOBILITAS (2024) do Instituto de Pesquisa em Saúde das Ilhas Baleares (IdISBa). A Figura 1 foi criada usando BioRender.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Placa de Cultura de Tecidos de 24 PoçosCorning3524
Vidro de cobertura 24 x 60 mmUltident Scientific170-C2460
4% de paraformaldeído no PBSInvitrogenJ61899. AKDiluído para 2% em 1x PBS
Slides de Cultura com 4 Poços CâmaradosFalcon354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragmento de Burro Anti-Cabra IgG (H+L)Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.705-607-003
Hemaicitômetro de Linha BrilhanteHausser Scientific3120
Kit de Proliferação CFSE CellTraceInvitrogenC34570
Solução de Recuperação CelularCorning354253
DAPISigma-Aldrich Canada Co.D9542
Anticorpo Secundário Adsorbido Cruzado Anti-Mouse IgG (H+L), DyLight 594InvitrogenSA5-10168
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) altamente adsorvido cruzadamente, Alexa Fluor 647InvitrogenA31573
DMEM/F-12, sem fenol vermelhoGibco21041025
Média Eagle Modificada de Dulbecco, Alta Glicose, PiruvatoGibco11995-065
Soro Fetal Bovino, Origem no CanadáGibco12483-020
Filtradores de células Flowmi, 40 e micro; MBel-Art136800040
Janela e porta de silicone GE Advanced, transparenteHenkel Internacional2811093
Policlonal de Cabra Anti ZO-1SantaCruz BiotecnologiaSC8146Anticorpo primário, descontinuado
Anti ZO-1 monoclonal de ratoSantaCruz BiotecnologiaSC33725Anticorpo primário alternativo para substituir o anti-ZO-1 SC8416 descontinuado
Meio Basal das Células Epiteliais MamáriasPromocellC-21210
Matrigel, Fenol Vermelho, Fator de Crescimento Reduzido, Livre de LDEVCorning356231Concentração de proteína: 9-9,6 mg/mL
Anti-Vimentina Monoclonal de CamundongosSigma-Aldrich Canada Co.V2258Anticorpo primário
Soro para Bezerro de Recém-Nascido, Origem na Nova ZelândiaGibco16010159
Penicilina-estreptomicinaGibco15140-122
Soro Tamponado com Fosfato, pH 7,4Gibco10010023
Montagem ProLong Gold AntifadeInvitrogenP36934
Anti-E-Cadherin Purificado para RatosBD em Biociências610181Anticorpo primário
O Anti-Claudin Policlonal do Coelho 7 AbcamAB27487Anticorpo primário
RPMI 1640, GlutaminaGibco11875-093
SupplementMixPromocellC-39115
Tintura azul de tripano (0,4%)Gibco15250-061
Tripsina 0,25%-EDTAGibco25200056

References

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