Apresentamos um protocolo para análise quantitativa de moléculas ou íons em compartimentos subcelulares de células vivas usando biosensores baseados em transferência de energia por ressonância Förster (FRET). Inclui imagens padronizadas, processamento de máscaras binárias e análise ratiométrica com regressão linear aplicada ao fosfato em Arabidopsis thaliana (A. thaliana), mas é amplamente aplicável a outros biossensores e organismos.
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Artigo de método
Análise Quantitativa Ratiométrica de Biossensores Baseados em FRET em Arabidopsis thaliana Possibilita a Medição Viva de Analitos em Compartimentos Subcelulares
Neste artigo
Resumo
Resumo
Biossensores fluorescentes fornecem uma abordagem não invasiva e versátil para monitorar mudanças dinâmicas nas concentrações de metabólitos ou íons dentro de células vivas. Especificamente, biossensores baseados em FRET possibilitam medições ratiométricas que reportam os níveis de analitos subcelulares, sendo independentes dos níveis de expressão dos biosensores. Descrevemos um protocolo abrangente e padronizado para a análise quantitativa ratiométrica de biossensores baseados em FRET em plantas. O protocolo orienta os usuários através da preparação de amostras ao vivo, aquisição de imagens confocais de doadores, canais FRET e aceitadores, geração de máscaras binárias para regiões subcelulares de interesse, seguida por análise de dados ratiométricos baseada em regressão. O resultado principal é a leitura ratiométrica derivada da regressão, que permite comparações quantitativas entre genótipos, tecidos, estágios de desenvolvimento e condições de tratamento. Usando o biossensor cpFLIPPi-5.3m para fosfato inorgânico como exemplo, demonstramos a medição dos níveis de fosfato inorgânico no estroma de cloroplastos de A. thaliana. Esse arcabouço analítico é amplamente aplicável a outros biossensores e sistemas modelo baseados em FRET, permitindo quantificação espaço-temporal precisa de metabólitos e íons in vivo. Essa estratégia oferece insights mensuráveis sobre a dinâmica subcelular de metabólitos e íons, apoiando comparações em ambientes experimentais variados.
Introdução
Monitorar a dinâmica de metabólitos e íons em células vegetais vivas é essencial para entender como as vias metabólicas e as redes de sinalização são coordenadas no espaço e no tempo para apoiar o crescimento eo desenvolvimento 1,2. Os níveis de metabólitos celulares flutuam rapidamente em resposta a sinais ambientais como disponibilidade de nutrientes, intensidade luminosa eestresse 3. Entre eles, o nível de fosfato inorgânico (Pi) é particularmente importante, com papéis-chave na transferência de energia, sinalização e regulação metabólica, mas sua dinâmica subcelular continua difícil demedir 4.
Ensaios colorimétricos padrão e ressonância magnética nuclear de fósforo-31, (³¹P)-RMN, podem estimar o Pi total ou compartimental, mas não têm resolução de célula única e têm precisão temporallimitada de 5,6. Embora a espectrometria de raios X sincrotron e a imagem por radiotraçador forneçam informações subcelulares ou de fluxo, elas não conseguem distinguir de forma confiável Pi de metabólitos fosforilados e são frequentemente invasivas. Fracionamento não aquoso e ensaios cinéticos baseados em enzimas oferecem estimativas indiretas de Pi estromais e citosólico, mas essas abordagens são laboriosas e suscetíveis àcontaminação 7,8. Juntas, essas limitações ressaltam a necessidade de métodos não destrutivos com alta resolução espacial e temporal para monitoramento de metabólitos como o Pi, como imagens ao vivo de biossensores baseados em FRET.
Biossensores baseados em FRET codificados geneticamente são ferramentas poderosas para análises in vivo da dinâmica intracelular de íons e metabólitos. Estudos iniciais demonstraram a utilidade desses biossensores no monitoramento das concentrações de glicose, sacarose e ATP dentro dascélulas 9,10,11. Avanços mais recentes ampliaram essa abordagem para monitorar cálcio, nitrato, fosfato, auxina, ácido abscissídico e gibberelina, fornecendo insights valiosos sobre a regulação de nutrientes ehormônios 12,13,14,15,16.
o cpFLIPPi-5.3m é um biossensor Pi baseado em FRET, otimizado para monitorar níveis subcelulares de Pi em célulasvegetais 17. Esse biossensor consiste em uma proteína de ligação ao Pi cianobacteriano ladeada por um doador de FRET (eCFP, proteína fluorescente ciano aprimorada) e um aceitador de FRET (cpVenus, uma variante modificada da proteína fluorescente amarela de Vênus), e sofre uma mudança conformacional ao se ligar a Pi. Essa mudança altera o sinal de fluorescência derivado do FRET dependente de Pi, que é capturado por meio de imagens confocais, de modo que um aumento na concentração de Pi resulta em uma diminuição da razão FRET/doador. A análise ratiométrica dependente de Pi é realizada durante o pós-processamento das imagens, comparando as intensidades das emissões do aceitador e dodoador 18.
A análise quantitativa ratiométrica de FRET em tecidos vegetais vivos requer correção para o bleed-through espectral e a excitação cruzada dos fluoróforos doador (CFP) e aceitador (cpVenus),respectivamente 18. O bleed-through ocorre quando a emissão de CFP é detectada no canal de FRET, enquanto a excitação cruzada resulta da excitação de cpVenus durante a excitação de CFP. Esses artefatos espectrais podem variar entre células e compartimentos subcelulares, especialmente em tecidos vegetais pigmentados, e, portanto, confundem medições ratiométricas. Para obter emissão de FRET corrigida ou sensibilizada, contribuições de bleed-through e cross-excitation são subtraídas do sinal bruto de FRET da seguinte forma:
Emissão de FRET sensibilizada = Emissão bruta de FRET - bleed through - excitação cruzada
Fatores de correção para o bleed-through e a excitação cruzada são determinados por meio de imagens de plantas que expressam CFP ou cpVenus individualmente nas mesmas localizações celulares e subcelulares dobiosensor 18. A emissão de FRET sensibilizada é então calculada da seguinte forma:
Emissão de FRET sensibilizada = Emissão bruta de FRET - (emissão de CFP × fator de correção por filtro) - (emissão de cpVenus × fator de correção de excitação cruzada)
A razão entre emissão de FRET sensibilizada e emissão do doador (razão FRET) relata mudanças relativas na concentração de ligantes e é independente dos níveis de expressão19 do biossensor.
O biossensor cpFLIPPi-5,3m foi direcionado com sucesso para compartimentos subcelulares distintos de A. thaliana e outras espécies, permitindo a visualização da dinâmica Pi 18,20,21,22. Esse biossensor revelou heterogeneidade na distribuição e transporte citosólico de Pi entre tecidos e relacionou as flutuações estromais Pi dos cloroplastos à atividade do transportador e ao desempenhofotossintético 20,21. Como o biossensor relata mudanças dentro de uma faixa dinâmica definida, a interpretação exige que a faixa englobe níveis Pi in vivo sob condições estáveis de imagem. Iluminação desigual ou abundância muito baixa de biossensores podem influenciar medições ratiométricas, destacando a importância de configurações padronizadas de aquisição e controles negativos apropriados, como o sensor de controleinsensível ao Pi 20. Quando a variação da razão FRET entre regiões de interesse (ROIs) é mínima, a análise de regressão pode não ser apropriada, e recomenda-se o agrupamento das médias do ROI.
Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para análise quantitativa ratiométrica do cpFLIPPi-5,3m em A. thaliana, incluindo imagens confocais, segmentação de imagem usando máscaras binárias e cálculos de razão FRET para monitoramento dinâmico de Pi em células vivas. Esse método oferece um fluxo de trabalho reprodutível para analisar sinais de biossensor baseados em FRET, com dados ratiométricos analisados por regressão linear e comparações estatísticas entre condições experimentais. Dados representativos são apresentados usando acúmulo alterado de estroma Pi de cloroplastos em pht2; 1, um mutante transportador Pi cloroplasto expressando o sensor cpFLIPPi-5.3m 21,23. Este protocolo ajudará pesquisadores a aplicar a imagem ratiométrica baseada em FRET a outros sistemas experimentais, detalhando correções espectrais de biossensores, configurações de imagem e etapas de análise quantitativa. Ao padronizar a aquisição de imagens e a análise baseada em regressão dentro de contextos experimentais definidos, o fluxo de trabalho suporta a comparação consistente das respostas FRET entre amostras analisadas sob condições de correspondência. É apropriado para aqueles que buscam medir mudanças rápidas e específicas de compartimento nos níveis de analitos em tecidos vegetais vivos, incluindo mutantes ou linhagens transgênicas com alteração no transporte ou metabolismo do metabólito. Essa abordagem padronizada facilitará a reprodutibilidade de estudos quantitativos de imagem de células vivas na biologia vegetal. Além da biosensação Pi localizada em cloroplastos descrita aqui, a estratégia analítica pode ser adaptada a outros biossensores baseados em FRET e tecidos específicos de organismos, desde que sejam estabelecidas medições de calibração e controle específicas de biossensores.
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Protocolo
NOTA: Linhas transgênicas de Arabidopsis que expressam cpFLIPPi-5.3m e cpFLIPPi-null (variantes citosólicas e direcionadas a plastidos) foram geradas anteriormente17, 18 e pht2; 1-1 (CS19883) foi obtido do Arabidopsis Biological Resource Center, meio MS, óculos de cobertura, perfluorodecalina, microscópio confocal e uma objetiva de imersão em óleo 40x (abertura numérica 1,3), lasers de excitação (CFP/445 nm e cpVenus/515 nm ou comprimentos de onda de emissão apropriados ao instrumento), filtros de emissão para CFP, cpVenus/FRET e aceitador cpVenus, câmera ou detectores, estação de trabalho de análise de imagem, FIJI24 e Excel.
1 . Preparação de amostras
- Geração de linhas transgênicas de A. thaliana
- Clone o biossensor cpFLIPPi-5.3m, e controles de controle insensível a Pi-insensível (cpFLIPPi-Null), apenas doador (CFP) e apenas aceitador (cpVenus) nos vetores de expressão da planta17.
- Para uma expressão estável, transforme plantas de A. thaliana no fundo mutante SGS3-13 via Agrobacterium tumefaciens floral dip, colha sementes T1 e selecione transformantes em placas de ágar Murashige & Skoog (MS) 0,5x contendo o agente seletivo apropriado, por exemplo, fosfinotricina (10 μg/mL).
- Esterilize as sementes de A. thaliana que expressam os biossensores submergindo em etanol a 70% por 1 minuto, transfira para água sanitária a 50% por 1 minuto e depois enxágue de 6 a 10 vezes com água estéril.
ATENÇÃO: Etanol e água sanitária são irritantes e devem ser manuseados enquanto se usa o equipamento de proteção individual (EPI) adequado. Realize a esterilização das sementes em um exaustor químico ou em uma área bem ventilada para evitar a inalação de vapores e nunca misture água sanitária e etanol diretamente. Descarte soluções de resíduos de acordo com as diretrizes institucionais de segurança química. - Estratifice as sementes a 4°C no escuro por 2-3 dias para sincronizar a germinação, depois transfira as sementes para um meio sólido com ágar ou líquido de 0,5x MS contendo 0,25% de sacarose e a concentração desejada de Pi (250 μM) para o desenho experimental. Inclua o agente de seleção se selecionar transformantes.
- Transferir placas para uma câmara de crescimento controlada ajustada a 21°C, 16 horas de luz: 8 horas de fotociclo escuro, 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ de intensidade de luz e ~60% de umidade relativa. Cultive mudas por 4 a 7 dias para imagear as raízes ou transfira mudas para o solo por 21 dias para fotografar as folhas.
- Ao testar tratamentos com Pi, transfira mudas para o meio Pi desejado (por exemplo, 250 μM Pi para Pi completo; 10 μM Pi para Pi-deficiente) e mantenha o tratamento pelo período definido (por exemplo, 48 h para privação aguda de Pi).
- If possible, screen plants for adequate sensor expression by imaging for donor or acceptor fluorescence (low-intensity excitation) using a fluorescence stereo microscope (7-10x magnification).
- Avalie linhas no mesmo fundo genético que expressam cpFLIPPi-nulo como controles insensíveis a ligandos.
2 . Imagem confocal
- Para as raízes, monte mudas no meio de crescimento/água estéril em um lâmina de vidro. Sobreponha suavemente uma pequena capa para achatar as raízes sem compressão. Imagem imediatamente.
- Para as folhas, excise a folha-alvo (por exemplo, 3ª ou 4ª folha em plantas de 21 dias), coloque a superfície adaxial em um slide.
- Infiltre com 10-15 μL de perfluorodecalina para liberar os espaços de ar, se necessário, e sobreponha suavemente com um pequeno peso de vidro para achatar a amostra. Imagem imediatamente.
- Use um objetivo de alto NA apropriado para células vivas (por exemplo, 40× / 1,2-1,3 NA). Use o mesmo objetivo para todas as amostras para manter a comparabilidade.
- Usando o software Metamorph, defina os canais de excitação e emissão e capture imagens (Figura 1).
NOTA: Para capturar a emissão do doador (CFP): excitação a ~445 nm (ou linha CFP adequada ao instrumento) e coleta de emissão do doador (por exemplo, passagem de banda de 470-500 nm) podem ser usadas. Por exemplo, a excitação do laser de 445 nm a 70% (Figura 1A) com tempo de exposição de 1000 ms (Figura 1B) foi usada para capturar a emissão de CFP. Para capturar a FRET (emissão do aceitador sensibilizado): excitação no comprimento de onda doador (445 nm) e coleta da banda de emissão do aceitador (por exemplo, 530-560 nm). Para capturar o canal aceitador direto: excitação em excitação aceitadora (por exemplo, 500-515 nm) e coleta da mesma banda de emissão aceitadora que para FRET. - Adquira imagens sequencialmente: capture excitação/emissão doadora, excitação doadora/emissão de FRET, depois excitação aceitador/emissão aceitadora. Mantenha o tempo de imagem por campo curto para limitar o fotobranqueamento (500-1000 ms).
NOTA: Para cada localização celular (citosol raiz, citosol do mesófilo foliar, estroma de cloroplasto), determine a potência ideal do laser, ganho do detector e tempo de exposição (Figura 1) de modo que a intensidade média dos pixels esteja acima do fundo local, mas abaixo da saturação do detector. Mantenha configurações idênticas de captura para canais derivados da excitação doadora (doador e FRET) para uma determinada localização. Os parâmetros de imagem dependem da amostra, microscópio, fonte de luz e sistema de detecção, e, portanto, devem ser determinados empiricamente, com intervalos aceitáveis avaliados e documentados por meio de análise de regressão, conforme descrito neste protocolo. O software de captura de imagem usado aqui é Metamorph versão 7. - Use a mesma sensibilidade do detector (por exemplo, aqui, ganho de 2,4x e offset zero) em todas as imagens para a localização do alvo. Se estiver usando múltiplos detectores, caracterize as respostas espectrais para cada detector e documente-as.
- Adquira imagens de controle para cada tecido/genótipo de interesse.
- Imagem de tecido selvagem não transformado para determinar a autofluorescência de fundo para cada canal.
- Imagens de plantas expressando apenas doador (CFP) e apenas aceitador (cpVenus) nas mesmas configurações de captura para cada local para derivar coeficientes de correção espectral (bleed-through e cross-excitation). Capture imagens de múltiplos indivíduos (≥6-8) com uma faixa de intensidades de emissão.
3 . Processamento de imagem
- Abra as imagens brutas dos canais de doador (referido como CC para excitação/emissão do doador), FRET (chamado CY para excitação/emissão do aceitador) e receptor (chamado YY para excitação/emissão do aceitador) em softwares de análise como FIJI ou ImageJ. (Figura 2).
- Determine a intensidade média de fundo por canal amostrando múltiplos (5-10) ROIs em locais equivalentes de plantas não transformadas com as mesmas configurações. Subtraia o valor médio de fundo de cada imagem de canal correspondente.
- Passos a seguir nas FIJI
- Clique em Aba Analisar> Definir Medições > Selecionar o valor médio cinza. Meça a intensidade do fundo escolhendo um ROI específico ou uma média da imagem inteira.
- Clique em Analisar> Mede. Salve os valores em uma planilha Excel e calcule valores médios em segundo plano para cada canal. Limite a imagem do doador (CFP) para definir o limite espacial do biossensor (o doador normalmente tem o menor sinal). Converta a imagem doadora com limiar para uma máscara binária (Figura 3 A).
- Clique em Imagem da Aba> Ajustar> Limiar.
- Uma janela para o limite se abrirá. Escolha o método Max Entropy para o limiar. Estabeleça a fronteira espacial, neste caso, o estroma do cloroplasto, e aplique o limiar. Isso gera uma imagem binária em preto e branco (Figura 3 B).
- Clique em Tab Math> Divide> Insira o valor 255. A imagem vai ficar toda branca. Salve essa imagem binária da máscara como um arquivo .tiff.
- Multiplique a máscara binária pelas três imagens subtraídas do fundo para criar imagens mascaradas para análise (Figura 3C).
- Abra o arquivo binário de máscara no FIJI.
- Clique em Processo de Tabulação> Matemática>Multiplicar.
- Escolha a máscara binária como uma das imagens e a imagem CC subtraída pelo fundo como a outra.
- Repita os passos para CY e YY.
- Desenhe ROIs nas imagens mascaradas apropriadas à estrutura em estudo (célula inteira, citosol, estromal de cloroplastos). Para cada ROI, extraia as intensidades médias de pixels para canais doador, FRET e aceitador direto. Salve metadados do ROI (nome da imagem, coordenadas, condição experimental, ID de replicação) para análise estatística a jusante.
- Imagens abertas em CC, CY e YY.
- Clique em Tab Matemática> Subtrair> Insira o valor médio de fundo. Alternativamente, isso pode ser feito logo antes de calcular o FRET sensibilizado no Excel.
- Abra o arquivo de CC mascarado.
- Clique em Aba Processo > Calculadora de Imagem. Multiplique CC com o arquivo de imagem CC mascarado. Isso abrirá um novo arquivo de imagem de 32 bits.
- Desenhe ROIs usando as ferramentas FIJI apropriadas na barra de tarefas principal. Por exemplo, aqui o estroma do cloroplasto é selecionado usando a ferramenta ROI "Oval". Adicione os ROIs a um gerenciador de ROI (ctrl+T). Escolha 5-10 ROIs por imagem. Marque "Mostrar Tudo". Esses ROIs podem ser armazenados como um metaarquivo separado (Figura 3D). Não feche o gerente de ROI.
- Clique em Aba Analisar> Definir medidas> Selecionar valor médio cinza.
- Clique em "Mede" no gerenciador de ROI.
- Os valores médios dos pixels dos ROIs escolhidos aparecerão como uma lista em uma janela separada.
- Copie esses dados para o Excel. Não feche o gerente de ROI.
- Repita a multiplicação do arquivo CC mascarado com as imagens CY e YY para obter medições dos mesmos ROIs usando o gerenciador de ROI em cada canal individual. Armazene os valores no Excel.
4. Análise ratiométrica
- Abra o Microsoft Excel para realizar as seguintes operações (Figura 4).
- Cálculo dos coeficientes de correção.
- Para cada localização celular, plote as intensidades do canal FRET (eixo Y) de plantas apenas doadoras em relação às intensidades do doador (eixo X). Ajuste uma regressão linear. A inclinação é o coeficiente de sangramento do doador (designado como a).
- Repita plotando intensidades de canais FRET de plantas apenas aceitadoras (eixo Y) contra intensidades aceitadoras diretas (eixo X). A inclinação é o coeficiente de excitação cruzada do aceitador (designado como b).
- Use ≥15-20 ROIs de múltiplas plantas para obter coeficientes robustos. Para o estroma de cloroplastos, são escolhidos entre 50 e 60 cloroplastos.
- Calcule o FRET sensibilizado para cada ROI como
FRET Sensibilizado = FRET Bruto - (a × doador) - (b × aceitador)
onde a e b são coeficientes específicos de localização derivados acima (Figura 4). - Plote as intensidades do FRET (eixo Y) sensibilizadas versus intensidades do canal doador (eixo X) para ROIs agrupados. Ajuste uma regressão linear e o Excel fornecerá um ajuste no formato y = mx + c, onde y corresponde às intensidades sensibilizadas do FRET, x às intensidades do doador, c ao intercepto y e m à inclinação da regressão. Note R² para as regressões ajustadas. Normalmente, R² varia de 0,8 a 1, representando um bom ajuste (Figura 4).
- Para medições citosólicas e estromalas, calcule e use a inclinação do FRET/doador (FRET Sensibilizado ÷ doador) como a leitura ratiométrica, também chamada de razão FRET.
NOTA: O erro do ajuste para a regressão representa o erro padrão da inclinação (use a função LINEST no Excel). Use a seleção específica de local de forma consistente entre amostras e genótipos de interesse. A regressão linear aplicada a dados de múltiplos ROIs e plantas independentes confirma que a razão FRET é independente da abundância dos sensores. - Calibração, controles e distinção de efeitos inespecíficos.
- Use cpFLIPPi-null (variante insensível a ligantes) expresso em paralelo e processado idêntico para distinguir possíveis mudanças inespecíficas na razão FRET (pH, força iônica, fotofísica) de mudanças específicas de Pi.
- Dados agregados em nível de ROI com campos: genótipo, compartimento, ID replicar planta, ID ROI, doador, aceitador, FRET bruto, FRET sensibilizado, razão ajustada (conforme aplicável). Preserve as intensidades brutas.
- Para comparações populacionais, use as inclinações derivadas da regressão como estatísticas primárias; Relate inclinações ± SE e % de erro relativo.
- Aplique estatísticas inferenciais apropriadas (por exemplo, teste t de Student ou ANOVA) em parâmetros derivados da regressão. Use testes não paramétricos se distribuições violarem a normalidade. Corrija múltiplas comparações quando aplicável.
- Checklist de controle de qualidade (antes de aceitar dados)
- Confirme que todos os três canais de cada imagem estão abaixo da saturação do detector e possuem uma relação sinal-ruído adequada (>2-10x de fundo).
- Confirme que os controles de fluoróforo único doador e aceitador foram imagens em configurações idênticas e obtiveram relações lineares para derivar os coeficientes de correção a e b.
- Confirme que o registro de imagem é preciso e que as máscaras definem corretamente regiões contendo biossensores.
- Confirme que o controle cpFLIPPi-nulo mostra a falta esperada de sensibilidade Pi.
- Métricas representativas de controle de qualidade para ajudar na exclusão de imagens
- Taxa de saturação: Menos de 1-2% dos pixels atingem a intensidade máxima (65.535) para imagens de 16 bits.
- Nível de fundo: A intensidade média em regiões sem células varia de ~50-200 unidades.
- Faixa de intensidade de pixels: As intensidades médias estão bem acima do fundo, mas permanecem abaixo da saturação (~2.000-20.000 unidades).
- Relação sinal-ruído (SNR): Os valores devem exceder 2-10.
5. Teste estatístico para diferença entre duas inclinações de regressão
- Determine se duas inclinações (inclinações da razão FRET derivadas da regressão de dois genótipos ou tratamentos) diferemsignificativamente 25.
- Calcule a estatística do teste e os graus de liberdade da seguinte forma
com graus de liberdade df = n1 + n2 - 4. m1 e m2 correspondem às inclinações da regressão linear, sb1 e sb2 referem-se ao erro padrão de cada inclinação (obtido a partir do LINEST ou da saída de regressão) e n1 e n 2 são os tamanhos das amostras (número de retornos sobre investimento usados para ajustar cada regressão). - Obtenha um valor p bidirecionado para t com df (por exemplo, use uma tabela de distribuição t ou uma calculadoraonline 26). Ao usar a calculadora online (Figura 5C), insira os sb1 e s b2 e n1 e n2 obtidos na etapa anterior para calcular o valor p e as estatísticas do teste.
- A interpretação será rejeitar a hipótese nula (inclinações não são significativamente diferentes) se p < α (por exemplo, α = 0,05). Reporte b 1, b2, sb1,s b2, t, df e p.
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Resultados
Imagem confocal
Usando microscopia confocal e software Metamorph, canais separados foram adquiridos para visualizar os sinais doadores e aceitadores de FRET nos tecidos foliares de A. thaliana wildtype (WT) e no pht2; 1 mutante transportador Pi de cloroplastos (Figura 2). Imagens representativas ilustram uma localização subcelular clara do biossensor Pi, com cloroplastos facilmente distinguíveis ...
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Discussão
Esse protocolo oferece uma abordagem padronizada para quantificação de metabólitos ou íons em células vivas usando biosensores baseados em FRET. Principais vantagens incluem medição ratiométrica não invasiva e aplicabilidade a múltiplos compartimentossubcelulares 17,20,21,22. O uso de máscaras binárias e regressão linear melhora a precisão e a reprodutibilidade...
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Divulgações
Os autores não declaram conflitos de interesse relacionados a esta obra.
Agradecimentos
Reconhecemos as contribuições dos antigos membros do laboratório W.K.V., cujos esforços apoiaram o desenvolvimento deste protocolo. O apoio financeiro foi fornecido pelo Departamento de Energia dos EUA, Escritório de Ciência, Programa de Tecnologia de Bioimagem (DE-SC0014037) e Ciências Básicas de Energia (DE-FG02-04ER15559). A A.S.R. foi apoiada em parte por fundos do Hagler Institute for Advanced Study, da Texas A&M University.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Objetivo de imersão em óleo 40X | Olympus | https://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4P | Lente objetiva para imagem |
| Copos de cobertura / capas | VWR | 48393-081 | Cobertura para colocação da amostra |
| FIJI (ImageJ) | Código aberto | 2.9.0 | Software de análise de imagens |
| Microscópio Olympus IX81 invertido | Olympus | http://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdf | Sistema de imagem confocal |
| Câmera EMCCD iXon3 897 | Tecnologia Andor | https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897 | Parte do sistema de imagem confocal |
| MetaMorph software V7 | Dispositivos Moleculares. LLC | Versão 7 | Estação de trabalho de análise de imagem |
| Microsoft Excel | Microsoft Suite | v16.68 | Software de análise de dados |
| Murashige & Skoog (MS) médio | Caixão | MSP11-10LT | Meio de crescimento de plantas |
| Perfluorodecalina (Acros Organic) | Acros Organics | P9900-25G | Meio de imagem |
| Fosfinotricina | Sigma | 77182-82-2 | Antibiótico |
| Câmara de crescimento de plantas | Conviron | Costume | Câmara de crescimento |
| Unidade confocal de disco giratório Yokogawa CSU-X1 | Yokogawa | https://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/ | Parte do sistema de imagem confocal |
Referências
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