Estratégia Integrada de Microplacas e HPTLC para Determinar e Perfilar Fenólicos Totais e Flavonóis em Extratos de Casca de Cítricos

Resumo

Este estudo apresenta uma abordagem combinada AlCl₃/Folin–Ciocalteu para perfilamento e quantificação de HPTLC de flavonóis/5-hidroxiflavonas e compostos fenólicos em cascas de cítricos, complementada por análise de microplacas.

Resumo

Compostos fenólicos e flavonoides contribuem significativamente para a atividade antioxidante e o valor funcional dos subprodutos cítricos. No entanto, ensaios colorimétricos convencionais, embora amplamente utilizados, não possuem separação cromatográfica e podem ser afetados por interferências químicas. Esse protocolo apresenta um fluxo de trabalho analítico integrado que combina ensaios espectrofotométricos de microplacas com cromatografia de camada fina de alto desempenho (HPTLC) para a determinação e perfilagem do conteúdo fenólico total (TPC) e do total de flavonóis mais o teor de 5-hidroxiflavonas (TFHC) em extratos de casca de cítrico. Extratos etanólicos de cascas de cal (Citrus aurantifolia) e tangerina (Citrus reticulata) foram avaliados usando ensaios Folin–Ciocalteu (FC) e cloreto de alumínio (AlCl₃) em formato de microplacas de 96 poços, seguidos por análise HPTLC que utilizou duas fases móveis sequenciais e derivação pós-cromatográfica dupla. Medições em microplacas forneceram valores de TPC de 74,2 mmol/g para cal e 72,8 mmol/g para mandarina, enquanto os valores de TFHC foram 15,5 mmol/g e 6,0 mmol/g, respectivamente. A separação do HPTLC resolveu quatro bandas fenólicas na cal e seis na tangerina. Duas faixas de cal foram visualizadas seletivamente após a derivatização de AlCl₃, consistentes com flavonóis ou 5-hidroxiflavonas. A soma dos maus fenólicos estimados pelo HPTLC foi de 22,0 e 20,8 mmol/g de matéria seca para cal e tangerina, respectivamente, enquanto o TFHC atingiu 13,4 mmol/g em cal e não foi detectado em tangerina. Esses achados demonstram que ensaios de microplacas fornecem uma estimativa rápida e sensível do conteúdo total, enquanto o HPTLC aumenta a seletividade por meio da separação de compostos e derivação específica de grupos funcionais. A estratégia combinada permite triagem de alto rendimento seguida por confirmação cromatográfica, oferecendo uma plataforma prática e reprodutível para caracterização fitoquímica de matrizes complexas de plantas.

Introdução

Cascas cítricas são um subproduto da indústria de sucos e demonstraram a presença de compostos funcionais, como^{antioxidantes 1}. Eles foram usados como alimentos^{neuroprotetores 2}, anti-inflamatórios, cosmecêuticos^{antiacne 3} e aditivos^{alimentares 4}. Várias dessas bioatividades são atribuídas a flavonoides⁵ e a compostos^{fenólicos 6}. Métodos gerais para estimar a quantidade total de flavonoides e fenóis foram estabelecidos na^{literatura 7,} sendo os mais comuns o Folin-Ciocalteu para o teor fenólico total (TPC⁾⁸, e o cloreto de alumínio para compostos flavonoides totais (TFC⁾⁹ por espectrofotometria. O método de Folin-Ciocalteau foi publicado em 1927 pela primeira^{vez 10}, baseado em uma modificação da reação de Folin-Denis¹¹, ambos baseados em uma reação redox de compostos fosfóungstico-fosfhomolibdicos. O método Folin-Ciocalteau mede a capacidade redutora dos compostos^{fenólicos 12}. O teste de cloreto de alumínio e flavonoides foi proposto pela primeira vez em 1960, baseado em complexos entre os ligandos metálico e flavonoide¹³.

Ambos os ensaios espectrofotométricos são ferramentas úteis para estimar e comparar o conteúdo geral de fitocompostos comumente encontrados em materiais vegetais. No entanto, eles estão sujeitos a várias limitações. Por exemplo, algumas limitações surgem do uso do padrão^{externo 14}, onde geralmente se assume que a natureza química do padrão não afeta significativamente a resposta do sinal. Na prática, essa suposição é difícil de validar, já que a absorção molar depende de fatores como conjugação e outras características estruturais que são difíceis de padronizar em produtos naturais. Por exemplo, Appel et^{al 15} avaliaram o TPC de onze espécies de carvalho e desenvolveram a chamada abordagem "auto-padrão", relatando diferenças maiores que 50% nas inclinações das curvas de calibração. A utilização auto-padrão é uma estratégia projetada para representar a mesma mistura composicional de compostos presente na amostra, proporcionando assim uma correspondência mais próxima ao Conteúdo Fenólico Total (TPC) real na^{amostra 16}. Os auto-padrões também fornecem algumas informações sobre a razão entre grupos reativos e peso molecular médio; no entanto, é trabalhoso e difícil de padronizar.

O ensaio total de compostos flavonoides com base na complexação de cloreto de alumínio foi criticamente avaliado em estudos^{recentes 17,18}, que concluíram que AlCl₃ forma especificamente complexos com dois subgrupos de flavonoides: flavonoides e 5-hidroxiflavonas. Normalmente, flavonóis apresentam absorção máxima em torno de 440 nm, enquanto 5-hidroxiflavonas absorvem perto de 415 nm. Além disso, certos flavonoides podem apresentar absorção intrínseca na faixa de 415–440 nm mesmo na ausência de derivatização, e o aumento da absorção após a complexização varia entre compostos individuais. Além disso, ambos os ensaios colorimétricos não têm separação e, portanto, não conseguem distinguir entre diferentes constituintes fenólicos; Embora esse recurso possa ser vantajoso para estimar o conteúdo total, resulta em especificidade limitada. Essas considerações destacam a necessidade de uma estratégia analítica que resolva componentes individuais antes da detecção colorimétrica, distinguindo assim respostas verdadeiras de ensaio de interferências espectrais ou químicas.

Apesar dessas limitações, tais ensaios continuam sendo ferramentas valiosas para a triagem geral de compostos fenólicos bioativos em extratos de plantas e^frutas. Para avaliar possíveis interferências, o uso de um método de cromatografia de camada fina de alto desempenho (HPTLC), que foi revelado com os reagentes Folin–Ciocalteu e AlCl₃, representa uma abordagem eficaz. A separação cromatográfica permite a detecção de substâncias interferentes com faixas de absorção pré-existentes antes da complexificação, enquanto a documentação fotográfica permite a análise simultânea de múltiplos máximos de absorção. Além disso, a análise HPTLC oferece várias vantagens em relação a técnicas cromatográficas mais abrangentes, como HPLC–MS/MS, incluindo menor consumo de solvente, menor tempo de análise devido ao processamento simultâneo de múltiplas amostras (até 18 por placa⁾²⁰, e facilitação da interpretação de misturas complexas devido à seletividade da derivatização^{pós-cromatográfica 21}.

Neste trabalho, apresentamos um protocolo integrado para a determinação dos compostos específicos que compreendem o conteúdo polifenólico total (TPC) e os flavonóis totais mais 5-hidroxiflavonas (TFHC) em extratos de casca cítrica utilizando separação cromatográfica de camada fina de alto desempenho (HPTLC), juntamente com uma estimativa geral de conteúdo baseada em um ensaio colorimétrico de microplacas. A quantificação cromatográfica planar de compostos fenólicos é realizada usando o reagente Folin–Ciocalteu, enquanto a derivatização por cloreto de alumínio é aplicada exclusivamente para a identificação cromatográfica de bandas correspondentes a flavonóis e 5-hidroxiflavonas. Nessa abordagem, a determinação do TFHC baseia-se na resposta de Folin–Ciocalteu de compostos cromatograficamente resolvidos e quimicamente identificados, em vez da complexação de cloreto de alumínio para quantificação. A análise HPTLC permite a separação e visualização específicas de compostos, possibilitando a identificação de constituintes fenólicos individuais e a detecção de potenciais interferências espectrais. Além disso, um método espectrofotométrico baseado em microplacas é apresentado para estimativa rápida do TPC e TFHC totais, fornecendo uma ferramenta complementar de triagem de alto rendimento para matrizes complexas de plantas.

Protocolo

1. Preparação das cascas de frutas

1. Remova aproximadamente 50 g de cascas de cada fruta, separando-as da parte comestível. Para nossos resultados representativos, mandarinas foram compradas em uma loja local (importadas do Chile, variedade Isabellina), e limas foram coletadas de uma árvore próxima a San José, Costa Rica (espécime de referência JVR-16434).
2. Coloque as cascas em um saco plástico zip-lock e congele-as a -20 °C por pelo menos 2 horas.
3. Transfira as cascas congeladas para um liofilizador pré-resfriado, mantenha os sacos abertos e aplique a vácuo (0,1 mbar) durante a noite até secar completamente.
4. Moa cada material seco até aproximadamente 0,1 mm usando um moinho de lâminas.

2. Extração

1. Pese aproximadamente 100 mg de casca cítrica seca e moída (limão ou tangerina) e coloque em um tubo de vidro de 15 mL.
2. Adicione 3 mL de etanol a 60% ao tubo.
3. Sonice a mistura em um banho ultrassônico por 10 minutos a 40 °C para desestabilizar as células vegetais e facilitar a liberação de fitoquímicos.
4. Centrifuge a amostra a 850 × g por 10 minutos.
5. Transfira cuidadosamente o sobrenadante etanólico para um frasco volumétrico de 10 mL usando uma pipeta Pasteur, evitando a perturbação do sedimento.
6. Adicione mais 3 mL de etanol a 60% ao tubo que contém o resíduo úmido e sólido.
7. Repita os passos de sonicação e centrifugação descritos acima nos passos 2.3 e 2.4.
8. Transfira o sobrenadante para o mesmo frasco volumétrico e combine com o extrato anterior.
9. Realize uma terceira extração repetindo os passos anteriores (2,6–2,8).
10. Acidular o extrato combinado (≈9 mL) com duas gotas de 0,1 mol/L de HCl (para aumentar a estabilidade das antocianinas e outros compostos fenólicos) e elevar o volume para 10 mL com metanol.
11. Realize esse procedimento em triplicado para cada amostra.

3. Conteúdo total de flavonóis e 5-hidroxiflavonas (TFHC) por espectrofotometria de microplacas

1. Prepare uma solução de quercetina (100 μg/mL) ou um padrão flavonoide equivalente.
   1. Pese 10 mg de quercetina usando uma balança com precisão de 0,1 mg.
   2. Dissolva a quercetina em aproximadamente 5 mL de etanol 95% e transfira a solução para um frasco volumétrico de 10 mL rotulado como solução padrão.
   3. Enxágue o béquer duas vezes com 2 mL de etanol 95% e adicione os enxágues ao frasco.
   4. Leve o volume ao limite com 60% de etanol.
   5. Prepare soluções padrão (10–100 μg/mL) e um blank em tubos microcentrífugas de 1,5 mL conforme a Tabela 1.
   6. Certifique-se de que todas as amostras e padrões estejam dentro de uma faixa de absorção de 0,2–0,8, ajustando as concentrações se necessário.
   7. Prepare o layout da microplaca dispensando 60 μL de blank, amostra ou padrão em cada poço conforme a Figura 1. Realize três réplicas por amostra ou padrão.
   8. Dispense soluções aquosas de 2% de cloreto de alumínio, 5% de acetato de sódio e 80% de metanol em reservatórios de reagentes separados.
      NOTA: Manuseie as soluções de cloreto de alumínio e metanolas com cuidado. Soluções de cloreto de alumínio são irritantes, e o metanol é tóxico por ingestão, inalação e absorção da pele. Evite contato visual com pele e uso de EPI adequado
   9. Usando uma pipeta multicanal de 8 canais, adicione 10 μL de solução de AlCl₃, 10 μL de solução de acetato de sódio e 200 μL de metanol 80% em cada poço.
   10. Agite a placa em intensidade intermediária por 10 segundos e incube no escuro por 30 minutos.
   11. Meça a absorção a 415 nm. Se não houver agitação disponível, misture manualmente com uma micropipeta antes da incubação (Figura 2).
   12. Interpole os valores de absorção da amostra a partir da curva de calibração e aplique fatores de diluição, volumetria e correção de massa conforme necessário.

Tabela 1: Quantidades de padrões de quercetina para flavonóis totais e curva de calibração do conteúdo de 5-hidroxiflavonas (TFHC). Por favor, clique aqui para baixar esta tabela.

Figura 1: Disposição das microplacas para análise de microplacas totais de flavonóis e 5-hidroxiflavonas (TFHC). (A) Esquema das microplacas. (B) Software Gen5 layout programa. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Configuração de software de microplacas para análise de conteúdo de flavonóis totais e 5-hidroxiflavonas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Conteúdo polifenolical total (TPC) por espectrofotometria de microplacas

1. Prepare uma curva padrão do ácido gálico (0,000–0,120 mg/mL).
   1. Pese aproximadamente 0,0123 g de ácido gálico (98% de pureza) usando uma balança analítica e dissolva-o em água destilada.
   2. Transfira a solução para um frasco volumétrico de 10 mL, enxágue duas vezes e encha até a marca com água destilada para obter a solução de estoque.
   3. Prepare uma solução de trabalho diluindo 1 mL da solução de estoque para 10 mL com água destilada.
   4. Prepare padrões de calibração diluindo ainda mais a solução de trabalho conforme a Tabela 2.
   5. Ajuste as concentrações se os valores de absorção estiverem fora da faixa de 0,2–0,8.
   6. Prepare o reagente de trabalho Folin–Ciocalteu diluindo o reagente comercial 1:14 com água destilada.
      NOTA: O reagente Folin–Ciocalteu e as soluções de ácido clorídrico são corrosivas. Evite respingos e contato direto. Realize manuseio de reagentes em uma exaustão.
   7. Pipete 30 μL de cada amostra, padrão ou blank em uma microplaca de 96 poços seguindo o layout da Figura 3A, usando três réplicas por amostra.
   8. Adicione 215 μL de reagente de trabalho Folin–Ciocalteu a cada poço usando uma pipeta multicanal.
   9. Adicione 50 μL de solução de carbonato de sódio a 20% em cada poço e misture cuidadosamente com uma micropipeta.
   10. Incube a placa por 20 minutos a 40 °C com agitação (Figura 3B).
   11. Meça a absorção a 755 nm.

Tabela 2: Quantidades de padrões de ácido gálico para a curva de calibração do conteúdo fenólico total (TPC). Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Figura 3: Disposição das microplacas e configuração de software para análise de microplacas com conteúdo fenólico total (TPC). (A) Layout. (B) Programa de software. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

5. Condições gerais utilizadas para análise cromatografia de camada fina de alto desempenho

1. Curvas padrão
   1. Prepare soluções de estoc de quercetina e ácido gálico (100 μg/mL cada) conforme descrito acima nas seções 3 e 4.
   2. Aplique ácido gálico em seis pistas em volumes de 2, 4, 6, 8, 10 e 12 μL.
   3. Aplique 5 μL de ácido gálico e quercetina individualmente em pistas separadas para identificação.
2. Disposição das placas:
   1. Use uma placa TLC com respaldo de alumínio de 10 × 20 cm e gel de sílica de 60 F₂₅₄ como fase estacionária.
   2. Defina os parâmetros da aplicação da seguinte forma: posição Y 7,0 mm, comprimento da banda 6,0 mm, primeira posição X 14,0 mm, distância entre trilhos 9,4 mm.
   3. Aplique 10 μL de cada extrato por banda usando nitrogênio como gás de pulverização.
   4. Ajuste a distância da frente do solvente para 70 mm.
3. Desenvolvimento da placa:
   1. Desenvolva placas em uma câmara manual contendo 40 mL de fase móvel e permita 10 minutos para a saturação da câmara usando papel filtro em contato com a fase móvel e a parede da câmara para ajudar os vapores da fase móvel a saturarem a atmosfera da câmara.
   2. Revele as placas usando MP1 ou MP2, realizando dupla revelação quando necessário. Fase Móvel 1 (MP1), composta por acetato de etil:ácido fórmico:ácido acético:água (100:11:11:26); e MP2 feito de tolueno:acetato de etilo: ácido fórmico (5:4:1).
      NOTA: Desenvolva placas de HPTLC em uma exaustão exaustiva. Componentes da fase móvel (acetato de etilo, tolueno, ácido fórmico e ácido acético) são voláteis, e tolueno e acetato de etila são altamente inflamáveis. Evite a inalação de vapor e elimine as fontes de ignição.
   3. Deixe os pratos secarem em temperatura ambiente.
4. Derivatização
   1. Placas de pulverização com reagente Folin–Ciocalteu (300 μL de reagente + 600 μL de 50% etanol), secar brevemente com um soprador térmico e pulverizar com 1 mL de carbonato de sódio a 10% em 50% de etanol.
   2. Separadamente, borrife outras placas com 1% de cloreto de alumínio em 50% de etanol.
5. Placas de aquecimento uniformes com uma pistola de calor até que o desenvolvimento da cor se estabilize e as placas fiquem completamente secas.

6. Desenvolvimento para análise de teor total de flavonóis e 5-hidroxiflavonas (TFHC) e teor fenólico total (TPC) por cromatografia de camada fina de alto desempenho

1. Aplique amostras em faixas triplicadas junto com rotas de referência de ácido gálico e quercetina (para identificação, conforme descrito no passo 5.1.4).
2. Desenvolva uma placa usando MP1.
3. Revele a placa novamente usando MP2.
4. Derivize a placa usando reagente FC conforme descrito anteriormente.
5. Documente a placa com fotos usando iluminação branca, além de iluminação UV de 254 nm e 366 nm.
6. Repita o procedimento, substituindo a etapa final para a derivatização do AlCl₃ , como mostrado na Figura 4.

Figura 4: Etapas do VisionCats para análise de TPC e TFHC pelo HPTLC. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Resultados

Condições de extração
O protocolo geral de extração descrito aqui emprega 60% de etanol, conforme já^{relatado 22}. Quando extrapoladas para outras fontes vegetais, as condições de extração podem ser otimizadas em termos da polaridade do solvente e do número de ciclos. Uma justificativa abrangente para selecionar tanto o solvente quanto o número de ciclos foi detalhada em^{outro lugar 16}. A seleção do solvente pode ser guiada por literatura anterior e índices de polaridade; Em geral, misturas hidroalcoólicas de etanol ou metanol, assim como acetona, são recomendadas. O número ótimo de ciclos de extração (n) pode ser avaliado dividindo um volume total fixo de 10 mL em 1–5 ciclos de 10/n mL, seguido pelo agrupamento dos extratos líquidos. A eficiência dos diferentes números de ciclos de extração é então comparada estatisticamente para identificar a condição que gera a máxima absorção no ensaio TPC.

Quantificação de microplacas e HPTLC
As curvas padrão de calibração tanto para o ensaio de microplacas quanto para a análise HPTLC são apresentadas na Figura 5. Para a determinação do conteúdo fenólico total (TPC) pelo método de microplacas de Folin–Ciocalteu e para placas HPTLC derivadas com o mesmo reagente, curvas de calibração foram estabelecidas usando ácido gálico como composto de referência. O ácido gaulêsico foi selecionado não apenas por ser um dos padrões mais comumente usados para quantificação de TPC, mas também porque pode ser eluído sob as mesmas condições de fase móvel aplicadas às amostras de cal e mandarina. A quercetina também foi avaliada como um padrão potencial para o ensaio HPTLC; no entanto, mostrou-se inadequado para esse sistema cromatográfico, pois co-eluvia com a frente do solvente e não podia ser quantificado de forma confiável. No entanto, o TFHC foi determinado usando quercetina como padrão de referência, já que o ácido gálico não forma um complexo colorido com cloreto de alumínio, dado que não é nem flavonol nem 5-hidroxiflavona.

Figura 5: Placa HPTLC de cal, tangerina, ácido gálico e quercetina desenvolvida sequencialmente com MP1 seguida de MP2, e derivatizada separadamente com cloreto de alumínio (AlCl₃) e reagentes Folin–Ciocalteu (FC). O perfil cromatográfico após a derivatização AlCl₃ é mostrado. Abreviações: FC, derivatização de Folin–Ciocalteu; AlCl₃, derivatização por cloreto de alumínio; W, iluminação de luz branca; 366, iluminação UV em 366 nm. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Os resultados para o teor fenólico total (TPC) e o teor total de flavonoides e ácidos hidroxicinâmicos (TFHC) são apresentados na Tabela 3. Como esperado, os valores de TFHC foram significativamente menores que os valores de TPC, sendo aproximadamente cinco vezes menores em amostras de cal e doze vezes menores em amostras de mandarim.

Tabela 3: Resultados para o teor fenólico total de tangerina e cal pelo método de microplacas. Abreviações: Abs: absorvida, CV: coeficiente de variação, DF: fator de diluição, GAE: equivalentes do ácido gálico, IR: réplica independente, QE: equivalentes quercetina, Rep: repetição, SD: desvio padrão, TFHC: flavonóis totais e compostos 5-hidroxiflavona, TPC: teor fenólico total e média . *Calculado com base em matéria seca. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

De forma semelhante, os resultados obtidos da análise HPTLC são resumidos na Tabela 4. A separação cromatográfica permite a visualização de bandas individuais correspondentes a compostos distintos. Quatro constituintes fenólicos foram detectados em amostras de cal e seis em amostras de mandarim. Nenhuma dessas faixas correspondeu aos fatores de retenção dos padrões de referência empregados (ácido gálico e quercetina), o que é consistente com as expectativas.

Tabela 4: Resultados para o Conteúdo Fenólico Total e as bandas correspondentes ao AlCl₃ revelaram compostos derivados por HPTLC com AlCl₃. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

A Tabela 4 também relata o conteúdo fenólico total estimado a partir da análise HPTLC, calculado como a soma dos compostos individuais detectados cromatograficamente (análogo ao TPC). Além disso, a tabela inclui o conteúdo acumulado das bandas atribuídas a flavonóis ou 5-hidroxiflavans (Rf = 0,46 e 0,62 em cal; nenhuma detectada em tangerina). Essas bandas apareceram amarelas após a derivatização com AlCl₃ e apresentaram fluorescência amarelada sob iluminação UV de 366 nm. No entanto, nenhuma coloração visível foi observada antes da derivatização, como mostrado na Figura 5.

Para análise HPTLC, a derivatização por Folin-Ciocalteu (FC) fornece detecção abrangente de compostos fenólicos, embora possam ocorrer pequenas interferências. Além disso, a derivatização de cloreto de alumínio (AlCl₃) colore seletivamente um subconjunto de flavonoides. A aplicação combinada de ambos os reagentes melhora a padronização dos métodos e mitiga algumas das limitações inerentes a cada abordagem. Notavelmente, é improvável que um composto não flavonoide apresente tanto a coloração azul característica sob FC quanto a absorção amarelo-avermelhada sob AlCl₃. Além disso, cromóforos pré-existentes podem ser excluídos como interferências se visíveis com a mesma intensidade antes da derivização.

Como mostrado na Figura 5, o extrato de cal exibiu duas faixas em Rf 0,62 e 0,46, que não eram detectáveis na placa não desenvolvida, mas se tornaram claramente visíveis após a derivatização de Folin–Ciocalteu (FC) e AlCl₃. Esse comportamento reforça sua natureza flavonoide, possivelmente correspondendo à neoeriocitrina e à^{hesperidina 23}. Constituintes fenólicos adicionais foram observados em Rf 0,21 e 0,37 na cal, e em Rf 0,36, 0,39, 0,42, 0,46, 0,54 e 0,89 na tangerina. Essas faixas foram detectáveis após a derivatização por FC, mas não após o tratamento com AlCl₃, sugerindo que podem corresponder a compostos fenólicos não flavonoides. De acordo com a literatura, os principais fenólicos não flavonoides relatados na mandarina incluem ácido clorogênico e ácido trans-ferúlico^24,25. Na cal, outros compostos descritos anteriormente incluem ácido cumârico e ácido dihidroxiferúlico²³. No entanto, a confirmação dessas atribuições requer análise com padrões de referência adicionais.

Comparação de fases móveis HPTLC
Ambas as fases móveis foram desenvolvidas como uma modificação dos sistemas^{previamente relatados 26, 27, 28}. A fase móvel mais polar (MP1, Figura 6A) proporcionou uma separação superior dos constituintes fenólicos em comparação com MP2. Em contraste, a fase móvel menos polar (MP2) (Figura 6B) permitiu a retenção simultânea dos componentes da amostra e dos padrões de referência dentro da mesma execução cromatográfica. No entanto, sob condições de MP2, os valores de Rf dos constituintes da amostra eram relativamente baixos, com alguns compostos permanecendo próximos à origem, como mostrado na Figura 6. Para resolver essa limitação, foi implementado um procedimento de duplo desenvolvimento usando MP1 seguido de MP2. Essa estratégia garantiu melhor migração e resolução dos componentes da amostra, ao mesmo tempo em que permitiu quantificação contra padrões de ácido gálico na mesma placa sob condições cromatográficas idênticas. A quercetina apresentava uma coloração amarela tênue antes do tratamento com AlCl₃, que se intensificou após a derivatização. Para os extratos de cal e tangerina, duas faixas distintas foram observadas, além de uma faixa permanecendo na origem. Além disso, uma faixa amarela com valor Rf de 0,14 tornou-se claramente visível após a derivatização AlCl₃.

Figura 6: Placas HPTLC de cal, tangerina, ácido gálico e quercetina desenvolvidas com a fase móvel 1 (A) e a fase móvel 2 (B). Para cada placa, as trilhas da esquerda para a direita correspondem a: amostras desenvolvidas (não derivadas), derivatizadas por Folin–Ciocalteu e derivadas por AlCl₃. A visualização foi realizada sob iluminação de luz branca. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Discussão

A coleta e o armazenamento de amostras são etapas críticas para garantir a integridade das análises fitoquímicas. Após a coleta, as amostras devem ser transportadas sob condições de refrigeração e liofilizadas o mais rápido possível para minimizar a degradação. Embora materiais biológicos secos sejam geralmente estáveis, os extratos em solução são consideravelmente mais lábeis, mesmo quando armazenados sob refrigeração. Portanto, as determinações analíticas são preferencialmente realizadas em extratos recém-preparados. O armazenamento prolongado, mesmo por alguns dias sob condições de frio e proteção contra a luz, ou por algumas horas em temperatura ambiente, pode levar a mudanças observáveis nos perfis cromatográficos, incluindo alterações na intensidade da banda e na formação de precipitados. Essas mudanças estão tipicamente associadas a transformações químicas como oxidação, hidrólise ou reações de complexação. Consequentemente, todos os reagentes e extratos devem ser armazenados e manuseados em condições frias e escuras para preservar sua estabilidade química.

Ao comparar ambas as técnicas (Tabela 3 e Tabela 4), diferenças quantitativas sistemáticas são evidentes. Tanto na cal quanto na tangerina, os valores de TPC obtidos pelo ensaio de microplacas foram aproximadamente três vezes maiores do que os estimados pelo HPTLC. Na cal, o TPC foi de 74,2 mmol/g por microplaca contra 22,0 mmol/g DM pelo HPTLC, enquanto os valores de TFHC foram 15,5 mmol/g e 13,4 mmol/g, respectivamente. Na mandarina, o TPC atingiu 72,8 mmol/g por microplaca, comparado a 20,8 mmol/g pelo HPTLC. Para TFHC, o método de microplacas resultou em 6,0 mmol/g, enquanto nenhuma faixa correspondente foi detectada pelo HPTLC.

Essas discrepâncias podem ser explicadas pelas limitações intrínsecas e pelos mecanismos de resposta de cada método. Sabe-se que o ensaio Folin–Ciocalteu (FC) reage não apenas com compostos fenólicos, mas também com várias substâncias redutoras não fenólicas, incluindo ácido ascórbico, tirosina, ácido fórmico e ácido^{acético 29}, além de outros redutores de baixo peso molecular. Tais compostos contribuem para o sinal espectrofotométrico geral, potencialmente levando a uma superestimação da TPC. Além disso, constituintes fenólicos menores podem aumentar coletivamente a absorção total no ensaio de microplacas, mesmo que suas concentrações individuais sejam muito baixas para produzir bandas distintas e quantificáveis no HPTLC. Alguns metabólitos pequenos ou altamente polares também podem não ser retidos, resolvidos ou visualizados sob as condições cromatográficas empregadas.

Figura 7: Representação esquemática de complexos AlCl₃ formados com flavonóis e 5-hidroxiflavonas. (A) Flavonóis e (B) 5-hidroxiflavonas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Diferenças metodológicas na química de detecção contribuem ainda mais para as variações observadas. A reação FC produz um aumento substancial na absorção devido à redução do reagente, resultando em alta sensibilidade analítica. Em contraste, o método AlCl₃ é relativamente inespecífico e depende da formação de complexos com certos flavonoides. Flavonóis tipicamente apresentam absorção máxima em torno de 410 nm, enquanto 5-hidroxiflavonas absorvem perto de 440^{nm 18}, e seus complexos com Al³⁺ são ilustrados na Figura 7. No entanto, o aumento da absorção após a complexação é relativamente modesto, tornando o ensaio AlCl₃ mais suscetível à interferência de componentes da matriz colorida, incluindo os próprios flavonoides.

Apesar dessas limitações, o uso combinado da derivatização por FC e AlCl₃ no HPTLC representa uma estratégia complementar poderosa para análise fenólica. Essa abordagem combina a alta sensibilidade da reação de FC com a discriminação estrutural proporcionada pela complexação AlCl₃ e pela separação cromatográfica. Além disso, vários flavonóis são conhecidos por exibir faixas amareladas características sob iluminação UV³⁰, apoiando ainda mais a classificação e confirmação dos compostos.

Métodos de microplacas são particularmente vantajosos para a triagem de alta produtividade. Eles exigem preparação mínima de amostras, baixo consumo de reagentes e permitem a análise simultânea de dezenas de amostras. Em condições típicas de laboratório, um ensaio completo de microplacas pode ser realizado em aproximadamente 4 horas utilizando instrumentação amplamente disponível. Essas características tornam os ensaios de microplacas altamente adequados para estudos comparativos rápidos, controle de qualidade rotineiro e avaliação preliminar de grandes conjuntos de amostras. Em contraste, o HPTLC exige mais tempo e trabalho, com um fluxo de trabalho analítico completo que normalmente exige de 7 a 8 horas. Também depende de instrumentação especializada que pode não estar disponível em todos os laboratórios, e o uso de placas dedicadas e reagentes de derivatização aumenta o custo por análise. Outra limitação é que metabólitos presentes em concentrações muito baixas podem permanecer indetectáveis sob condições padrão de visualização. No entanto, essas limitações práticas e relacionadas à sensibilidade são compensadas pela principal vantagem da separação^{cromatográfica 30,31}. O HPTLC permite a resolução de constituintes individuais em matrizes complexas de plantas, confirmação de respostas genuínas ao ensaio e detecção de potenciais compostos interferentes. Além disso, a derivatização pós-cromatográfica seletiva permite a classificação direta dos compostos em grupos funcionais (por exemplo, flavonóis e 5-hidroxiflavonas), aprimorando a interpretação química além da estimativa total do conteúdo.

Assim, em estudos de grande escala, o fluxo de trabalho analítico pode começar com ensaios de microplacas para identificar rapidamente amostras com níveis elevados de compostos-alvo. Amostras selecionadas podem então ser submetidas à análise HPTLC para visualizar constituintes individuais, avaliar a seletividade e analisar possíveis interferências por meio da derivatização dual. Essa estratégia integrada (ilustrada na Figura 8) combina velocidade e capacidade de transferência com especificidade química e conhecimento estrutural.

Figura 8: Fluxo de trabalho proposto para triagem e análise de amostras. (A) Cribragem de microplacas de alta produtividade de um grande lote de amostras. (B) Análise HPTLC de amostras selecionadas para quantificação usando o método Folin–Ciocalteu e para identificação de flavonóis e 5-hidroxiflavonas por meio da derivatização de AlCl₃. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Comparado ao HPTLC, o HPLC acoplado à espectrometria de massa de alta resolução (HPLC–HRMS) — a alternativa mais comum relatada na literatura — oferece sensibilidade incomparável e identificação estrutural inequívoca de compostos^{individuais 32}. No entanto, as análises HPLC–HRMS são inerentemente mais lentas, pois cada execução cromatográfica deve ser realizada sequencialmente, e envolvem custos substancialmente maiores associados à instrumentação, requisitos de pureza do solvente e consumo de solvente. Além disso, a triagem de classe funcional frequentemente requer processamento complexo de dados e interpretação específica de compostos, enquanto o HPTLC permite o agrupamento visual direto dos compostos após a derivatização. Consequentemente, o HPTLC representa uma plataforma intermediária eficaz entre a triagem rápida de microplacas e a análise abrangente do HPLC–MS, equilibrando throughput, custo e seletividade química.

A análise de flavonoides e fenólicas tem amplas aplicações em ciência de alimentos, nutracêuticos, farmacêuticos, agricultura e pesquisa em materiais. Na ciência dos alimentos, é usado para avaliar a capacidade antioxidante, autenticidade, vida útil e controle de qualidade de produtos como sucos, vinhos e chás, além de apoiar estudos agronômicos, incluindo a determinação do tempo ideal de colheita com base na maturidade^{fenólica 33}. No setor nutracêutico, o perfil fenólico é essencial para a padronização e garantia de qualidade de extratos botânicos e produtos comerciais, como cápsulas de extrato de chá verde, suplementos de extrato de semente de uva, comprimidos de quercetina e formulações de bioflavonoides cítricos. Na pesquisa farmacêutica e biomédica, essas análises apoiam a triagem de compostos bioativos com potencial antioxidante, anti-inflamatório e^{antimicrobiano 6}. Na agricultura e fisiologia vegetal, a determinação fenólica ajuda a avaliar as respostas ao estresse das plantas e a orientar estratégias de melhoria das culturas. Além disso, na ciência dos materiais — particularmente em estudos de inibidores de corrosão derivados de plantas^34,35 — a caracterização fenólica ajuda a correlacionar a composição química com o comportamento de adsorção e a eficiência protetora.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos eppendorf de 1,5 mL	Eppendorf
Frascos volumétricos de 10 mL	Eisco Labs	CH0451B	10/19 Rolha de polipropileno, vidro borosilicato, âmbar - marca branca de graduação, tolerância e plusmn; 0,025 ml
100 & micro; L e 1000 & micro; Pontas L micropippette	genérico
100– 1000 & micro; Micropipeta L	Eppendorf	Research Plus
10– 100 & micro; Micropipeta L	Eppendorf	Research Plus
Tubos de vidro com tampa de 15 mL	genérico
Béqueres de 50 mL	genérico
Micropipeta multicanal de 8 canais	TermoSciecntífico
Microplacas de 96 poços	Greiner	655891	Policicloolefina, fundo de vidro, preto
Balanço analítico			± 0,0001 g
Sampler Automático de TLC	CAMAG	ATS4
Centrífuga	TermoSciecntífico	Sorvall ST8R	≥ 850 e vezes; g
Papel de filtro	Whatman		Para saturação de câmara
Liofilizador	LABCONCO	Modelo 10
Reservatórios de reagentes plásticos	Eppendorf
Espátula com Extremidade Plana e Extremidade de Colher	Produtos químicos da Merck	HS15906
Leitor de Microplacas de Multidetecção Synergy HT	BioTek Instruments	Sinergia HT
Placas de gel de sílica TLC 60 F254 com respaldo de alumínio (10 vezes 20 cm)	Merck
Pulverizador TLC	Sigma-Aldrich		20 mL
TLC Visualizer	CAMAG	2
Banho/limpador ultrassônico	Creworks	ZX-040	com controle de temperatura a 40 °C; C
Cordeiro UV	UPV	UVGL-58
Software VisionCATS	CAMAG
Sacos zip-lock	Genérico		1/4 de galão