Artigo de método

Perfilamento fenotípico de fenótipos comportamentais semelhantes ao parkinsoniano induzidos por MPTP em larvas de peixe-zebra com base em experimento comportamental

DOI:

10.3791/70041

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15 de maio de 2026

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1Department of Medicinal Chemistry, State Key Laboratory of Discovery and Utilization of Functional Components in Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2College of Information Engineering, Ningde Normal University, 3Digital Fujian Research Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing, 4Department of Neurology, Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 5Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, 6Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory

Neste artigo

Resumo

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Esse protocolo estabelece um paradigma de fenotipagem comportamental em larvas de peixe-zebra tratadas com MPTP para avaliar déficits motores e não motores, semelhantes à doença de Parkinson.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo apresenta um protocolo único e multiparamétrico de fenotipagem comportamental para a doença de Parkinson (DP) induzida por MPTP em larvas de peixe-zebra. A indução química de patologia semelhante à PD em peixes-zebra fornece um sistema de alta capacidade e geneticamente tratável, mas a maioria dos estudos tem focado estritamente em ensaios locomotores básicos ou transições simples luz-escuro. Essas abordagens limitadas não conseguem capturar o espectro mais amplo de disfunções relacionadas à DP, que vão desde bradicinésia e déficits sensorimotores até comportamentos semelhantes à ansiedade e distúrbios do sono. Para suprir essa lacuna, este estudo desenvolveu uma bateria integrada de 6 ensaios complementares: teste locomotor para avaliar a locomotoria geral e a condução exploratória; avaliação de tigmotáxia para detectar comportamentos de preferência de borda relacionados à ansiedade; teste de resposta ao sobressalto para registrar bradicinésia e reatividade motora comprometida; ensaios de desafio luz-escuro para avaliar a tomada de risco e a resposta ao estresse; paradigmas de resposta fotomotora (incluindo estimulação com luz estroboscópica) para quantificar o movimento sensorimotor e reflexivo; e monitoramento da regulação sono-vigília para medir o comportamento sono-vigília. Larvas de peixe-zebra são expostas a concentrações subletais de MPTP de 1 dia após a fertilização (dpf) até 5 dpf, com avaliações comportamentais iniciadas de 4 a 6 dpf. O rastreamento automatizado de alta resolução gera vários endpoints comportamentais por ensaio. Essa abordagem revela alterações semelhantes às DP previamente não detectadas, como arquitetura desordenada do sono, aprendizagem de habituação prejudicada, movimento sensorimotor e reflexivo, refletindo sintomas não motores iniciais. Ao combinar esses ensaios, os pesquisadores obtêm um sintoma comportamental abrangente que reflete mais de perto a complexidade da DP humana. Esse protocolo amplia o paradigma para estudar a patogênese da DP, triagem de terapêuticos candidatos e explorar moduladores ambientais. Exemplifica o objetivo da coleção de apresentar modelos animais inovadores que aumentem a relevância translacional por meio de fenotipagem robusta e multifacetada.

Introdução

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A doença de Parkinson (DP) é o segundo distúrbio neurodegenerativo mais prevalente, depois da doença deAlzheimer 1. Sua prevalência e o número de pessoas afetadas vêm aumentando de forma constante nos últimos anos, apresentando um desafio significativo de saúde públicaem todo o mundo 2. A taxa de incidência de DP aumenta notavelmente comos 3,4 anos de idade. Clinicamente, a DP se manifesta tanto por sintomas motores — como discinesia, bradicinesia, tremor em repouso e instabilidade postural — quanto por uma variedade de sintomas não motores, incluindo comprometimento cognitivo, ansiedade e distúrbios do sono. Atualmente, o diagnóstico de DP depende principalmente da presença de sintomas motores6; No entanto, quando esses sintomas se tornam evidentes, mais de 60% dos neurônios dopaminérgicos na substância negra já foramperdidos. Embora sintomas não motores frequentemente apareçam mais cedo, a ausência de critérios específicos e objetivos de avaliação complica o diagnóstico e a intervençãoprecoces 8. Atualmente, o tratamento principal para DP envolve a administração de levodopa9, que é convertida em dopamina no cérebro, repondo assim os níveis de dopamina no estriado. Embora esse tratamento possa aliviar temporariamente os sintomas, ele não interrompe a progressão dadoença 10. Consequentemente, pesquisas adicionais sobre a patogênese da DP e a triagem de drogas são essenciais.

Construir modelos animais adequados é crucial para a pesquisa sobre a patogênese da DP e o rastreamento de medicamentos anti-DP. Agora, existem três modelos principais para estudos de DP: modelo de indução química11, modelo de edição gênica12 e modelo de xenotransplantehumano 13. Animais modelo comumente usados incluem roedores, comocamundongos 14, e primatas não humanos comomacacos 15. Recentemente, o peixe-zebra (Danio rerio) tem ganhado cada vez mais atenção em estudos sobre DP por suas vantagens, como pequeno tamanho, crescimento rápido, alta homologia genética com humanos e embriõestransparentes 16. O uso da neurotoxina MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) para induzir dano ao neurôniodopaminérgico 17,18 é um método clássico para construir um modelo de DP. Peixes-zebra expostos a concentrações subletais de MPTP exibem vários fenótipos comportamentais semelhantes aoPD 19.

No entanto, a maioria dos estudos atuais sobre DP em peixe-zebra concentra-se principalmente em comportamentos locomotores básicos ou transições simples de luz paraescuridão 16,20, e ensaios comportamentais unidimensionais são difíceis de refletir totalmente as características comportamentais complexas da DP, especialmente as mudanças comportamentais na função não motora. Considerando que a DP é uma doença que envolve múltiplos sistemas neurocomportamentais além do controlemotor 21,22,23, um método de avaliação de fenótipos comportamentais multiparamétricos é urgentemente necessário para capturar seus fenótipos multissistémicos24.

Assim, este estudo constrói um protocolo de ensaio de fenotipagem comportamental múltiplo e rápido para descrever de forma mais abrangente os fenótipos comportamentais semelhantes à DP em larvas de peixe-zebra tratadas com MPTP. Uma dose subletal de MPTP (50 μM)25 foi aplicada às larvas de 1 a 5 dias após a fertilização (dpf)16,20,26. De 4 a 6 dpf16, 20, 24, realizamos 6 testes comportamentais: monitoramento de regulação sono-vigília, paradigmas de resposta fotomotora, avaliação de tigrotaxia, avaliação locomotora, teste de resposta ao sobressalto e ensaios de desafio luz-escuro. Essas avaliações comportamentais abrangem tanto aspectos motores quanto não motores, como déficits de movimento, sensoriomotor, aprendizado de habituação, assunção de riscos, resposta ao estresse e ritmo sono-vigília.

Utilizando o sistema de rastreamento de vídeo de alta produtividade Zebrabox e o método de análise quantitativa, extraímos e quantificamos vários parâmetros comportamentais e comparamos as diferenças comportamentais entre o grupo tratado com MPTP e o grupo do tipo selvagem (WT) por meio de estatísticas. Comparada aos ensaios existentes de PD com peixe-zebra, essa bateria comportamental multiparamétrica captura fenótipos motores e não motores dentro de um quadro padronizado. O sistema automatizado de rastreamento garante aquisição objetiva de dados comportamentais e alta reprodutibilidade. Além disso, o pequeno tamanho corporal das larvas permite que animais individuais sejam colocados em placas de múltiplos poços, possibilitando uma avaliação de alto rendimento. As vantagens acima são benéficas para analisar profundamente o mecanismo patológico da DP, rastrear os medicamentos ou compostos candidatos e explorar a influência de fatores ambientais na ocorrência ou desenvolvimento da DP.

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Protocolo

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Este estudo envolvendo peixe-zebra foi realizado em conformidade com as diretrizes institucionais para cuidados e uso de animais, e foi aprovado pelo Comitê Ético da Escola de Ciências Farmacêuticas da Universidade de Shandong (nº YXDW2025-0056). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação para o MPTP

  1. Prepare 1× meio E3 diluindo 100× solução original de E3 1:100 com água ultrapura (por exemplo, misture 5 mL de 100× E3 com 495 mL de água ultrapura para obter 500 mL de meio 1× E3).
    NOTA: Prepare o E3 médio fresco no dia do uso.
  2. Prepare uma solução de estoque de MPTP de 1 mM adicionando 5,0 mg de pó de MPTP a um tubo de centrífuga de 50 mL e adicionando meio E3 a um volume final de 25 mL (use o tubo da centrífuga como recipiente de mistura, mas não é necessária centrifugação). Rotule a solução como solução de estoque MPTP de 1 mM. Guarde a solução original no escuro.
  3. Preparação da solução MPTP de 50 μM: transferir 2,5 mL da solução estocada de MPTP de 1 mM para um recipiente limpo e diluir com 47,5 mL de meio E3 para obter um volume final de 50 mL em concentração final de 50 μM MPTP. A parte restante da solução original continuou armazenada no escuro.
    ATENÇÃO: O MPTP é uma neurotoxina potente e deve ser manuseado com extrema cautela. Sempre use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo luvas, jaleco e óculos de proteção. Descarte de resíduos MPTP de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança.

2. Preparação e agrupamento de embriões de peixe-zebra

  1. Selecione peixes-zebra adultos machos e fêmeas sexualmente maduros e realize reprodução controlada usando tanques de reprodução com divisórias removíveis. Às 20h, coloque machos e fêmeas de peixe-zebra separadamente nos aquários de reprodução na proporção de 2:3, e separe-os com divisórias.
  2. No dia seguinte, remova os divisores às 8:00 da manhã para permitir o acasalamento, iniciando assim a desova. Colete os embriões após 1 hora e lave-os três vezes com água limpa do sistema.
  3. Alojar embriões em placas de Petri de 100 mm com meio fresco E3, e incubá-los a 28 °C em um ciclo de 14 horas de luz / 10 horas de escuridade (luzes acesas das 08:00 às 22:00).
    NOTA: Não exceda 50 embriões por recipiente com 20 mL de meio para garantir o desenvolvimento normal.
  4. A 1 dpf, remova cuidadosamente os embriões não fertilizados, deformados e anormais usando uma pipeta Pasteur e substitua a solução contendo embriões de peixe-zebra. Para o grupo WT, substitua o meio existente por meio embrionário fresco E3. Para o grupo tratado com MPTP, substitua o meio por solução de MPTP de 50 μM (Figura 1A) e depois retorne ambos os grupos à incubadora.
  5. Para ambos os grupos, substitua a solução e remova quaisquer embriões mortos ou doentes a cada 24 horas. Para o grupo tratado com MPTP, substitua a solução de MPTP diariamente da manhã de 1 dpf até a manhã de 4 dpf (Figura 1A). Depois, faça a transição do grupo tratado com MPTP para o meio E3 a partir da manhã de 5 dpf até o final do experimento.
    NOTA: Substitua a solução suavemente usando uma pipeta Pasteur. Aspire o meio lentamente da borda da placa de Petri e adicione uma solução fresca ao longo da parede da placa de Petri para minimizar a perturbação dos embriões.

3. Monitoramento da regulação do sono e da vigília

  1. A 4 dpf, selecione larvas de peixe-zebra de cada grupo às 18h e transfira-as para uma placa de 96 poços usando uma pipeta Pasteur modificada de 3 mL com a ponta cortada, uma larva por poço (Figura 1B). As quatro primeiras linhas representam os grupos WT, e as quatro últimas representam os grupos MPTP (48 peixes-zebra em cada grupo).
    NOTA: Para evitar estimular ou danificar o peixe-zebra, modifique as Pipetas Pasteur cortando a ponta (10 mm) para proporcionar um diâmetro maior que o tamanho de 4 larvas de peixe-zebra dpf (comprimento corporal superior a 3,7mm 27,28).
  2. Observe cada poço com um microscópio estereoscópico para garantir que a aparência de cada larva de peixe-zebra esteja saudável, as nadadeiras estejam abertas e regularmente balançadas, o corpo esteja ereto e a bexiga natatória estejainflada até 29. Depois de garantir que os peixes-zebra em cada poço estejam em estado saudável, encha cada poço com meio E3.
    NOTA: Preencha cada poço com E3 de médio a quase protrusão, garantindo que a tensão superficial seja mantida. Adicione cuidadosamente o líquido para evitar bolhas e transbordamentos de poços.
  3. Após transferir o peixe e o líquido para uma placa de 96 poços, coloque-o na câmara Zebrabox para se aclimatar por 30 minutos antes do teste comportamental sono-vigília.
    NOTA: Antes de colocar a placa de 96 poços na câmara Zebrabox, limpe cuidadosamente a parte inferior da placa para evitar que a sujeira afete os resultados do rastreamento do vídeo.
  4. Abra o software de rastreamento de vídeo Zebralab, selecione o modo de quantização e certifique-se de que a placa de 96 poços esteja posicionada centralmente no fundo da câmara Zebrabox.
  5. Ajuste o ajuste da luz para apagar a luz às 22h00 e acenda a luz às 8h00, o que é consistente com as condições de luz quando o peixe-zebra é criado. Durante o dia, a luz branca geralmente fica em torno de 1000 lux. Defina os parâmetros do softwareda seguinte forma: 29: limiar de detecção, 40; burst, 25 (limite para o movimento); congelar (limiar para o movimento), 4; tamanho da caixa, 60 s; Tempo total de monitoramento, 52 horas (20h00 no primeiro dia até 00h00 do terceiro dia). Inicie o procedimento sono-vigília às 20h.
    NOTA: Uma vez iniciado o procedimento, proíba qualquer ruído e vibração externa durante todo o experimento, para não afetar o ritmo normal de sono-vigília dos peixes-zebra. Para evitar a evaporação da água durante o monitoramento de longo prazo, cubra a placa de 96 poços com filme plástico transparente.
  6. Após 52 horas, pare o experimento sono-vigília e salve o arquivo de dados. Remova a placa de 96 poços da ZebraBox.
    NOTA: Usando MATLAB e Excel, parâmetros necessários como número de períodos de sono (período de sono é definido como períodos de inatividade com duração mínima de 1 minuto)29, duração média dos períodos de sono (duração média dos períodos de sono), duração total do sono (toda a duração dos períodos de sono durante o período de monitoramento), latência do sono (tempo desde uma transição leve até o início do primeiro período de sono), Atividade média (definida como atividade locomotora durante todo o período de monitoramento) e atividade em vigília (definida como atividade locomotora apenas durante o período de vigília, excluindo os períodos de sono) foram extraídas e analisadas do arquivo de dados.
    1. Use o teste t do Estudante para comparar as diferenças entre o grupo WT e o grupo tratado com MPTP. Além disso, plote a curva do sono, a curva de atividade acordado e a curva média de atividade dos peixes-zebra ao longo das 52 horas usando o software MATLAB.

4. Paradigmas de resposta fotomotora

NOTA: Paradigmas de resposta fotomotora (incluindo luz estroboscópica) são testes comportamentais de alta capacidade em larvas de 5 dpf para quantificar mudanças locomotoras sensorimotoras e reflexivas em resposta a uma transição súbita de luz. Este teste foi realizado usando uma placa de 96 poços, incluindo 2 paradigmas: (1) uma transição da luz de 1 minuto de escuridão para 1 minuto de luz constante (1000 lx), e (2) uma resposta de luz estroboscópica envolvendo uma transição de 1 minuto de escuridão para 1 minuto de luz estroboscópica a 10 Hz.

  1. Coloque as 5 larvas de dpf em uma placa de 96 poços (1 larva por poço) (Figura 1B) e encha cada poço com meio E3. Divida um total de 96 larvas em grupo WT e grupo MPTP, em média.
  2. Paradigma de luz constante no escuro:
    1. Coloque a placa de 96 poços com 5 larvas de dpf na Zebrabox e permita que as larvas se aclimatem por 5 minutos no escuro antes do ensaio.
    2. Abra o modo de análise online de Rastreamento.
    3. Defina o programa de transição da luz da seguinte forma: 0-60 s: Escuro, 60-120s: Luz constante (1000 lx).
    4. Inicie o protocolo, colete parâmetros de movimento relacionados a cada 6 segundos durante o ensaio de 120 segundos.
    5. Pare o protocolo no 120s, exporte o arquivo de dados. Coloque as larvas na escuridão total por 5 minutos para se aclimatar ao ambiente, preparando-as para o próximo ensaio de luz escura-estroboscópica.
  3. Paradigma da luz escura-estroboscópia:
    1. Defina o programa de transição da luz da seguinte forma: 0-60 s: Escuro, 60-120s: luz estroboscópica (1000 lx) a 10 Hz.
      NOTA: Um estroboscópio de 10 Hz corresponde a 10 pulsos de luz por segundo. No ZebraLab, implemente isso alternando a intensidade da luz de 0 a 1000 lx a cada 100 ms.
    2. Após concluir a adaptação de 5 minutos de escuro, inicie o ensaio de luz escura para estroboscópia. Colete parâmetros de movimento a cada 6 segundos durante o ensaio de 120 segundos.
  4. Análise de dados: Quando o ensaio terminar, exporte o arquivo de dados. Use o software MATLAB para extrair a distância de natação a cada 6 segundos. Plote a distância total (valor médio por 6 s) nadada no período de 2 minutos para ambos os ensaios. Calcule o índice de congelamento subtraindo a distância total percorrida em 1 minuto no escuro da distância total percorrida naluz 30.
    NOTA: O Índice de Congelamento < 0 indica comportamento de congelamento; Índice de congelamento > 0 indica fuga; Índice de congelamento = 0 significa que não há reação. Use o teste t do Student e o ANOVA bidirecional para comparar as diferenças entre o grupo WT e o grupo tratado com MPTP. Um total de 48 larvas de peixe-zebra (n = 48) foram usadas para cada grupo.

5. Avaliação da tigmotaxia

  1. Selecione duas placas de 6 poços, encha cada poço com um médio E3 de 4 mL.
  2. Com 5 dpf, larvas de peixe-zebra do grupo WT e do grupo tratado com MPTP foram coletadas e colocadas em duas placas de 6 poços (uma é o grupo WT e a outra é o grupo tratado com MPTP, 1 larva por poço) (Figura 1C).
    NOTA: Certifique-se de que a posição inicial das larvas esteja no centro dos poços.
  3. Antes da avaliação da thigmotaxia, as placas do poço devem ser posicionadas na posição apropriada do Zebrabox com 15 minutos de antecedência para acomodar.
  4. Coleta e análise de dados: Usando a função Área de Desenho , desenhe dois círculos concêntricos na área de observação de cada poço (o raio do círculo central representa 1/2 do raio do furo) (Figura 1C), e os parâmetros restantes são definidos para serem os mesmos da avaliação locomotora. Inicie o protocolo para avaliação de tigmotaxia de 5 minutos e faça um experimento paralelo.
    NOTA: Após o término do programa, o software Zebralab gerará a trajetória das larvas de peixe-zebra em até 5 minutos e vários parâmetros de movimento relacionados. No arquivo de dados, an1 representa toda a área de cada poço, e an2 representa a zona interna de cada poço. Assim, dis(an1) total e dur(an1) total denotam a distância total de natação e o tempo total passado em todo o poço, enquanto dis(an2) total e dur(an2) total representam, respectivamente, a distância e o tempo passados na zona interna.
    1. Calcule a tigotase com as seguintes fórmulas:
      Calcule a porcentagem de distância nadada na zona externa:
      figure-protocol-1
      Calcule a porcentagem de tempo gasto na zona externa:
      figure-protocol-2
    2. Utilize o teste t do Estudante para comparar as diferenças de tigmotaxia entre o grupo WT e o grupo tratado com MPTP. Um total de 24 larvas de peixe-zebra (n = 24) foram usadas para cada grupo.

6. Avaliação locomotora

  1. A 5 dpf, selecionam larvas de peixe-zebra do grupo WT e do grupo tratado com MPTP, e transferem-se respectivamente para duas placas de 12 poços (uma é o grupo WT e a outra é o grupo tratado com MPTP, 1 larva por poço, com 2 mL de meio E3) (Figura 1D).
    NOTA: Certifique-se de que os tamanhos das larvas dos peixes-zebra sejam semelhantes, e as larvas selecionadas devem ter nadadeiras abertas, postura ereta, boa expansão da bexiga natatória e movimento regular.
  2. Antes da avaliação da locomotora, coloque a placa do poço na posição de teste do Zebrabox 15 minutos antes para se adaptar.
    NOTA: Certifique-se de que as condições de luz durante a adaptação sejam consistentes com as condições de luz durante o teste.
  3. Após um período de aclimatação de 15 minutos, selecione o modo de rastreamento - análise online, registre a atividade locomotora de cada larva por 5 minutos usando um sistema automatizado de rastreamento por vídeo computadorizado. Usando o software Zebralab para coletar trilhas de movimento e uma variedade de parâmetros locomotores relacionados a cada 60 s, exporte o arquivo de dados completo e use o MATLAB para analisar a distância total e a velocidade média de cada larva em 5 minutos.
    1. Use o teste t do Student e o ANOVA bidirecional para comparar as diferenças entre o grupo WT e o grupo tratado com MPTP. Um total de 24 larvas de peixe-zebra (n = 24) foram usadas para cada grupo.

7. Teste de resposta ao sobressalto

NOTA: Este teste mede a resposta visual de sobressalto (VSR), também conhecida como sobressalto induzido por clarão escuro, provocada por transições súbitas para a escuridão. Este teste de resposta ao sobressalto avalia um sobressalto visual evocado por fótica, induzido por flashes abruptos de escuridão em escala de milissegundos. Diferentemente do paradigma da luz escuro estroboscópico, que envolve pulsos de luz repetidos para avaliar respostas comportamentais sustentadas, este ensaio foca em reações motoras rápidas e reflexivas a um estímulo visual agudo.

  1. Preparações: a 5 dpf, selecione larvas de peixe-zebra do grupo WT e do grupo tratado com MPTP, e transfira-as respectivamente para duas placas de 12 poços (uma é o grupo WT e a outra é o grupo tratado com MPTP, 1 larva por poço, com 2 mL de meio E3) (Figura 1D).
  2. Antes do teste de resposta de surto, coloque a placa do poço na posição de teste do Zebrabox 5 minutos antes para se adaptar.
  3. Defina os parâmetros de estimulação: abra o software Zebralab , execute o modo de análise online de rastreamento , abra a interface de disparo de luz , selecione Usar um dos 3 métodos de disparo abaixo, ative Estímulos aprimorados, defina para Quando a sessão inicia; No cronograma de transição, o ritmo do flash escuro é definido da seguinte forma (o programa começa a disparar após 21 s): Transição 1: 5 ms, 100% de intensidade luminosa; Transição 2: 2890 ms, 100% de intensidade luminosa; transição 3: 5 ms, 0% de intensidade luminosa; transição 4: 100 ms, 0% de intensidade luminosa; marque Repetir lista de transições para garantir piscas periódicas.
  4. Protocolo iniciado: certifique-se de que a função de gravação de vídeo do Numeriscope esteja ativada, o rastreamento automatizado de alta taxa gerará um conjunto de dados multidimensional abrangendo 30 endpoints comportamentais neste teste dos anos 90.
  5. Análise de dados: Após concluir o ensaio de resposta de surpresa, exporte os arquivos brutos e importe-os para o software MATLAB para análise. Calcule a distância de natação de cada larva em intervalos de 3 s, junto com a velocidade média de natação.
    1. Identifique a distância máxima de movimento, velocidade máxima ou latência de resposta após o estímulo de flash para cada grupo. Use o teste t do Student e o ANOVA bidirecional para comparar as diferenças entre o grupo WT e o grupo tratado com MPTP. Um total de 24 larvas de peixe-zebra (n = 24) foram usadas para cada grupo.

8. Ensaio de desafio claro-escuro

  1. A 5 dpf, transfira as larvas do peixe-zebra individualmente para duas placas de 24 poços (Figura 1E), com uma larva por poço e 1 mL de meio E3 por poço. Cada placa continha 24 larvas, e as duas placas de 24 poços foram divididas igualmente no grupo WT e no grupo tratado com MPTP (n = 24 por grupo).
  2. Antes do teste, coloque a placa de 24 poços na área designada dentro do Zebrabox por um período de aclimatação à luz de 5 minutos para adaptar o ambiente de teste. Ative o modo Rastreamento-Análise Online. Configure o programa de luz da seguinte forma: 6 minutos de luz constante seguidos por 4 minutos de completa escuridão (Figura 1E). O tempo total de teste é de 10 minutos, e o intervalo para coletar pontos de dados é de 60 s.
    NOTA: Os 6 minutos globais de luz são para aclimatação e habituação, garantindo respostas locomotoras de base estáveis e luz e escuridãoespecial 31,32.
  3. Nodécimo minuto, pare o registro comportamental e os dados salvos. Remova cuidadosamente o prato da Zebrabox.
  4. Para cada larva, extraia a distância de natação a cada 60 segundos. Calcule a distância percorrida durante a fase de luz (0 a 6 min), a fase escura (7 th-10min) e o período total de 10 min. Quantifique o comportamento de timotáxia e o desempenho de aprendizagem por habituação na fase escura.
    NOTA: Aprendizagem por habituação é definida como a redução de uma resposta comportamental quando um animal é exposto a um estímulo/ambientecontínuo 33,34, e foi avaliada comparando estatisticamente a distância média total percorrida (mm) durante o primeiro e o quarto minuto após a transição da luz para a escuridão. Use o teste t do Student e o ANOVA bidirecional para comparar as diferenças entre o grupo WT e o grupo tratado com MPTP. Um total de 24 larvas de peixe-zebra (n = 24) foram usadas para cada grupo.

9. Descarte de resíduos MPTP

NOTA: Após cada experimento comportamental, borrife e limpe superfícies contatadas com MPTP (por exemplo, bancadas de laboratório e a ZebraBox) com hipoclorito de sódio recém-preparado (água sanitária; ≥10% v/v).

  1. Colete os resíduos líquidos (incluindo soluções de exposição restantes e meios de enxágue) e resíduos sólidos (por exemplo, pipetas Pasteur, luvas, placas de Petri e placas multipoços) do MPTP. Rotule-os claramente como resíduos neurotóxicos perigosos.
  2. Trate resíduos líquidos contaminados e materiais sólidos com hipoclorito de sódio recém-preparado (água sanitária; ≥10% v/v) por pelo menos 24 horas para garantir a descontaminação, seguido do descarte conforme as regulamentações institucionais.
  3. Eutanasie larvas de peixe-zebra tratadas com MPTP imergindo em uma solução diluída de hipoclorito de sódio (por exemplo, proporção 1:5 de 6% de água sanitária: água) por 5 min35. Morte confirmada por falta de movimento e batimento cardíaco. Trate as larvas e meios descontaminados como resíduos biológicos perigosos para descarte institucional (seguindo protocolos institucionalmente aprovados).

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Resultados

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Monitoramento da regulação sono-vigília
O monitoramento de regulação sono-vigília de 52 horas começou a 4 dpf e foi realizado usando uma placa de 96 poços. Peixe-zebra em casos tratados com MPTP apresentaram perturbações significativas na estrutura do sono em comparação com o grupo WT. Curvas representativas do sono, gráficos de atividade de vigília e traços de atividade médias são mostrados na Figura 2. Parâmetros da análise de regulação...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo desenvolveu e verificou um protocolo abrangente para avaliar e analisar fenótipo comportamental semelhante ao Parkinson induzido por MPTP. Esse protocolo integrou 6 testes diferentes: avaliação locomotora, ensaio de tigmotaxia, teste de resposta ao sobressalto, paradigmas de resposta fotomotora (incluindo estimulação com luz estroboscópica), ensaio de desafio luz-escuro e monitoramento da regulação sono-vigília, para avaliar e representar os defeitos motores e não motores da ...

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Divulgações

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Nº 21906095), do Programa de Futuro para Jovens Pesquisadores da Universidade de Shandong, da Fundação de Ciências Naturais de Shandong (Nº ZR2019BB018), os Fundos de Pesquisa Fundamental da Universidade de Shandong (nº 2017GN0030), a Fundação Científica de Pós-Doutorado da China (nº 2018M640640). Também conta com o apoio do Fundo de Pesquisa Aberta 2025 do Digital Fujian Institute of Big Data para Reabilitação e Enfermagem de Idosos (Grant No. BDRI202502) e o Fundo de Pesquisa Aberta 2025 do Laboratório Chave de Materiais Bioativos, Ministério da Educação, Universidade de Nankai (Bolsa nº SWHX-202503). Projeto de Pesquisa do Laboratório de Biomedicina Microecológica Jinan, Shandong (Bolsa nº JNL-2023002KF). Os autores gostariam de agradecer ao Centro de Animais de Laboratório, ao Hospital Qilu da Universidade de Shandong e ao Dr. Sun Chengxi, do Departamento de Laboratório Clínico do Hospital Qilu da Universidade de Shandong, pela assistência durante o experimento.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100 vezes; Solução padrão E3Feixi Biotecnologia de XangaiN/Acontendo 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl2 e middot; 2H2O, e 9,78 g de MgCl2· 6H2O por litro
Placa de Cultura Celular de 12 PoçosBiotecnologia NEST712011Não tratado, não pirogênico, estéril, poliestireno. Usado para ensaios comportamentais larvais de peixe-zebra
Placa de Cultura Celular de 24 PoçosBiotecnologia NEST702011Não tratado, não pirogênico, estéril, poliestireno. Usado para ensaios comportamentais larvais de peixe-zebra
Pipeta Pasteur de 3 mLBiologix30-0238A1
Placa de Cultura Celular de 6 PoçosBiotecnologia NEST703011Não tratado, não pirogênico, estéril, poliestireno. Usado para ensaios comportamentais larvais de peixe-zebra
Placa de Cultura Celular de 96 PoçosBiotecnologia NEST701011Não tratado, não pirogênico, estéril, poliestireno. Usado para ensaios comportamentais larvais de peixe-zebra
MATLAB R2020aMathWorks, EUA & nbsp;N/AMATLAB R2020a, licença para todo o campus obtida no portal de software da Universidade de Shandong (softms.sdu.edu.cn). Usado para análise estatística de dados comportamentais larvais de peixe-zebra.
Microsoft ExcelMicrosoftN/AMicrosoft Excel (parte do Microsoft Office), versão instalada pelo portal de software licenciado da Universidade de Shandong (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina) Beyotime411252815 mg
Placa de PetriBiotecnologia NEST704202100 mm, estéril, alça de fácil pegada, tratado com TC
Solução de hipoclorito de sódioMacklinS817439solução de água sanitária doméstica de origem original (base cloro ativa de 6-14%), diluída a ≥ 10% v/v para descontaminação de superfícies e resíduos; também diluído 1:5 (6% de água sanitária: água) para eutanásia de larvas de peixe-zebra tratadas com MPTP.
Microscópio EstereoscópicoOlympusSérie SZX2
Sistema de Rastreamento de Vídeo de Alta Resolução Zebrabox  Ponto de Vista, França & nbsp;N/A
Zebralab Software Ponto de Vista, França & nbsp;N/AVersão (3,52,3,87)

Referências

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