Artigo de método

Gravações de Fotometria Multifibra em Duas Cores da Rede de Comportamento Social em Camundongos

DOI:

10.3791/70049

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17 de março de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Princeton Neuroscience Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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A fotometria de fibras é uma das técnicas mais comuns usadas para registrar a atividade de cálcio em populações neurais profundas do cérebro. Aqui, descrevemos um protocolo para imagens personalizáveis em duas cores multisite da atividade do cálcio e outros sinais fluorescentes dinâmicos provenientes de populações neurais profundas do cérebro em camundongos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A fotometria por fibra, o registro em massa de sinais por meio de um cabo de fibra óptica, é um método útil para registrar a atividade do cálcio de grupos de neurônios no roedor em movimento livre. Em particular, esse método torna o alvo de pequenas populações de neurônios geneticamente especificados em áreas mais ventrais e menos acessíveis do cérebro um problema tratável, já que continua sendo difícil registrar em resolução celular. Essa técnica pode ser escalada para registrar em múltiplos locais simultaneamente usando uma abordagem multifibra agrupada e pode atingir múltiplos tipos celulares usando estratégias genéticas em cada local registrado. Aqui, fornecemos um protocolo para construir e inserir arrays multifibra personalizados para direcionar a rede de comportamento social do mouse (até 12 sites). Este protocolo detalha os procedimentos cirúrgicos necessários para o alvo bem-sucedido de múltiplos locais usando nossas matrizes multifibras personalizadas e a abordagem viral para a entrega de indicadores fluorescentes de atividade do cálcio com deslocamento verde e vermelho para imagens simultâneas de duas populações neurais geneticamente identificadas em cada local. Demonstramos como gravar dessas regiões usando um sistema de câmeras CMOS (semicondutores complementares) comercialmente disponíveis durante o comportamento social. Além disso, esse protocolo demonstra métodos para controle de qualidade e detalha um pipeline de pré-processamento para correção de ruído e padronização. Por fim, discutimos algumas possíveis aplicações da ferramenta para descobrir descobertas inovadoras sobre redes cerebrais em grande escala.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A fotometria de fibra, o registro em massa de sinais fluorescentes por meio de cabos de fibra óptica, surgiu como uma técnica poderosa para medir a atividade neural populacional em regiões profundas do cérebro. Frequentemente, essas regiões não são facilmente acessíveis com microendoscopia ou abordagens eletrofisiológicastradicionais 1,2,3. Um dos principais objetivos da neurociência de sistemas contemporânea é identificar e desvendar os cálculos empregados por redes cerebrais em grande escala, específicas de tipos celulares, envolvidas na geração de comportamentos. Sondas neuropixel e ferrules multifibras comercialmente disponíveis se destacam em registrar de populações neurais linearmente alinhadas 4,5,6,7, enquanto imagens corticais de campo amplo oferecem excelente cobertura da dinâmica corticalsuperficial 8,9. No entanto, registrar simultaneamente populações neurais subcorticais espacialmente dispersas, mas funcionalmente conectadas, tem permanecido tecnicamentedesafiador 5,10,11,12. Além disso, embora seja possível direcionar múltiplas estruturas profundas do cérebro usando múltiplas ferrules de fibra única para fotometria, essa abordagem é limitada a populações neurais suficientemente distadas umas das outras para que múltiplas ferrules sejamimplantadas 12. Matrizes de fotometria multifibra sob medida preenchem essa lacuna ao permitir gravações simultâneas de muitas regiões subcorticais em animais que se comportam livremente com restrições mínimas, proporcionando uma janela única para a coordenação em nível de rede durante comportamentos complexos.

A rede de comportamento social (SBN) representa um sistema ideal para investigar dinâmicas de redes cerebrais em larga escala. A SBN é um conjunto densamente interconectado e evolutivamente conservado de estruturas subcorticais envolvidas na geração do comportamento social, identificadas em todas as classes devertebrados 13, 14 e 15. Essas estruturas tradicionalmente incluem, mas não se limitam a, o septo lateral, área pré-óptica, núcleo do leito da estria terminal, núcleos hipotalâmicos anteriores e ventromediais, amígdala medial, núcleo accumbens e cinzaperiaqueductal 13,14,15. Dentro do SBN, populações neurais específicas definidas por marcadores moleculares desempenham papéis críticos na regulação do comportamento social. Os neurônios do ácido Σ-aminobutírico (GABAérgico) do SBN (marcados pela expressão do transportador vesicular GABA, ou VGAT) e os neurônios glutamatérgicos (marcados pela expressão do transportador de glutamato vesicular, ou VGlut) representam os principais tipos celulares excitatórios e inibitórios dentro da rede e provavelmente desempenham papéis dissociáveis na modulação da açãosocial 16,17,18,19 . Além desses sistemas clássicos de neurotransmissores, a sinalização hormonal sexual desempenha um papel fundamental no funcionamento da rede. Por exemplo, muitos comportamentos sociais masculinos e femininos requerem a expressão do receptor alfa do receptor de estrogênio, e a atividade nos neurônios do SBN que expressam esses receptores impulsiona causalmente essescomportamentos 16,20,21,22,23,24,25,26. Além disso, as populações neurais de SBN são enriquecidas com ligandos e receptores de muitos sistemas neuromoduladores, incluindo dopamina, arginina vasopressina, ocitocina, opioides, taquiquinina, neuropeptídeo Y, prolactina, orexina, peptídeo relacionado a agoutinas, melanocortinas, kisspeptina e hormônio liberador degonadotropina 17,18,19,27,28,29,30.31, e avanços recentes em sensores geneticamente codificados agora permitem o rastreamento de muitas dessas moléculas de sinalização diversas 32,33,34,35,36,37,38. Como as populações neurais de SBN estão espacialmente dispersas por estruturas subcorticais, preparações experimentais tradicionais (por exemplo, eletrofisiologia extracelular, imagem de superfícies corticais e abordagens anteriores para fotometria multifibra) não conseguem capturar a dinâmica de atividade momento a momento nessa rede cerebral em grande escala. No entanto, ao monitorar a dinâmica do cálcio em populações neurais geneticamente definidas junto com padrões de liberação de neuromoduladores, plataformas personalizadas de fotometria de fibras multisite podem revelar quais tipos celulares específicos e moléculas de sinalização codificam características específicas do comportamento social, fornecendo novos insights mecanicistas.

Aqui, desenvolvemos uma plataforma personalizável para fotometria de fibra multisite e bicolor, que permite gravação simultânea de até 12 regiões cerebrais em camundongos que se comportam livremente. Usando essa abordagem, realizamos registros fotométricos em duas cores da atividade do cálcio em 22 populações neurais identificadas distribuídas por 11 regiões cerebrais da SBN, juntamente com medições das flutuações de dopamina no núcleo accumbens com um sensor DA baseado em ativação de GPCR (GRAB-DA1m)33 (Tabela 1). Este protocolo (Figura 1) detalha a construção de matrizes multifibras personalizadas, procedimentos cirúrgicos para direcionar múltiplos locais profundos do cérebro, estratégias de entrega viral para expressão de indicadores duplos de cálcio (GCaMP39 e RCaMP40), aquisição de dados usando um sistema de fotometria de fibra baseado em câmera CMOS comercialmente disponível, métodos de controle de qualidade e um pipeline de pré-processamento para correção de ruído e padronização de sinais. De forma crucial, nosso pipeline de pré-processamento incorpora gravações de comprimento de onda de controle isosbestico que nos permitem realizar correções de artefatos de movimento. Adotamos uma abordagem baseada em regressão41 para corrigir artefatos de movimento, garantindo fidelidade do sinal durante comportamentos sociais vigorosos, como montar ou lutar. Como nosso método personalizado de fotometria multifibra pode monitorar simultaneamente a atividade dispersa tanto nas estruturas cerebrais profundas proximal quanto distal, mantendo a especificidade celular das gravações por meio do direcionamentogenético 42,43, ele oferece vantagens significativas em relação a abordagens alternativas para registrar a dinâmica da atividade neural em redes cerebrais profundas e em grande escala.

Esse protocolo é ideal para experimentos que exigem registros simultâneos de regiões subcorticais do cérebro espacialmente dispersas (≥4 sítios) em animais que se comportam livremente, especialmente ao investigar dinâmicas em nível de rede entre tipos celulares geneticamente definidos ou ao acompanhar a liberação de neuromoduladores junto com a atividade neural. A abordagem é especialmente valiosa para estudar comportamentos naturalistas envolvendo movimento vigoroso (por exemplo, interações sociais), onde nosso pipeline de correção de artefatos de movimento garante a fidelidade do sinal. No entanto, pesquisadores que buscam resolução de célula única, distinção entre sinais somáticos e axônicos, ou registros de regiões corticais superficiais podem achar abordagens alternativas (por exemplo, microscopia em miniatura, neuropixels ou imagem de campo amplo) mais apropriadas. Considerações práticas chave incluem complexidade cirúrgica, necessidade de fabricação personalizada de matrizes multifibra e o estabelecimento da infraestrutura de materiais necessária (capacidades de impressão 3D, ferramentas de fibra óptica).

Protocolo

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NOTA: Este protocolo foi testado e validado em camundongos adultos entre 8 e 25 semanas. Os camundongos foram alojados a 21–26 °C e umidade de 30%-70% em um ciclo de luz escura invertida de 12 horas (DESLIGADO: 10:00; ON: 22h). Os experimentos ocorreram exclusivamente durante a fase subjetiva ativa (escura). Comida e água foram fornecidas ad libitum. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Princeton e estavam de acordo com os Padrões dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Fabricação de Matrizes Multifibra e Cabos de Conexão (Figura 1A)

  1. Fabricar cabo de conexão (Figura 2A).
    1. Obtenha um cabo de conexão de 12 ramificações de fibra e imprima o conector de cabo fornecido e os acessórios de perfuração estereotáxica (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3) usando resina (resistência à tração: 8,7 quilolibras/polegada quadrada [ksi], módulo e: 377 ksi, deflexão térmica: 138 °F, alongamento: 8%).
    2. Construa o disco de polimento fornecido (Arquivo Suplementar 4) com uma haste de aço inoxidável de 2 polegadas de diâmetro e inclua um recorte do tamanho da matriz multifibra no centro do disco.
    3. Limpe manualmente o excesso de resina dos furos do pino do cavilho na matriz multifibra com uma broca de 1,22 mm x 11 mm. Mesmo com impressão 3D de precisão, os furos dos pinos do cavilho são um pouco pequenos demais para o cabo passar.
    4. Fure furos de fibra atravessantes.
      1. Insira pinos de cavilha de aço liga (1,19 mm x 12,7 mm) em todos os 4 furos do acessório de perfuração estereotáxica e coloque o conector do cabo de remendo com a parte inferior para cima no acessório de perfuração estereotáxica, com os pinos de cavilha passando pelos furos do pino de cavilha do conjunto multifibra.
      2. Aperte os parafusos M4 tamanho nos furos roscados para fixar o conector do cabo de conexão no lugar e fixar o acessório de perfuração estereotáxica na estrutura estereotáxica.
      3. Insira uma broca de 0,25 mm x 5,5 mm na broca estereotáxica e monte a broca na estrutura estereotáxica. Usando essa broca, nivele a guinada, o passo e o rolamento da matriz multifibra com uma tolerância máxima de desvio de ±0,03 mm.
        NOTA: Nivelar guinada e inclinação nas posições mais anteriores e posteriores da impressão 3D, nivelar o rolo nos quatro cantos da matriz multifibra.
      4. Centralize a perfuração acima de um dos furos de fibra impressos em 3D e defina as coordenadas estereotáxicas X/Y do quadro estereotáxico para as coordenadas ML (X) e AP (Y) da região cerebral associada (Tabela 1). Mova a broca para as novas coordenadas (0, 0) na estrutura estereotáxica para centralizar a furadeira acima do furo de passagem do pino do cavilho anterior.
      5. Use a broca de 0,25 mm x 5,5 mm para perfurar cada furo de fibra até uma profundidade de 5,5 mm nas coordenadas estereotaticamente definidas (Tabela 1).
        NOTA: Use um pedaço longo de fibra excedente para verificar se todos os furos estão totalmente vazios antes de remover a matriz multifibra do quadro estereotáxico. Isso limitará o número de vezes que o array multifibra precisará ser nivelado e perfurado para limpar os furos de passagem.
    5. Anexe o conector do cabo de conexão e o cabo de ração ramificado
      1. Expõe >10 cm das fibras do cordão de remenso. Corte as fibras com um gravador para garantir que tenham o mesmo comprimento. Depois, coloque uma peça de tubo termorretral de 3/16" e 5/16" ao redor das 12 fibras do cordão de conexão.
        NOTA: O tubo protege quaisquer fibras expostas depois que elas forem coladas no conector.
      2. Insira cada fibra em um dos furos passageiros do conector do cabo de conexão de modo que aproximadamente 0,3 mm de fibra fique exposto na superfície inferior. Após inserir todas as fibras, use uma ponta de agulha de 21–27 G para aplicar supercola na superfície superior do conector do cabo de conexão para fixar as fibras no lugar.
      3. Aplique epóxi na superfície superior do conector do cabo de conexão em formato de pirâmide de 0,5 a 1 cm de altura. Certifique-se de que nenhum epóxi cubra qualquer área além da superfície superior onde as fibras foram inseridas. Deixe o epóxi curar em temperatura ambiente durante a noite.
      4. Use uma pistola de ar quente na configuração mais baixa para encolher o tubo termoretrátil sobre a resina epóxi e a fibra exposta acima dele (<3–5 cm).
        NOTA: Evite tocar no tubo termoretrátil durante isso para evitar queimaduras.
      5. Corte um pedaço de tubo de plástico macio com 3 mm de diâmetro interno ao comprimento das fibras expostas restantes, corte uma fenda ao longo da borda do tubo e envolva a fibra exposta restante dentro do tubo.
      6. Colore o tubo transparente com um marcador preto opaco para garantir que as fibras não fiquem mais visíveis, minimizando a iluminação da fibra exposta durante os experimentos de imagem.
    6. Polia o cabo de conexão.
      1. Prenda o conector do cabo de remendo na superfície inferior do polimento personalizado. Polir o conector do cabo de remendo em folhas de polimento de 6 μm, 3 μm, 1 μm e depois com granulação de 0,01 μm com 10–20 movimentos no formato do símbolo/folha do infinito. Para as folhas de grão de 1 μm e 0,01 μm, coloque 5 gotas de água destilada antes do polimento.
      2. Limpe a superfície do conector para eliminar o excesso de água destilada. Verifique se há manchas ou rachaduras na superfície polida do conector do cabo de remendo usando um microscópio de campo claro e, se houver, repita o polimento.
    7. Verifique a saída do cabo de conexão.
      1. Conecte a extremidade do conector Sub-miniature versão A (SMA) do cabo a um sistema de fotometria de fibra baseado em câmera CMOS. Usando um software de codificação visual, siga o manual do sistema de fotometria e imagem e foque a câmera CMOS na extremidade SMA do cordão de conexão.
        NOTA: O manual é atualizado regularmente para alinhar com as atualizações de software. Como o código visual do sistema de fotometria frequentemente muda com novos lançamentos de software, este manual contém as informações mais atualizadas para os lançamentos de software atuais.
      2. Meça a saída de cabo de conexão de 470 nm a 20% de potência com um medidor óptico. Repita o passo 1.1.7 se a saída do patchcable for < 2,5 mW.
  2. Fabricar matriz multifibra.
    1. Imprima o array multifibra fornecido (Arquivo Suplementar 5, Arquivo Suplementar 6) usando resina com as especificações técnicas descritas na etapa 1.1.1.
    2. Prepare a matriz multifibra.
      1. Insira porcas hexagonais M0.6 de latão em cada uma das quatro ranhuras nos cantos laterais da matriz multifibra e alinhe o furo da porca hexagonal no centro da abertura.
      2. Aplique uma gota de supercola do lado de cada ranhura de porca hexagonal com uma ponta de agulha de 21–27 G, adicionando gotas adicionais para reforço se necessário. Deixe a cola secar em temperatura ambiente por 5 minutos antes de passar para a próxima etapa.
      3. Raspe qualquer cola nas laterais da matriz multifibra usando uma lâmina de barbear para garantir que caiba no disco de polimento.
      4. Se o excesso de supercola secar no lado da superfície da matriz multifibra, polia a superfície da matriz multifibra usando o disco de polimento personalizado e folhas de polimento com granulação de 30 μm até que a cola seja removida e a superfície da matriz multifibra fique plana.
      5. Remova manualmente o excesso de resina dos furos do pino de cavilha na matriz multifibra com uma broca de 1,22 mm.
    3. Perfure furos de fibra atravessantes (Figuras 2B-C).
      1. Insira pinos de cavilha de aço liga (1,19 mm x 12,7 mm) em todos os 4 furos de pinos do acessório de perfuração estereotáxica e coloque o conjunto multifibra do lado da superfície (lado plano) para cima no acessório de perfuração estereotáxico, com os pinos de cavilha passando pelos furos do pino de cavilha do conjunto multifibra.
      2. Repita o passo 1.4.2 – passo 1.4.5.
    4. Prepare as fibras para a matriz multifibra.
      1. Remova a carcaça plástica de uma seção de fibra óptica de 200 μm, 0,39 NA usando um decapador de fibra. Limpe a fibra com etanol.
      2. Corte as fibras em seções de ~3–5 cm de comprimento usando um cutelo. Corte ainda essas seções ao meio usando um gravador de fibra. Use um microscópio de campo claro para garantir que pelo menos uma extremidade das seções cortadas esteja sem lascas ou imperfeições. Use apenas fibras com pelo menos uma ponta sem manchas.
      3. Coloque uma régua precisa de pelo menos 15 mm de comprimento sob o microscópio de campo claro. Coloque o lado não manchado da fibra na posição 0 mm da régua (Figura 2D). Corte as fibras até o comprimento desejado para cada região-alvo (Tabela 1).
        NOTA: O comprimento da fibra é calculado adicionando 6 mm à coordenada estereotáxica D/V para a fibra mais profunda, e então ajustando esse valor para todas as fibras para corresponder à diferença entre sua coordenada D/V e a coordenada D/V da fibra mais profunda.
    5. Insira fibras na matriz multifibra.
      1. Coloque o array multifibra no suporte de fabricação com a superfície para baixo. Alinhe e fixe a peça usando pinos de cavilha.
      2. Ajuste o comprimento da fibra ao local (Tabela 1) e insira fibras cortadas nos furos apropriados na matriz multifibra, com o lado sem marcas voltado para cima. Certifique-se de que todas as fibras sejam empurradas até o fundo antes do próximo passo.
      3. Aplique supercola com uma ponta de agulha de 21–27 G para colar todas as fibras no lugar. Deixe a cola agir por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente antes de continuar.
    6. Polir o array multifibra repetindo o passo 1.1.6 com o array multifibra lado para baixo (Figura 2E).
    7. Verifique a eficiência do array multifibra.
      1. Limpe a superfície polida da matriz multifibra com etanol e depois aplique gel de correspondência de índice nela. Insira 4 pinos de varilha no conector do cabo de reposição e fixe a matriz multifibra nela usando parafusos de acionamento G5 e chave de fenda associada (Figura 2F).
      2. Use um medidor de potência para medir a emissão de LEDs de 470 nm e 560 nm do conjunto multifibra. Eficiência de cálculo usando estes valores:
        figure-protocol-1
      3. Se a eficiência for <75%, repita os passos 1.2.7.1–1.2.7.2.
        NOTA: Se o polimento não melhorar a eficiência e não houver manchas nas fibras, é possível que as fibras do conjunto multifibra estejam desalinhadas em relação ao conector do cabo de conexão.
    8. Prepare a matriz multifibra para uso (Figura 2G).
      1. Insira 4 pinos de cavilha nos furos de passagem do array multifibra. Certifique-se de que os pinos do bastão não fiquem mais de 1mm para fora do lado do cérebro do conjunto multifibra.
      2. Coloque a supercola do lado do cérebro nos pinos do cavilho. Deixe a cola secar por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente antes de usar a matriz multifibra.

2. Cirurgia (Figura 1B)

  1. Prepare o espaço cirúrgico e as ferramentas.
    1. Limpe a estrutura estereotáxica para garantir uma área de trabalho asséptica.
    2. Obtenha sutura estéril e absorvível.
    3. Autoclave: um par de pinças finas, tesouras finas e dois grampos bulldog.
    4. Certifique-se de que o vaporizador esteja cheio de isoflurano. Certifique-se de que o tubo para as linhas de isoflurância, vácuo e oxigênio esteja firmemente conectado ao vaporizador, à câmara de indução e ao cone de nariz da estrutura estereotáxica.
  2. Obtenha os vírus adeno-associados jRCaMP1b, GCaMP6f e GRAB-DA1m.
    ATENÇÃO: Sempre use equipamentos de proteção individual ao manusear vírus.
    1. Dilua vírus até uma concentração de trabalho entre 1x10,13 e 4x10,13 partes/mililitro, se necessário.
    2. Prepare uma mistura 1:1 dos vírus adenoassociados jRCaMP1b e GCaMP6f.
    3. Coloque uma aliquota da mistura viral 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f e uma aliquota do vírus GRAB-DA1m sobre o gelo para manter a temperatura em 4 °C.
  3. Induza anestesia.
    1. Coloque o mouse na câmara de indução e feche a porta da câmara. Inicie o fluxo de oxigênio para o vaporizador a 1 L/min.
    2. Direcione o fluxo de gás para a câmara de indução e ligue a linha de vácuo para remover o excesso de gás da câmara. Ajuste o vaporizador para uma concentração de isoflurano entre 3% e 5%.
  4. Transfira o mouse para o quadro estereotáxico.
    1. Quando a respiração do mouse diminuir para 1 respiração/s, mova o mouse para o quadro estereotáxico. Prenda os incisivos frontais do rato na ranhura da bocal do cone do nariz e aperte o cone sobre o nariz do rato.
    2. Inverta o fluxo de gás para o quadro estereotáxico com a concentração de isoflurano ajustada para 1%–2% para manter a anestesia. Troque a linha de vácuo para remover gás do cone do nariz.
      NOTA: Monitore a respiração do camundongo durante toda a cirurgia e ajuste a concentração de isoflurano conforme necessário para manter anestesia profunda com uma frequência respiratória de 1/s. A anestesia profunda deve ser confirmada periodicamente durante a cirurgia, garantindo que o camundongo não responda a uma pinçada no dedo do pé.
    3. Ajuste o sistema de aquecimento para manter uma temperatura corporal de 35 °C e aplique pomada óptica nos olhos do rato para evitar que ressecem.
    4. Insira barras auriculares estereotáxicas para que elas pressionem de cada lado do crânio, levemente dorsal e anterior aos canais auditivos. Aperte as barras auriculares e garanta que o crânio do rato esteja fixo no lugar aplicando uma pressão suave no topo da cabeça do rato.
  5. Prepare o couro cabeludo para a incisão.
    1. Apare ou raspe o pelo no topo da cabeça do rato até que fique curto. Aplique gel depilador no topo da cabeça do rato e deixe agir por aproximadamente um minuto. Remova o gel restante com um cotonete limpo.
    2. Repita 2.5.1 conforme necessário até que todos os pelos no topo da cabeça tenham sido removidos.
    3. Desinfete a pele no topo da cabeça usando cotonetes para aplicar betadine (solução 10% de povidona-iodo) seguida de solução de etanol a 70%.
  6. Expõe o crânio.
    1. Corte uma incisão ao longo da linha média do crânio, estendendo-se do ligeiramente posterior do lambda até um pouco anterior da veia rhinal rostral.
      NOTA: A veia rhostral renar é o vaso sanguíneo que fica na superfície dorsal do cérebro, entre o bulbo olfatório e o córtex pré-frontal.
    2. Corte e remova a pele raspada ao redor dos lados dessa incisão para formar um corte em forma de gota que expõe os ossos parietal, a ponta anterior do osso intraparietal e a porção dos ossos nasais anterior à veia rena rostral (Figura 2H).
    3. Limpe suavemente a superfície do crânio com solução salina 0,9% e um cotonete limpo.
  7. Nivele o crânio.
    1. Localize onde a veia renar rostral encontra a sutura sagital. Marque esse ponto com uma lâmina de bisturi estéril.
    2. Insira uma broca de carboneto #92 na broca estereotáxica e monte a broca na estrutura estereotáxica. Use o manipulador estereotáxico para posicionar a ponta da broca na superfície do crânio no ponto marcado e zerar as coordenadas X, Y e Z da broca.
    3. Nivele o passo do crânio medindo a profundidade Z no ponto marcado e -8,25 mm posterior a ele. Nivelar o guinada do crânio medindo a distância lateral entre o ponto marcado e a posição -8,25 posterior. Nivele o rolamento medindo a profundidade Z nas posições ±2,0–2,5 mm a partir da linha média nas posições -2,0, -4,5 e -7,0 mm em relação ao ponto marcado.
  8. Realize craniotomias e duratomias.
    1. Substitua a broca por uma broca de carboneto #76 ou #78. Zere a broca na posição marcada na junção da sutura sagital, veia rhinal rostral e superfície do crânio.
    2. Mova a broca para as coordenadas A/P e M/L de cada região cerebral (Tabela 1). Em cada local, faça uma craniotomia e remova cuidadosamente a dura-máter em cada craniotomia usando uma ponta de seringa vazia de 27G ou menor.
  9. Injete o vírus.
    1. Puxe micropipetas de vidro de modo que a ponta afunile por pelo menos 7 mm e tenha uma abertura da ponta de 10–30 μm.
      NOTA: Reinicie os passos 2.9.2–2.9.12 se a micropipeta contiver bolhas de ar após qualquer uma das etapas seguintes.
    2. Encha uma ponta de micropipeta de vidro vazia com óleo mineral. Insira e fixe a ponta da micropipeta no injetor de nanolitros. Use a interface do injetor nanolitro para ejetar o máximo possível de óleo mineral da micropipeta.
    3. Monte o injetor de nanolitros na estrutura estereotáxica. Corte um pequeno pedaço de chapa de cera de parafina e coloque na cabeça do rato.
    4. Pipete 1 μL da mistura do vírus jRCaMP1b:GCaMP6f sobre a cera de parafina. Abaixe a ponta do injetor de nanolitros para que a ponta da micropipeta de vidro fique na mistura do vírus e preencha a micropipeta com vírus usando a interface do injetor.
    5. Repita 2.9.4 até que todos os vírus usados tenham sido transferidos para o injetor de nanolitros (Tabela 1). Remova e descarte a cera de parafina em um recipiente de resíduos de risco biológico.
    6. Zere a ponta da micropipeta do injetor na posição marcada na junção da sutura sagital, veia rena rostral e superfície do crânio.
    7. Começando pelo local de injeção mais ventral a mais dorsal (Tabela 1), mova a ponta da micropipeta para cada local, abaixe-a até tocar a superfície cerebral e zere a posição Z no quadro estereotáxico.
    8. Em cada local, abaixe a ponta da micropipeta para dentro do cérebro até que ela fique 0,1 mm ventral em relação ao local da injeção. Em seguida, eleve a ponta da micropipeta 0,1 mm até o local final da injeção. Deixe o tecido ao redor se acomodar ao redor da ponta da micropipeta por 30 segundos.
    9. Usando a interface do injetor de nanolitros, injete 300 nL da mistura 1:1 do vírus jRCaMP1b:GcaMP6f a uma taxa de 1–2 nL/s para dispersar a mistura no local atual de injeção.
    10. Deixe a ponta da micropipeta permanecer no local da injeção por pelo menos 5 minutos após a conclusão da injeção. Eleve lentamente a ponta da micropipeta para fora do cérebro para reduzir o risco de vírus se espalhar dorsalmente ao longo da trajetória da injeção.
    11. Após injetar a mistura viral 1:1 jRCaMP1b:GcaMP6f em cada local, use a interface de injeção de nanolitros para devolver o êmbolo do injetor de nanolitros à sua posição original. Remova a micropipeta e descarte-a em um recipiente de resíduos de biohazards sharps.
    12. Se necessário, repita os passos 2.9.2–2.9.11 para cada região cerebral alvo da expressão de GRAB-DA1m. Em cada local-alvo, injete 150 nL em vez dos 300 nL usados para a mistura viral.
  10. Implante matriz multifibra.
    1. Fixe a matriz multifibra ao quadro estereotáxico usando qualquer fixação que possa segurar a matriz multifibra pelos pinos de cavilha para mantê-la estável durante a implantação (Figura 2I).
    2. Ajuste a posição da matriz multifibra de modo que cada fibra se alinhe com o centro de sua respectiva craniotomia e com a fibra mais longa repousando na superfície do cérebro. Zere o manipulador estereotáxico nesse local e abaixe lentamente a matriz multifibra até que ela esteja 0,25 mm acima da posição D/V da injeção viral mais profunda (Tabela 1, Figura 2J).
    3. Coloque um recipiente frio sobre gelo e adicione 1 colher de pó de cimento, 4 gotas de base líquida e 1 gota de catalisador. Misture por 20 s.
      NOTA: Repita esta etapa sempre que for usado cimento líquido e for necessário mais.
    4. Use uma seringa e uma agulha de 23–31 G para transferir cimento líquido no espaço entre a matriz multifibra e o crânio.
    5. Aplique cimento líquido usando um aplicador plástico fino ou agulha de seringa para cobrir completamente os quatro lados da matriz multifibra, formando uma forma pirâmide a partir do crânio (Figura 2K). Deixe o cimento secar por pelo menos 15 minutos.
    6. Suture a pele ao longo da incisão para garantir que nenhum crânio fique exposto.
  11. Deixe o rato se recuperar.
    1. Reduza a concentração de isoflurano para 0.
    2. Transfira o mouse do frame estereotáxico para uma almofada térmica e espere o mouse estar alerta e ambulante antes de transferi-lo de volta para sua gaiola.
    3. Deixe o camundongo se recuperar por pelo menos duas semanas antes de iniciar os experimentos.

3. Imagem de cálcio multisite e bicolor (Figura 1C)

  1. Configurar o Dispositivo de Aquisição de Dados (DAQ).
    1. Conecte o GND à porta AGND acima da porta Ch7 usando fio elétrico.
    2. Conecte o DIO0 à porta Ch0 usando fio elétrico.
  2. Conecte o sistema de fotometria ao DAQ.
    1. Conecte a extremidade do conector Baby Neill Constant (BNC) de um cabo BNC dividido (conector BNC em uma extremidade, fios elétricos vermelho e preto na outra) à porta de entrada do sistema de fotometria. Conecte a extremidade do conector BNC de outro cabo BNC dividido na porta de saída do sistema de fotometria.
    2. Pegue o cabo BNC dividido conectado à porta de entrada do sistema de fotometria e conecte a extremidade do fio vermelho à porta DIO1 do DAQ. Pegue o cabo BNC dividido conectado à porta de saída do sistema de fotometria e conecte a extremidade do fio vermelho à porta Ch1 do DAQ.
    3. Conecte os fios pretos de terra dos dois cabos BNC divididos à porta DAQ GND.
  3. Sincronize câmeras de comportamento e fotometria.
    1. Daisy-chain múltiplas câmeras de comportamento para gravações simultâneas do comportamento de múltiplos ângulos.
      1. Conecte a saída opto-isolada (pino 4, fio branco) da câmera de comportamento primário à entrada não isolada da câmera secundária (pino 1, fio verde) com um resistor de 3,3 KΩ. Conecte a saída de 3,3 V da câmera principal (pino 3, fio vermelho) ao mesmo resistor de 3,3 KΩ e ao Ch2 do DAQ.
      2. Conecte a saída opto-isolada de cada câmera secundária à sua saída de 3,3 V usando um resistor de 3,3 KΩ.
      3. Conecte o terra da câmera principal (pino 6, fio marrom) ao terra de cada câmera secundária. Conecte todos os fios terra da câmera à porta DAQ AGND acima da porta Ch2 e à saída terra do sistema de fotometria.
  4. Configure as configurações da câmera de comportamento usando o software de imagem associado.
    1. Ajuste a "taxa de quadros de aquisição" para 45 Hz e o ganho para 1.
    2. Defina o tempo de exposição para 2998 μs, o limite inferior para 100 μs e o limite superior para 150000 μs.
      NOTA: "Taxa de Quadros de Aquisição" pode não ser a taxa de quadros real que será capturada. Dependendo do tempo de exposição e da largura de banda de dados solicitada, esse valor pode precisar ser definido acima da frequência final de imagem. Se necessário, ajuste a "Taxa de Quadros de Aquisição" de modo que a "Taxa de Quadros Resultante" exibida seja 40 Hz.
  5. Configurar o software DAQ (Arquivo Suplementar 7).
    1. No software DAQ, adicione o DAQ como um 'Dispositivo' e mude para o 'Painel de Configuração'.
    2. Na aba 'Canais', em 'Entrada Analógica', ative os canais 0–2. Em 'Digital', ative o canal 0.
      NOTA: Ch0 corresponde ao sinal lógico transitor-transitor (TTL), Ch1 ao sistema de fotometria e Ch2 às câmeras em cadeia de margaridas.
    3. Sob 'Entrada Analógica', nome do canal 0 "TTL", canal 1 "Photometry_system" e canal 2 "Behavior_cameras", que significa "Lógica Transistório-Transistor". Sob 'Digital', nome canal 0 "TTL_trigger".
    4. Na aba 'Triggers', coloque os gatilhos em manual. Na aba 'Taxas de Amostragem', defina a taxa de amostragem para 350 Hz.
    5. Mude para o 'Painel de Exibição' e coloque as janelas 'Strip', 'Scalar' e 'Output' na interface gráfica do usuário.
  6. Configurar o software do sistema de fotometria (Arquivo Suplementar 8).
    1. Desenvolva um fluxo de trabalho no software de codificação visual para aceitar um pulso TTL de 5 V para acionar as gravações e salvar o carimbo de tempo para cada quadro, as emissões de fluorescência para os canais vermelho e verde de cada fibra, e o vídeo bruto, conforme descrito no manual do sistema de fotometria.
    2. Usando o nó para o sistema de fotometria no fluxo de trabalho, certifique-se de que o sistema esteja configurado para gravar quadros alternados de LED de 560, 470 e 415 nm a 120 Hz para uma taxa de quadros funcional de 40 Hz.
      NOTA: Esta abordagem de multiplexação por divisão de tempo (TDM) aborda a sobreposição espectral entre GCaMP e RCaMP separando temporalmente sua excitação, garantindo que cada indicador seja excitado independentemente em quadros consecutivos. O sistema de gravação empregado aqui utiliza filtros de emissão passa-banda otimizados (canal verde: 500–530 nm; canal vermelho: >580 nm longpasso) que minimizam ainda mais a diafonia espectral ao restringir os fótons detectados aos comprimentos de onda predominantemente emitidos por cada indicador. O comprimento de onda isosbestico de 415 nm excita igualmente tanto GCaMP quanto RCaMP, mas produz mudanças mínimas de fluorescência dependentes do cálcio, fornecendo um sinal de controle de artefatos de movimento. Juntas, excitação TDM e filtragem espectral garantem que os quadros de 470 nm capturem predominantemente a atividade GCaMP (Figura 3A), os quadros de 560 nm capturem predominantemente a atividade RCaMP (Figura 3B), e os quadros de 415 nm forneçam sinais de referência independentes do cálcio para correção de movimento.
  7. Realize gravações de fotometria in vivo .
    1. Obtenha camundongos que passaram por injeções virais e implantação de matriz multifibra, conforme descrito no Passo 2.
    2. Limpe as superfícies de conexão do cordão de contato e da matriz multifibra implantada com etanol e um cotonete. Usando o nó do sistema de fotometria no fluxo de trabalho de codificação visual e um fotômetro, configurou cada um dos níveis de potência de LED 415, 470 e 560 para fornecer aproximadamente 1,2 mW de iluminação pelo cabo de conexão.
    3. Aplique gel de correspondência de índice na superfície de conexão do cabo de conexão. Alinhe o cordão de conexão ao conjunto multifibra implantado do mouse com os pinos de cavilha do arranjo e deslize o cordão para baixo até ficar nivelado com a superfície do conjunto multifibra implantado.
    4. Aperte os parafusos do cordão de reposição para fixar a matriz multifibra no cabo. Deixe o rato habituar-se antes de iniciar os experimentos (Figura 2L–M).
    5. Defina os nomes dos arquivos.
      1. Para cada câmera de comportamento, pressione o botão círculo vermelho 'gravar' para abrir a janela de gravação no software de gravação da câmera de comportamento e especifique o nome do arquivo.
      2. Abra o programa DAQ, clique no botão de engrenagem e navegue até 'opções de registro', e especifique o nome do arquivo.
      3. Clique no nó 'PhotometryWriter' do fluxo de trabalho de codificação visual do sistema de fotometria para especificar o nome do arquivo.
    6. Nas janelas de gravação do software da câmera de comportamento, clique em 'iniciar gravação' para cada câmera. Em seguida, pressione o botão play no fluxo de trabalho de codificação visual do sistema de fotometria e pressione gravar no software DAQ.
    7. Clique no interruptor TTL para começar a gravar de forma síncrona entre todas as câmeras.
    8. Fim da gravação.
      1. Clique no interruptor TTL para encerrar as gravações síncronas da câmera
      2. Pressione o botão de parar no fluxo de trabalho de codificação visual do sistema de fotometria, "pare a gravação" nas janelas do software de câmera de comportamento.
    9. Repita os passos 3.7.5–3.7.8 até o final dos experimentos e desconecte o mouse.
      NOTA: Após experimentos, os fluxos de dados de fotometria e de câmera de comportamento podem ser alinhados com código personalizado usando a saída do software DAQ. Especificamente, (1) a mudança na tensão TTL indica o tempo de início e deslocamento TTL, (2) mudanças na voltagem de comportamento da câmera indicam quando o obturador da câmera abre e fecha para capturar cada quadro de vídeo de comportamento, e (3) a mudança inicial na tensão do sistema de fotometria registrada no DAQ pode ser comparada com o tempo de início TTL e os carimbos de tempo da câmera de fotometria emitidos pelo software de codificação visual para determinar os carimbos de tempo da câmera de fotometria.

4. Processamento de dados (Figura 1D, Arquivo Suplementar 9)

  1. Pré-processar dados de imagem de cálcio.
    1. Desentrelaçamento de quadros de dados de imagem de cálcio para criar fluxos separados de sinal registrados em resposta a LEDs de 415 nm, 470 nm e 560 nm.
    2. Use o algoritmo Adaptive Iteratively Reweighted Least Squares Penalized (airPLS)44 para corrigir a deriva da linha base.
    3. Calcule ΔF/F usando:
      figure-protocol-2
      NOTA: O período de referência deve ser uma época estável antes da manipulação experimental (por exemplo, antes de introduzir um parceiro social). Se o período de referência for muito curto (<2–3 min) ou apresentar grandes flutuações que podem estar contaminadas por artefatos de movimento, considere normalizar usando a fluorescência média durante toda a sessão em vez de um período de referência restrito.
  2. Correto para artefatos de movimento (Figura 4A).
    1. Utilize uma abordagem baseada em regressão, embora métodos alternativos sejam adequados (veja a Tabela 2)
    2. Sinais Z-score ΔF/F usando a mediana para normalizar a magnitude do sinal entre regiões:
      figure-protocol-3
    3. Aplique regressão de Laço com regularização L1. O laço (Operador de Menor Encolhimento Absoluto e Seleção) realiza a seleção automática de características ao reduzir os coeficientes de preditores não informativos em direção a zero.
      1. Realizar busca em grade entre parâmetros de regularização (α = 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100). A busca em grade identifica o equilíbrio ideal entre complexidade do modelo e sobreajuste. Essa etapa pode ser totalmente automatizada usando rotinas de validação cruzada disponíveis em bibliotecas padrão de aprendizado de máquina (por exemplo, scikit-learn em Python).
      2. Para fotometria de dupla cor (nossa abordagem recomendada), utilize todos os canais de controle isosbestico de 415 nm disponíveis nas 12 regiões de gravação como preditores ( veja a Figura 4B–C e Resultados para a justificativa). Para fotometria de cor única (GCaMP apenas ou apenas RCaMP), ressinto a matriz preditora apenas ao sinal isosmítico da mesma fibra do sinal de cálcio que está sendo corrigido.
      3. Selecione o modelo que minimize o erro quadrático médio entre o sinal previsto e o observado.
    4. Subtraia o componente de movimento previsto do sinal para obter atividade corrigida.
  3. Suavize o sinal usando um filtro Savitzky-Golay com uma janela de 725 ms.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para gravar simultaneamente de até 12 regiões cerebrais de SBN, construímos uma matriz multifibra personalizável seguindo o protocolo acima. Após a recuperação da cirurgia, os camundongos foram registrados durante a interação social (Figura 5). Para todos os experimentos, camundongos machos CD1 foram autorizados a interagir com ratos Balb/c machos em sua gaiola doméstica. Usamos camundongos Vgat-Cre para expressar jRCaMP1b40 em neurônios GABAérgicos de forma dependente de Cre em 11 regiões cerebrais de SBN, GCaMP6f39 em células não GABAérgicas de forma excluidade Cre 45 nas mesmas regiões cerebrais, e GRAB-DA1m33 no Núcleo accumbens42 (Tabela 1). A confirmação histológica do direcionamento das fibras pode ser encontrada em nossas publicações anteriores42,43. Aqui, buscamos testar o desempenho de diferentes métodos para correção de artefatos de movimento. Especificamente, comparamos a eficácia do uso: (1) apenas um filtro mediano; (2) Regressão de laço com regularização L1 usando apenas sinais isósméticos da mesma fibra (abordagem de preditor único)11 e (3) Regressão de laço usando sinais isosmíticos de todas as fibras como preditores (abordagem multi-preditor)41,42 (Figura 4A). De forma crítica, os métodos baseados em Laço corrigem o sinal bruto usando o sinal fluorescente independente da atividade gerado em resposta ao LED de frequência isosmítica (415 nm), enquanto o suavizamento do filtro mediano não considera o sinal independente da atividade.

Avaliamos a correção de movimento usando duas medidas diferentes: ruído absoluto de alta frequência e jitter. Ruído de alta frequência foi definido como o desvio padrão da primeira derivada do sinal, que reflete a magnitude das flutuações rápidas do sinal. Jitter foi definido como o coeficiente de variação da derivada do sinal, que reflete a magnitude da variabilidade do sinal quadro a quadro em relação à média da derivada do sinal. Descobrimos que ambas as abordagens baseadas em Laço (preditor único e multipreditor) superaram substancialmente o filtro mediano em termos de redução tanto do ruído de alta frequência quanto do jitter, com a correção multipreditor superando marginalmente a correção de preditor único (Figura 4C–D; Ruído de alta frequência, n=414 para 23 sinais em 18 sessões de gravação: teste de Kruskal-Wallis, H = 501,9420, p < 0,001; Testes pós-hoc de Mann-Whitney U com correção de Bonferroni: Regressão suavizada vs de sítio único ***p < 0,001, Regressão suavizada vs multi-sítio ***p < 0,001, Regressão mono-sítio vs Multi-sítio **p = 0,0073; Jitter: teste de Kruskal-Wallis, H = 495,6685, p < 0,001; testes pós-hoc de Mann-Whitney U com correção de Bonferroni: Regressão suavizada vs de sítio único ***p < 0,001, Regressão suavizada vs multi-sítio ***p < 0,001, Regressão mono-sítio vs Multi-sítio ***p = 0,0006). Especificamente, a abordagem multi-preditor (usando toda a isosbest de fibra) mostrou benefícios para sinais de canal vermelho (RCaMP): 5 de 12 sinais vermelhos apresentaram ruído residual significativamente menor em comparação com correção preditor único (n = 18 gravações/região). Para jitter, BNST (teste t, t = 5,42, ***p < 0,001), POA (teste t, t = 2,68, *p = 0,011), AH (teste t, t = 2,66, *p = 0,012) e PAG (teste U de Mann-Whitney, U = 279, ***p < 0,001) mostraram superioridade em múltiplos preditores. Para ruído de alta frequência, BNST (teste U de Mann-Whitney, U = 285, ***p < 0,001), POA (teste U de Mann-Whitney, U = 292, ***p < 0,001), AH (teste t, t = 7,10, ***p < 0,001), PAG (teste t, t = 13,72, ***p < 0,001) e LHb (teste t, t = 5,47, ***p < 0,001) mostraram superioridade em múltiplos preditores. Os sinais de canal verde (GCaMP) não mostraram diferenças significativas entre as duas abordagens do Lasso em todas as 12 regiões para métricas de jitter ou ruído de alta frequência (todas p>0,05, para a lista completa de testes estatísticos veja Tabela 3). Isso sugere que, para fotometria de dupla cor, incorporar informações isosbesticas cruzadas melhora a correção de movimento para sinais vermelhos, provavelmente porque isosmêsticas de canal verde fornecem informações de movimento mais limpas. Esses dados demonstram que a correção de artefatos de movimento usando métodos de regressão baseados em isosbest supera substancialmente as abordagens simples de filtragem, com a regressão multicanal oferecendo vantagens específicas para gravações em cores duplas.

figure-results-1
Figura 1. Gravação da Rede de Comportamento Social usando fotometria de fibra multisite e duas cores. (A) Representação esquemática de como construir um array multifibra. (B) Representação esquemática do fluxo de trabalho cirúrgico. (C) Representação esquemática de experimentos de imagem de cálcio em duas cores. (D) Exemplo de usar sinal isósbico para calcular um sinal corrigido por movimento. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

figure-results-2
Figura 2. Imagens de procedimentos-chave para fabricação e cirurgia. (A) Cabo de conexão fabricado pronto para uso em gravação. (B) Matriz multifibra colocada em um suporte estereotáxico personalizado com a broca de 0,25 mm x 5,5 mm posicionada acima de um furo de fibra atravessante. (C) Matriz multifibra com todos os furos de passagem da fibra limpos e porcas hexagonales coladas. (D) Cortar uma fibra usando um gravador de fibra. (E) Matriz multifibra com todas as fibras coladas com supercola e colocadas em um disco de polimento personalizado. (F) Vista ampliada de como alinhar e rosquear o conector do cabo de conexão ao array multifibra. (G) Matriz multifibra totalmente construída com pinos de cavilha colados no lugar. (H) Rato fixado à estrutura estereotáxica com incisão no couro cabeludo feita para expor o crânio. (I) Matriz multifibra fabricada acoplada a um manipulador estereotáxico para manobrar a matriz multifibra durante a cirurgia. (J) Vista ampliada da matriz multifibra sendo baixada para dentro do cérebro. (K) Matriz multifibra totalmente abaixada e fixada ao crânio com cimento dentário. (L) Matriz multifibra em um animal que esteja conectada de forma segura ao cabo de conexão antes da gravação. (M) Vista ampliada do animal na gaiola com cabo conectado antes e/ou durante a gravação. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3. Separação espectral. Exemplos de traços demonstrando uma interferência espectral mínima entre indicadores de cálcio. Os sinais GCaMP6f (azul) apresentam ativação robusta durante excitação de 470 nm, mas resposta desprezível a excitação de 560 nm. Os sinais jRCaMP1b (vermelho) apresentam o padrão inverso com forte ativação a partir de 560 nm, mas resposta mínima a iluminação de 470 nm. (A) Registrava simultaneamente sinais GCaMP6f e jRCaMP1b com iluminação apenas de 470 nm. (B) Igual a (a), mas apenas com iluminação de 560 nm. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4. Comparação de diferentes métodos para processamento de sinais multifibra. (A) Esquema representando a correção baseada em regressão multi-site do sinal de fotometria. Essa abordagem envolve etapas sequenciais de processamento nas quais todos os sinais isosmíticos disponíveis de 415nm são linearmente mapeados para cada sinal dependente do cálcio. Componentes de movimento previstos são subtraídos desse sinal para produzir a leitura final da atividade. Sinais ΔF/F com pontuação z provenientes de dois sinais com forte presença de artefatos de movimento. (B) De cima a baixo: sinal isosmêstico do mesmo canal de fibra/imagem representando artefatos de movimento, sinal apenas suavizado RCaMP (esquerda) ou GCaMP (direita) (filtrado com mediana, verde), mesmo sinal de fibra/canal de imagem corrigido por regressão (ciano), sinal de regressão multi-fibra corrigido (azul). (C) Esquerda: Pontuação média de ruído de alta frequência para cada sinal gravado (n = 21 sessões). Ruído de alta frequência é calculado como o desvio padrão da primeira derivada de cada sinal. As pontuações de ruído são mostradas para 1) sinal corrigido pela linha de base mas não corrigido (cinza), 2) sinal corrigido pela linha de base e filtrado pela mediana (rosa), 3) sinal corrigido por regressão de linha de base e de fibra única com suavização Savitsky-Golay (ciano), e 4) sinal corrigido por regressão de linha de base e multifibra com suavização Savitsky-Golay (azul). Centro: Porcentagem média de ruído removida usando apenas suavização, regressão de fibra única ou multifibra, agregada em todos os 23 sinais. A porcentagem de ruído removido é calculada como a fração do ruído de alta frequência resultante da correção em relação ao nível geral de ruído no sinal bruto corrigido pela linha de base. Os dados são reportados como média ± SEM (teste de Kruskal-Wallis, H = 501,9420, p < 0,001; testes pós-hoc de Mann-Whitney U com correção de Bonferroni: Regressão suavizada vs de sítio único ***p < 0,001, regressão suavizada vs multi-sítio***p < 0,001, Regressão mono-local vs multi-sítio **p = 0,0073). Direita: Porcentagem de sinais em que o ruído de alta frequência é estatisticamente diferente após correção baseada em regressão de fibra única versus multifibra, separada por tipo de sinal. Para cada um dos 23 sinais, os níveis de ruído após correção em local único foram comparados aos níveis de ruído após correção multi-local, usando testes t independentes (se normalmente distribuídos) ou testes Mann-Whitney U (alternativa não paramétrica). Segmentos azuis indicam sinais onde a correção multi-site resultou em ruído significativamente menor do que a correção em local único (p < 0,05). Segmentos cinza indicam sinais sem diferença significativa entre os métodos de correção. Segmentos ciano indicam sinais onde a correção em um único local resultou em ruído significativamente menor. E: Vgat- GCaMP6f. DA: AGARRE-DA. I: Vgat+ jRCaMP1b. (D) Igual a (C), mas representando variabilidade quadro a quadro (jitter), calculada como a derivada do coeficiente de variação de cada sinal (teste de Kruskal-Wallis, H = 495,6685, p < 0,001; testes pós-hoc de Mann-Whitney U com correção de Bonferroni: Regressão suavizada vs de sítio único ***p < 0,001, Regressão suavizada vs multi-sítio***p < 0,001, Mono-sítio vs Multi-sítio ***p = 0,0006). Para a lista completa de testes e resultados estatísticos, consulte a Tabela 3. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 5. Vitrine multi-site de fotometria de fibra dupla. Sinais representativos de múltiplos tipos de indicadores foram registrados simultaneamente durante o comportamento social (teste residente-intruso, época de entrada do intruso). Os traços mostram GCaMP6f (neurônios Cre-negativos), jRCaMP1b (neurônios Vgat-Cre+ GABAérgicos e subtraídos no ponto de partida), mas não corrigidos por artefatos de movimento, GCaMP1b (neurônios Vgat-Cre+ GABAérgicos) e GRAB-DA1m (sensor de dopamina no núcleo accumbens) em vários locais de rede de comportamento social no mesmo animal. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1. Coordenadas do vírus e comprimentos das fibras para cada Rede de Comportamento Social Alvo da Região do Cérebro. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2. Comparação dos métodos de correção de artefatos de movimento para fotometria de fibra multi-site. Princípios subjacentes, casos de uso ótimos, vantagens e limitações dos seguintes métodos de correção de artefatos de movimento: regressão linear simples, regressão de Lasso com regularização L1 (usando abordagem multipreditor), modelagem generativa bayesiana, escalonamento baseado em frequência e mínimos quadrados reponderados iterativamente. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 3. Detalhes e resultados dos testes estatísticos usados na Figura 4. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Arquivo Suplementar 1. Arquivo de impressão 3D para conector de cabos de conexão.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2. 3D arquivo de impressão para conector de cabo de conexão sem furos passantes.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 3. 3D arquivo de impressão para acessório de perfuração estereotáxica.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 4. Planta personalizada do puck de polimento.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 5. 3D arquivo de impressão para matriz de fotometria multisite direcionada a 12 sites SBN.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 6. 3D arquivo de impressão para matriz de fotometria multisite sem atravessar buracos direcionando os sítios.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 7. Arquivo de configuração DAQ para software DAQ.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 8. Arquivo de codificação visual para o sistema de fotometria.Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 9. Código Python usado no Protocolo Step 4 e para comparações corrigidas de artefatos de movimento. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A fotometria de fibras é uma técnica útil e econômica para registrar a atividade de cálcio populacional de regiões profundas do cérebro ou tipos celulares específicos no animalem movimento livre 3. A gravação de múltiplas regiões cerebrais simultaneamente permite ao usuário comparar a dinâmica entre regiões ou projeções durante comportamentos naturalistas ou preparações fixas com acabeça 5,7,12. Aqui, detalhamos métodos para gravar em duas cores de até 12 regiões cerebrais através da "rede de comportamento social" subcortical do cérebro, usando uma matriz de fibra sob medida e um sistema de câmeras comercialmente disponível. A seguir, discutimos etapas críticas para implementar esse método, possíveis modificações e estratégias de solução de problemas, bem como sua importância e limitações em relação às abordagens existentes.

O protocolo envolve três fases principais. Primeiro, a fabricação de matrizes multifibra e cabos de retalho exige que peças personalizadas impressas em 3D sejam furadas em coordenadas estereotáxicas, seguidas de inserção, polimento e controle de qualidade da fibra para garantir ≥75% de eficiência de transmissão de luz. Alinhamento preciso da perfuração (tolerância de ±0,03 mm) e polimento minucioso são críticos. Falhas comuns incluem baixa eficiência de transmissão de luz (<75%) e furos de fibra bloqueados. Baixa eficiência geralmente resulta de manchas nas fibras durante a clivagem ou polimento inadequado. As soluções incluem verificar que cada extremidade da fibra esteja sem manchas sob microscopia de campo claro antes da inserção (passo 1.1.6.2), repolimento usando a progressão completa da granulação (6 μm → 0,01 μm, passo 1.1.6.1) e garantir que a lâmina do cutelo de fibra esteja afiada. Para melhorar o rendimento, os laboratórios podem implementar modificações no fluxo de trabalho, como gabaritos personalizados de corte de fibra usando etapas de translação de precisão ou sistemas de corte baseados em laser (passo 1.2.4). Fabricantes comerciais de impressão 3D com sistemas de alta precisão podem reduzir a necessidade de furação manual (passos 1.1.3–1.1.4, passo 1.2.3), embora a precisão dimensional possa variar entre os lotes.

Segundo, a implantação cirúrgica envolve nivelamento do crânio (tolerância de ±0,03 mm), injeções virais em 11–12 locais e implantação de matriz multifibra, seguida de fixação com cimento. A precisão da mira é comprometida quando o nivelamento do crânio excede a tolerância. Isso pode ser mitigado medindo o tom em múltiplos pontos anteroposteriores separados por 8,25 mm e medindo a inclinação em posições laterais de ±2,0–2,5 mm, garantindo que as barras auriculares estabilizem totalmente o crânio. Bolhas de ar nas micropipetas de injeção viral impedem a entrega precisa e exigem reiniciar a preparação da micropipeta (passo 2.9). Durante a implantação de matriz multifibra, evite o contato do cimento com pontas das fibras construindo pirâmides de cimento a partir da superfície do crânio para cima (passos 2.10.3–2.10.5) e permita um tempo adequado de secagem (≥15 min).

Terceiro, gravação e processamento de dados envolvem sincronização da câmera via sistema DAQ, calibração de potência de LEDs (0,1 mW de saída/fibra, 1,2 mW de saída/12-fibra de conexão) e pré-processamento de sinal com controles isosbesticos. O pipeline de correção de movimento introduzido aqui usa regressão Lasso, que é muito adequada para configurações de preditor multicanal porque automaticamente reduz preditores não informativos para zero, mantendo apenas aqueles que contribuem significativamente para a correção de artefatos. Essa propriedade o torna particularmente vantajoso para fotometria de duas cores: ao incluir sinais isosbesticos dos canais vermelho e verde como preditores, o Lasso aproveita seletivamente os canais que transportam informações genuínas de movimento, resultando em uma redução substancialmente melhor do ruído nos sinais de canal vermelho (RCaMP) em comparação apenas com a correção de mesma fibra (Figura 4C–D). Como o Lasso identifica automaticamente os preditores mais informativos, é fortemente recomendado usar todos os canais isosmíticos disponíveis como entrada. Dito isso, a regressão Lasso é um dos vários métodos válidos de correção; alternativas incluem modelagem generativabayesiana 46, escalonamento baseado em frequência47 e mínimos quadrados iterativamente reponderados (IRLS)48, todos provavelmente gerando redução comparável de artefatos, com orientações de implementação fornecidas na Tabela 2. Qualidade persistente ruim, apesar do pré-processamento otimizado, provavelmente indica problemas de hardware ou cirúrgicos, e as etapas 1–2 devem ser revisadas

Além dessas considerações procedimentais, a fotometria de dupla cor introduz desafios técnicos adicionais relacionados à separação espectral. Uma consideração crítica na fotometria bicolorida é o gerenciamento da sobreposição espectral entre indicadores de cálcio verde e vermelho. Embora a eliminação completa da diafonia espectral seja desafiadora devido à sobreposição dos espectros de emissão de GCaMP e RCaMP, nossa abordagem de multiplexação temporal com excitação de LEDs entrelaçados (470 nm para GCaMP, 560 nm para RCaMP, 415 nm isosbestica) e filtros de emissão passa-banda otimizados mitiga substancialmente esse problema. Na prática, observamos comunicação cruzada mínima: a estimulação de 470 nm provoca atividade negligenciável no canal vermelho, e vice-versa para estimulação de 560 nm no canal verde (Figura 3). Pesquisadores preocupados com sobreposição espectral residual podem otimizar ainda mais seus sistemas selecionando filtros de emissão passa-banda estreita com separação espectral máxima com base em suas combinações específicas de indicadores.

Comparada a outras abordagens para gravações neurais em grande escala, a fotometria de fibra multisite de duas cores sob medida oferece muitas vantagens significativas. Primeiro, enquanto a fotometria de fibraúnica 1,2,3, as gravações extracelulares contemporâneas 4,6 ou as abordagens de imagem de superfíciecortical 8,9 são restritas a um único ou um conjunto espacialmente restrito de regiões cerebrais (por exemplo, na superfície cortical), o design personalizável de impressão 3D que compartilhamos aqui permite o direcionamento de até 12 regiões cerebrais em qualquer lugar do cérebro com fibras ópticas de 200 μm. Em comparação, as ferrules multifibracomercialmente disponíveis 5,7 suportam apenas fibra óptica de 100 μm e são igualmente restritas a um conjunto limitado de regiões cerebrais diretamente ventrais à matriz linear da virola. No que diz respeito ao direcionamento e registro de regiões específicas do cérebro, o principal equilíbrio é entre o diâmetro da fibra e o campo de visão do sistema de fotometria. As matrizes multifibra impressas em 3D equipadas com fibras de 200 μm gravam a partir de uma área maior em cada local em comparação com as ferulas multifibra comercialmente disponíveis. No protocolo atual, o campo de visão da câmera do sistema de fotometria limita a gravação a 12 fibras ópticas a 200 μm. Essa restrição pode ser superada reduzindo o diâmetro da fibra para 100 μm para até 60 fibras ou construindo um sistema de fotometria personalizado com um objetivo de câmera maior.

Por fim, essa plataforma personalizável de fotometria de fibra multisítio em duas cores tem sido usada para acompanhar longitudinalmente a dinâmica da atividade neural de duas populações neurais geneticamente distintas em 11-12 regiões cerebrais. Usando uma estratégia de exclusão Cre-in/Cre expressando RCaMP dependente de Cre e GCaMP excluínte de Cre em populações de SBN em um camundongo Vgat-cre, tanto a experiência agressiva quanto a observação demonstraram promover padrões compartilhados da dinâmica de atividade em toda a SBN durante futuras interações sociaisdefensivas 42. Usando a mesma estratégia viral em um camundongo Esr1-cre para registrar a partir de neurônios que expressam e não expressam alfa receptores de estrogênio, padrões específicos de comportamento social por território foram associados a um reescalonamento rápido e sensível a hormônios de um código de ação social em todo o SBN, aumentando a atividade associada ao comportamento no territórionatal 43. Essas diferenças específicas de comportamento e codificação de redes requerem testosterona circulante em camundongos machos. Embora esses estudos tenham usado uma abordagem viral e uma única linha de Cre, estudos futuros podem expandir esses métodos com abordagens virais interseccionais, indicadores de cálcio geneticamente expressos ou repórteres fluorescentes de sinalização neuromoduladora e neuropeptídica.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O financiamento veio do NIH K99MH135212 (para E.M.G.), NIH F32MH126562 (para E.M.G.), DP2MH126375 (para A.L.F.), NIH R01MH126035 (para A.L.F.), NYSCF (para A.L.F.), Simons Foundation (SCGB) (para A.L.F.), Klingenstein Foundation (para A.L.F.) e Alfred P. Sloan Fellowship (para A.L.F.), McKnight Foundation (A.L.F). Instituto Allen (A.L.F). A.L.F. é pesquisadora Robertson da Fundação de Células-Tronco de Nova York.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Broca #76Cidade da Broca de Perfuração#76
Broca #78Cidade da Broca de Perfuração#78
Broca #92Cidade da Broca de Perfuração#92
0,01 & mu; Folhas de polimento M GritThorLabsLFCF2
Brocas de 0,25 mm x 5,5 mmCidade da Broca de PerfuraçãoProduto personalizadobroca de 0,25 x 5,5 mm, entrei em contato com a empresa para construir
1 & mu; Folhas de polimento M GritThorLabsLF1D
12 patchord ramificado de fibraLente dóricaCustomBBP(12)_200/220/3000-0.37
_5m_SMA-12xCL_LAF
200 & mu; Fibra óptica mThorLabsFT200UMT
3 & mu; Folhas de polimento M GritThorLabsLF3D
30 & mu; Folhas de polimento M GritThorLabsLF30D
6 & mu; Folhas de polimento M GritThorLabsLF6D
Sutura absorvívelEthiconJ421H
Documentação de Mínimos Quadrados Penalizados Adaptativos Reponderados IterativamenteGoogleN/Ahttps://code.google.com/archive/p/airpls/
Pinos de cavilha de aço de ligaMcMaster-Carr98381a983
Câmeras de comportamentoTeledyne FLIRBlackfly S
BonsaiFundação de Software BonsaiVersão 2.9.0
Microscópio de Campo ClaroLeicaES2
Grampos BulldogFineScienceTools18038-45
DAQComputação de MediçãoDAQ série USB-200 MC
Software DAQComputação de MediçãoDAQami
DrillKopf InstrumentsModelo 1911 Estereotaxic Drill
Cutelo de fibraThorLabsXL411/CLVB
Sistema de fotometria de fibraNeurofotometriaFP3002
Manual do sistema de fotometria de fibraNeurofotometriaN/AManual do dispositivo de hospedagem de páginas: https://neurophotometrics.com/documentation
Gravador de fibraThorLabsS90C
Removedor de fibrasThorLabsT10S13
Pinças finasFineScienceTools11252-00
Tesoura finaFineScienceTools14084-08
Parafusos de acionamento G5Sítio de Produção Open EphysOEPS-7105
Chave de fenda G5Sítio de Produção Open EphysOEPS-7121
GCaMP6fLaboratório de Neuroengenharia Viral PNIEF1a-Cre out-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
AGARRAAddgenehSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
Bolsa térmicaSuprimentos Médicos HabilidososHTP-1500
Sistema de aquecimentoKent ScientificRT-0515
IsofluranoCovetrus29405
jRCaMP1bAddgenepAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
Porcas hexagonais M0.6 de latãoMetricScrews.us21614
Reagentes e ferramentas de cimento metabondParkellS380
Impressões 3D em resina semelhante ao ABS MicroFineProtoLabsProduto personalizadoVeja Arquivos de Código Suplementar 1-3, 5, 6
Injetor de nanolitrosDrummond Scientific CompanyNanoject IIInjetor de nanolitros
Folhas de cera ParrafinAmcorFilme de Laboratório Multiuso ParaFilm M
PipetterThermoFisher Scientific4641310N
Puck de PolimentoDepartamento de Física da Universidade de Princeton Oficina de MáquinasProduto personalizadoVeja Arquivo de Código Suplementar 4
Medidor de potênciaThorLabsPM100D
Pomada óptica PuralubeDechraP1490-1
PythonFundação de Software PythonN/A
Tubo de plástico macio para cabo de conexãoMcMaster-Carr3774N4
SpinViewTeledyne FLIRVersão 1.25.0.52Software de imagem que controla as câmeras de comportamento
Quadro estereotáxicoKopf InstrumentsModelo 1900
Documentação do TMACN/AN/ACódigo TMAC: https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
Tubo para quadro estereotáxicoSaint-GobainE-3603
VaporizadorKent ScientificVaporizador VetFlo

Referências

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