Purificação e Identificação de Proteína Antimicrobiana da Alga Verde Tetraspora Sp. CU2551

Tanaporn Klinsanit; Yothawut Tonawut; Natwikar Laokua; Rawirat Pansomsuay; Wanthanee Khetkorn; Cherdsak Maneeruttanarungroj

doi:10.3791/70066

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Artigo de método

Purificação e Identificação de Proteína Antimicrobiana da Alga Verde Tetraspora Sp. CU2551

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DOI:

10.3791/70066

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17 de fevereiro de 2026

Tanaporn Klinsanit¹ , Yothawut Tonawut¹ , Natwikar Laokua¹ , Rawirat Pansomsuay¹ , Wanthanee Khetkorn² , Cherdsak Maneeruttanarungroj¹^,³

¹Department of Biology, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang, ²Division of Biology, Faculty of Science and Technology, Rajamangala University of Technology Thanyaburi, ³Bioenergy Research Unit, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho para investigar proteínas antimicrobianas intactas usando múltiplas técnicas, incluindo otimização de tampões de extração de proteínas, perturbação celular de algas, fracionamento de proteínas por cromatografia por troca iônica, separação de proteínas por SDS-PAGE e ensaios de atividade antimicrobiana. A proteína ativa foi posteriormente confirmada e identificada por análise LC-MS/MALDI-TOF.

Resumo

A resistência antimicrobiana (RAM) é uma ameaça global à saúde em ascensão, que exige a descoberta de novos agentes antimicrobianos. Proteínas e peptídeos derivados de algas têm ganhado cada vez mais atenção por seu potencial bioativo; no entanto, protocolos padronizados para investigar peptídeos antimicrobianos (AMPs) em algas verdes, especialmente Tetraspora sp. CU2551, permanecem limitados. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho passo a passo para o isolamento, purificação e caracterização de proteínas antimicrobianas intactas da alga verde Tetraspora sp. CU2551. O procedimento integra extração otimizada de proteínas, fracionamento cromatográfico, separação eletroforética, triagem da atividade antimicrobiana e identificação de proteínas. As condições de extração de proteínas são inicialmente otimizadas para reduzir os efeitos inibitórios de fundo originados dos componentes tampão. Quando a identidade do peptídeo ativo é desconhecida, aplica-se um ensaio pull-down para avaliar a ligação de proteínas entre diferentes resinas de troca iônica e orientar a seleção de uma matriz de purificação apropriada. A cromatografia por troca iônica DEAE-Sepharose é um método adequado para enriquecer frações de proteínas antimicrobianas. Todas as frações são avaliadas sistematicamente quanto à atividade antimicrobiana e analisadas pelo SDS-PAGE. A faixa proteica correspondente à maior atividade antimicrobiana, juntamente com um perfil eletroforético distinto, é retirada e submetida à análise LC-MS/MALDI-TOF para identificação proteica. O fluxo de trabalho é complementado ainda por análises in silico para prever propriedades relacionadas a peptídeos antimicrobianos usando ferramentas bioinformáticas disponíveis publicamente. Esse protocolo oferece uma estrutura versátil para a descoberta de proteínas antimicrobianas e pode ser facilmente adaptado a outras espécies de algas e aplicações biotecnológicas relacionadas.

Introdução

A resistência antimicrobiana (RAM) representa um desafio global^{de saúde crescente 1}, destacando a importância de estratégias contínuas para identificar novos agentes antimicrobianos a partir de fontes naturais. Embora haja pesquisas crescentes sobre as propriedades antimicrobianas de proteínas e peptídeos derivados de algas ^2,3. A maioria dos estudos foca em abordagens baseadas em peptídeos ou^{hidrolisados 4}, e métodos padronizados para preservar e avaliar a atividade de proteínas de algas inteiras permanecem^{limitados 5}. Este artigo descreve um método voltado para isolar, purificar e avaliar proteínas intactas da alga verde Tetraspora sp. CU2551 quanto à atividade antimicrobiana.

O protocolo descreve um processo passo a passo que abrange a extração de proteínas inteiras, fracionamento por cromatografia por troca iônica, avaliação das propriedades antibacterianas, separação de proteínas em gel, identificação de proteínas por espectrometria de massa e previsão de peptídeos antimicrobianos usando técnicas in silico. A eficácia dos agentes antibacterianos é avaliada usando testes padrão de difusão de ágar e inibição de crescimento líquido em cepas bacterianas típicas Gram-positivas e^{Gram-negativas} ^4,6. Essa abordagem permite a conexão da atividade antimicrobiana identificada a frações proteicas específicas ou bandas eletroforéticas, em vez de depender apenas de misturas peptídicas digeridas ou apenas de previsões computacionais que podem não identificar proteínas antimicrobianas ou sequências semelhantes a AMPs fora das definições canônicas^{do banco de dados} ^7,8.

Seguir esse protocolo permite que os leitores obtenham de forma confiável frações de proteínas bioativas contendo potenciais sequências de proteínas antimicrobianas, adequadas para validação futura e avaliação funcional. Achados representativos indicam a identificação de frações bioativas contendo candidatos a proteínas conhecidos e desconhecidos. Esse protocolo oferece uma estrutura versátil e prática para identificar substâncias antimicrobianas a partir de proteínas intactas obtidas de algas e outras fontes biológicas.

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Protocolo

Este estudo não envolveu participantes humanos, animais ou vertebrados. Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança e ética em pesquisa da Escola de Ciências, Instituto de Tecnologia King Mongkut Ladkrabang (KMITL), Tailândia. Todos os experimentos microbianos foram realizados sob condições laboratoriais de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2), seguindo a OMS e o padrão nacional^{de biossegurança 9}.

Use equipamentos de proteção individual adequados, incluindo jalecos, luvas e máscaras faciais, durante todos os procedimentos experimentais. Colete e descarte resíduos químicos e contendo prata conforme as diretrizes institucionais de gestão de resíduos perigosos antes de enviá-los para uma empresa licenciada de gestão de resíduos.

Prepare soluções concentradas de produtos químicos perigosos, incluindo dodecil sulfato de sódio, β-mercaptoetanol e reagentes de tinta de prata contendo formaldeído, em uma exaustão química. Conduza experimentos usando baixas concentrações de trabalho e pequenos volumes na bancada de laboratório, de acordo com as práticas padrão de segurança laboratoriais.

1. Cultura de algas

NOTA: Mantenha condições assépticas durante o cultivo de algas.

Preparação da cultura inicial
1. Prepare um médio TAP estéril (pH 7,0)¹⁰ e dispense 150 mL em frascos Erlenmeyer estéreis de 500 mL.
2. Inocule o meio com um inoculo noturno de 1% (v/v) de Tetraspora sp. CU2551 usando técnica asséptica em um gabinete de biossegurança Classe I.
3. Incubar as culturas em uma incubadora agitadora com luz a 35 °C, 120 rpm e 45,9 μmol/^{m 2}/s por 48 horas. Use a cultura totalmente adulta como ponto inicial para a expansão da cultura.
Cultura em escala e colheita celular
1. Transfira 25 mL de cultura starter para 275 mL de meio TAP estéril fresco. Incubar as culturas nas mesmas condições por 48 horas.
2. Colhe as células de algas por centrifugação a 3.800 × g por 15 minutos a 25 °C.
3. Lave os pellets celulares uma vez com água destilada estéril e centrifuge novamente a 3.800 × g por 15 minutos a 25 °C.
4. Remova completamente o sobrenadante e armazene os pellets das células de algas a −20 °C até processamento adicional.

2. Formulação do tampão de lise e triagem por inibição de fundo

ATENÇÃO: Manuseie SDS e β-mercaptoetanol com luvas de borracha ou nitrilo. Abra o frasco concentrado de β-mercaptoetanol em uma exaustão química.

Preparação do tampão de lise
1. Prepare o tampão de lise^{de referência 11} , consistindo de 10 mM de Tris-HCl (pH 9,0) suplementado com 0,1 % de SDS em peso e 38 mM de β-mercaptoetanol.
  NOTA: Passo crítico: Otimize as concentrações de SDS e β-mercaptoetanol para evitar atividade antimicrobiana falsamente positiva.
2. Prepare conjuntos fatoriais completos de tampão de lise variando dodecil sulfato de sódio (SDS) (0, 0,01, 0,05 ou 0,1% w/v) e β-mercaptoetanol (0, 0,5, 1 ou 2 mM), gerando 16 formulações.
  NOTA: As composições de todas as formulações testadas de tampão de lise são resumidas na Tabela 1. Adicione β-mercaptoetanol imediatamente antes do uso.
Triagem antimicrobiana de base
1. Use uma perfuradora para preparar discos de 6 mm a partir do papel No. 42 Whatman. Aplique 5 μL de cada formulação de tampão de lise no disco de papel e realize ensaios de difusão de disco conforme as diretrizes^{CLSI 6}. Incube as placas de ensaio a 37 °C por 20 horas e avalie as zonas de inibição.
  1. Testar formulações contra Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 e Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370.
2. Selecione a formulação que não demonstre atividade inibitória para extração subsequente da proteína.

3. Extração de proteínas

NOTA: Mantenha as amostras em baixa temperatura durante a sonicação e centrifugação.

Descongele os pellets de algas congelados (do passo 1.2.5) a 37 °C e recongele a −20 °C. Repita os ciclos de congelamento-descongelamento (-20 °C / 37 °C) 3 vezes.
Adicione o buffer de lise ideal (10 mM Tris-HCl, pH 9,0, 0,01% SDS, 2 mM β-mercaptoetanol) a um volume final de 5 mL e mantenha as amostras no gelo durante todo o processamento a jusante. Perturbe as células por sonicação da sonda (25 kHz, 500 W, 40% de amplitude, 1 s liga/desligado, 5 minutos).
Adicione o Coquetel Inibidor de Protease conforme as instruções do fabricante e misture suavemente.
A centrífuga lisa a 3.800 × g por 15 minutos a 4 °C e coleta o sobrenadante como extrato de proteína bruta.
Clarifique os extratos por centrifugação a 10.000 × g por 10 minutos a 4 °C. Colete e armazene os supernadantes a 4 °C.

4. Avaliação da atividade antimicrobiana

Ensaios de difusão em disco
1. Cultive bactérias patogênicas (Bacillus subtilis TISTR 1248, Staphylococcus aureus TISTR 746, Escherichia coli TISTR 074 e Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370) em ágar nutritivo a 37 °C por 16-18 horas.
2. Usando um laço de alumínio estéril, raspe as colônias das superfícies do ágar e ressuspenda em 0,9% (p/v) de NaCl. Ajuste as suspensões bacterianas para o padrão McFarland de 0,5 e faça swab uniformemente nas placas de ágar Mueller-Hinton.
3. Coloque discos de papel estéreis sobre superfícies de ágar inoculadas e aplique 5 μL de amostras de teste. Incube as placas a 37 °C por 16-20 horas e meça as zonas de inibição usando um calibre Vernier.
  NOTA: Mantenha espaçamento igual entre todos os discos.
Determinação de MIC e MBC
1. Prepare suspensões bacterianas a 2 × 10⁶ CFU/mL em 4x caldo Mueller-Hinton.
2. Pipete 50 μL das suspensões bacterianas e 100 μL das amostras de proteína diluídas em série em placas de 96 poços e ajuste todos os poços para um volume final de 200 μL usando 10 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,5).
3. Use 5 μL de estreptomicina (50 μg) como controle positivo. Use 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 0,9% (p/v) de NaCl como controles negativos.
4. Incubar as placas a 37 °C por 20 horas e determinar a CMI como a menor concentração sem crescimento bacteriano visível.
5. Placas de poços claros para ágar Mueller-Hinton para determinar MBC.
Determinação da curva de crescimento bacteriano
1. Prepare suspensões bacterianas a 1 × 10⁶ CFU/mL em 2x caldo Mueller-Hinton.
2. Incubar 100 μL de cultura bacteriana com 100 μL de amostras de proteína em uma placa de 96 poços a 37 °C por 20 horas.
3. Use 5 μL de estreptomicina (50 μg) como controle positivo. Use água destilada estéril, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 500 mM de NaCl em 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5) como controles.
4. Meça OD₆₀₀ a cada 30 minutos usando um leitor de microplacas com agitação intermitente orbital (2 minutos antes da medição).
5. Calcule curvas de crescimento e taxas específicas de crescimento.
  NOTA: Altas concentrações de proteínas podem interferir nas medições de densidade óptica.

5. Ensaio por pull-down e purificação de proteínas

Ensaio de pull-down
1. Equilibrar resina DEAE-Sepharose com 10 mM de tampão Tris-HCl (pH 8,0) ou resina CM-Sepharose com 10 mM de tampão fosfato (pH 7,0).
2. Misture 100 μL de resina equilibrada com 500 μL de extrato proteico bruto, depois adicione 100 μL do tampão de equilíbrio correspondente (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 para DEAE; 10 mM tampão fosfato, pH 7,0 para CM). Incubar com inversão suave (10 inversões).
3. Centrifugar brevemente, coletar o sobrenadante e avaliar a atividade antimicrobiana por meio de ensaio de difusão em disco.
4. Selecione a resina de trabalho (DEAE-Sepharose). Para otimização do pH, equilibre a resina com 10 mM de Tris-HCl em pH 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 ou 9,0 e siga os passos 5.1.1-5.1.3.
5. Selecione a condição de pH que demonstre atividade antimicrobiana para cromatografia por troca iônica.
Purificação de proteínas baseada em cromatografia por troca iônica
1. Embale a resina DEAE-Sepharose em uma coluna de cromatografia de vidro (volume de leito de 16 mL) e equilibre com 10 mM de tampão Tris-HCl (pH 7,5) a 25 °C para 10 volumes de coluna.
2. Carregue 15 mL de extrato proteico bruto (seção 3.6) a uma vazão de 8 mL/min.
3. Lave a coluna com buffer de equilíbrio até que a absorção a 280 nm caia abaixo de 0,05.
4. Proteínas ligadas a eluto usando um gradiente linear de 0-500 mM de NaCl em 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) sobre 500 mL a 8 mL/min.
5. Colete frações de 5 mL, monitore a absorção em 280 e 220 nm, e mantenha frações no gelo. Armazene frações a 4 °C até triagem antimicrobiana e análise de proteínas.

6. SDS-PAGE e mancha de prata

NOTA: Prepare soluções de mancha de prata em uma exaustão química e use equipamentos de proteção individual apropriados. Prepare todas as soluções de forma revigorante.

Separe frações de proteína usando 12% de SDS-PÁGINA¹² e visualize as bandas por coloração de^{prata 13}.
Retirar as bandas proteicas-alvo e enviar amostras para análise de EM MALDI-TOF.
Identifique proteínas por meio de pesquisa em banco de dados com NCBInr.

7. Previsão de peptídeos antimicrobianos

Recuperar sequências de proteínas candidatas a partir da análise NCBInr.
Avalie o potencial antimicrobiano usando ferramentas públicas de predição de AMP (por exemplo, DBAASP, APD3, AMPScanner, CAMPR4) e bancos de dados.
Extrair os resultados da predição, incluindo escores de probabilidade antimicrobiana, classificação prevista e propriedades fisicoquímicas (carga líquida, conteúdo de resíduos hidrofóbicos, índice GRAVY [ExPASy ProtParam] e anfipaticidade).
Integrar resultados computacionais entre todas as plataformas para priorizar proteínas antimicrobianas candidatas para validação posterior.
NOTA: Previsões in silico apoiam a seleção candidata e não constituem classificação definitiva dos peptídeos antimicrobianos.

8. Testes estatísticos

Realize todos os experimentos em triplicado biológico. Analise os dados usando ANOVA unidirecional seguida do teste de múltiplos intervalos de Duncan ou análises post-hoc apropriadas com um nível de confiança de 95%.

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Resultados

O fluxo de trabalho desenvolvido baseado em proteínas intactas, integrando extração otimizada de proteínas, fracionamento por troca iônica, triagem antimicrobiana e identificação de proteínas, permitiu com sucesso a detecção de frações bioativas de proteínas em Tetraspora sp. CU2551. Este protocolo foi projetado para minimizar artefatos de fundo enquanto preserva a integridade da proteína nativa, permitindo que a atividade antimicrobiana seja diretamente associada a frações crom...

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Discussão

Para obter leituras antimicrobianas confiáveis usando esse protocolo, várias etapas críticas devem ser cuidadosamente controladas, especialmente durante a extração de proteínas e a triagem inicial da bioatividade. Otimizar o tampão de lise é essencial, pois a inibição de fundo pelos componentes do tampão é uma fonte frequente de resultados falsos positivos na triagem de proteínas antimicrobianas. A atividade antimicrobiana observada na formulação tampão^{original 11}...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa da Escola de Ciências, Instituto de Tecnologia King Mongkut de Ladkrabang, concedidas a C. Maneeruttanarungroj (RA/TA-2566-M-013) e pelo Instituto de Tecnologia King Mongkut de Ladkrabang, fornecidas a Y. Tonawut (KREF016329). A análise por espectrometria de massa foi realizada pela Unidade de Serviço de Proteômica, Faculdade de Tecnologia Médica, Universidade Mahidol, Tailândia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de Acrilamida/Bis-acrilamida	Laboratórios Bio-Rad	1610156	Para preparação em gel SDS-PAGE Categoria: Química
Lâmpada de Álcool / Bico Bunsen	Vários	—	Para técnica asséptica Categoria: Instrumento
AMPScanner	Universidade George Mason (Veltri et al.)	—	Ferramenta de predição de AMP baseada em aprendizado profundo Categoria: Software / Banco de Dados
Ferramentas de Previsão de Peptídeos Antimicrobianos (DBAASP, APD3, AMPscanner, CAMPR4)	Diversas fontes acadêmicas	—	Análise AMP in silico Categoria: Software / Banco de Dados
APD3	Laboratório Wang, Universidade de Nebraska	—	Banco de Dados de Peptídeos Antimicrobianos Categoria: Software / Banco de Dados
Autoclave	Tomy	—	Esterilização de meios e materiais Categoria: Instrumento
Armário de Biossegurança Classe I/II	Vários	—	Manuseio asséptico Categoria: Instrumento
BioTool 2.0	Bruker Daltonics	—	Ferramenta para visualizar espectros e peptídeos da EM Categoria: Software
Reagente de Bradford	Merck	B6916	Quantificação de proteínas Categoria: Química
CAMPR4	Instituto Indiano de Tecnologia de Bombaim	—	Coleção de peptídeos antimicrobianos Categoria: Software / Banco de Dados
Centrífuga, Microcentrífuga refrigerada Eppendorf 5415R	Eppendorf	—	Microcentrifugação Categoria: Instrumento
Centrífuga, Thermo Scientific Megafuge 8R	Thermo Fisher Scientific	—	Centrifugação de grande volume Categoria: Instrumento
Coluna de Cromatografia (Vidro)	Vários	—	Cromatografia por troca iônica Categoria: Vidraria
CM-Sepharose Resina	Merck	CEF100	Resina de troca catiônica Categoria: Química (Resina)
Cotonete	Vários	—	Inoculação bacteriana Categoria: Plásticos
Cuvette, Quartz	Hellma Analytics	—	Espectrofotometria UV Categoria: Vidros
DBAASP	Instituto de Química Bioorgânica (Rússia)	—	Banco de dados de atividade antimicrobiana e estruturas peptídicas Categoria: Software / Banco de dados
Resina DEAE-Sepharose	Merck	DEFF100	Resina de troca de ânions Categoria: Química (Resina)
Frasco Erlenmeyer, 100 mL	Vários	—	Cultivo de algas Categoria: Vidraria
Frasco Erlenmeyer, 500 mL	Vários	—	Cultivo de algas Categoria: Vidraria
Escherichia coli TISTR 074	TISTR, Tailândia	—	Micro-microrganismos testados Categoria: Material biológico
ExPASy ProtParam	Instituto Suíço de Bioinformática	—	Ferramenta online para calcular propriedades fisicoquímicas de proteínas Categoria: Software / Banco de Dados
Formaldeído	Merck	1.04002	Coloração de prata Categoria: Química
Freezer (-20 ° C)	Vários	—	Armazenamento de amostras Categoria: Instrumento
Sistema de Eletroforese em Gel (Mini-PROTEAN Tetra)	Laboratórios Bio-Rad	—	SDS-PAGE Categoria: Instrumento
Tubo de ensaio de vidro (16 e vezes 150 mm)	Pyrex / Duran	—	Manuseio de amostras Categoria: Vidraria
Luvas, Nitrilo	Vários	—	Proteção pessoal Categoria: Louças plásticas
Pare o Coquetel de Inibidores de Protease (100x)	Thermo Fisher Scientific	87786	Inibição de protease Categoria: Química
Incubadora	Vários	—	Cultura bacteriana Categoria: Instrumento
Shaker Incubador	Vários	—	Cultura de algas Categoria: Instrumento
Anilha inoculante	Qualquer fornecedor de laboratório	—	Transferência microbiana Categoria: Consumíveis
KCl	Merck	P5405	Preparação de tampão Categoria: Químico
Espectrômetro de Massa MALDI-TOF (Reflex IV)	Bruker Daltonics	—	Identificação de proteínas Categoria: Instrumento
MASCOTE	Ciência Matricial	—	Mecanismo de busca para identificação de proteínas via dados MS Categoria: Software / Banco de Dados
MASCOTE 2.2	Ciência Matricial	—	Identificação de proteínas Categoria: Software
Cilindro de Medição	Pyrex	—	Medição de volume Categoria: Vidro
Tubo de Microcentrífuga (1,5 mL)	-	—	Processamento de amostras Categoria: Utensílios plásticos
Tubo de Microcentrífuga (2,0 mL)	-	—	Processamento de amostras Categoria: Utensílios plásticos
Micropipeta (100– 1000 & micro; L)	-	—	Manuseio de líquidos Categoria: Instrumento
Micropipeta (1– 10 & micro; L)	-	—	Manuseio de líquidos Categoria: Instrumento
Micropipeta (1– 5 & micro; L)	-	—	Manuseio de líquidos Categoria: Instrumento
Micropipeta (1– 5 mL)	-	—	Manuseio de líquidos Categoria: Instrumento
Micropipeta (20– 200 & micro; L)	-	—	Manuseio de líquidos Categoria: Instrumento
Leitor de Microplacas	BioTek	—	Medição OD600 Categoria: Instrumento
Mueller– Ágar/Caldo Hinton	Vários	—	Ensaios antimicrobianos Categoria: Médio
Espectrofotômetro Nanodrop / Biodrop	Vários	—	Medição de proteínas Categoria: Instrumento
Banco de dados NCBInr	Centro Nacional de Informação em Biotecnologia	—	Banco de dados proteico não redundante Categoria: Software / Banco de Dados
Ágar Nutritivo	-	—	Cultura bacteriana Categoria: Média
Disco de papel (6 mm)	Whatman nº 42	—	Ensaio de difusão em disco Categoria: Plásticos
Placa de Petri	Vários	—	Cultura microbiana Categoria: Utensílios plásticos
Medidor de pH	Mettler Toledo	—	Ajuste de pH Categoria: Instrumento
Buffer de fosfato (10 mM, pH 7,0)	-	—	Buffer de cromatografia Categoria: Buffer
Sonda Sonicadora (VCX500)	Sonics & Materials Inc.	—	Perturbação celular 500 W, 20 kHz, com sonda Categoria: Instrumento
Geladeira (4 & deg; C)	Vários	—	Armazenamento de amostras Categoria: Instrumento
Nitrato de Prata	Laboratórios de Pesquisa Sisco	94118	Coloração de prata Categoria: Química
Cloreto de Sódio (NaCl)	Merck	S9888	Elution buffer Categoria: Química
Dodecilsulfato de Sódio (SDS)	Laboratórios Bio-Rad	11667289001	Lisis e PAGE Categoria: Química
Espectrofotômetro	Shimadzu	—	Medição de absorvancia Categoria: Instrumento
Centrífuga de desaceleração	Eppendorf	—	Centrifugação rápida Categoria: Instrumento
Staphylococcus aureus TISTR 746	TISTR, Tailândia	—	Micro-microrganismos testados Categoria: Material biológico
Estreptomicina	Merck	S9137-25G	Controle positivo Categoria: Químico
Tetraspora sp. CU2551	Coleção Cultural KMITL	—	Cepa de algas Categoria: Material biológico
Meio de fosfato de acetato tris (TAP)	-	—	Cultura de algas Categoria: Média
Tris-HCl	Merck	—	Preparação do buffer Categoria: Buffer
Calibre Vernier	Vários	—	Medição de zona Categoria: Instrumento
Banho-maria	Vários	—	Controle de temperatura Categoria: Instrumento
XMASS	Bruker Daltonics	—	Software de espectrometria de massa MALDI-TOF Categoria: Software
Ácido &alfa;-Ciano-4-hidroxicinâmico (CHCA)	Bruker Daltonics	—	Matriz MALDI Categoria: Química

Referências

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