Este protocolo descreve um método de extração ácido-solvente em duas fases para isolar ácidos graxos de cadeia curta de amostras fecais de camundongos de baixa entrada sem derivatização.
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Artigo de método
Extração de Ácidos Graxos de Cadeia Curta de Fezes de Camundongos Usando um Método Ácido-Solvente de Duas Fases
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este artigo descreve um protocolo para extração de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) de amostras fecais de camundongos de baixa entrada utilizando uma estratégia de extração ácido-solvente em duas fases. O método é projetado para entradas fecais individuais de aproximadamente 20–50 mg e utiliza ácido clorídrico diluído e acetato de etila para permitir a separação de fases sem derivatização. O protocolo consiste em homogeneização fecal, acidificação, partição de solventes orgânicos e centrifugação em baixa temperatura, podendo ser realizado utilizando equipamentos laboratoriais padrão comumente disponíveis em laboratórios de pesquisa. Após a extração, os SCFAs são adequados para análise a jusante por plataformas rotineiras baseadas em cromatografia gasosa. A execução bem-sucedida do protocolo é indicada pela detecção de picos de SCFA claramente resolvidos em tempos característicos de retenção acima do ruído de fundo, como demonstrado para grandes SCFAs fecais, incluindo acetato, propionato e butirato de amostras individuais de camundongos. Este protocolo aborda um desafio procedural comum em estudos com pequenos animais, fornecendo um fluxo de trabalho padronizado para extração de SCFA fecal a partir de material amostrado limitado, mantendo a compatibilidade com fluxos de trabalho analíticos rotineiros.
Introdução
Esse protocolo foi desenvolvido para possibilitar a extração de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) de amostras fecais de camundongos de baixa entrada em um formato compatível com análise rotineira baseada em cromatografia gasosa (GC). As SCFAs são ácidos graxos orgânicos voláteis com menos de seis átomos de carbono, incluindo principalmente ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico, que são produzidos pela microbiota intestinal através da fermentação de fibras alimentaresindigestíveis 1. Quantificar esses metabólitos de camundongos individuais é frequentemente necessário em estudos com pequenos animais, onde o material fecal é limitado, e as amostras estão ligadas a fenótipos comportamentais, metabólicos ou fisiológicos 2,3,4,5,6. Portanto, é necessário um fluxo de trabalho prático e de baixa entrada de extração para apoiar desenhos experimentais que dependam de medições SCFA por animal.
Abordagens existentes para análise de SCFA fecal apresentam várias restrições metodológicas. Quantificar SCFAs em amostras fecais continua sendo um desafio analítico devido à sua volatilidade, baixa abundância e complexidade das matrizesbiológicas 7. Fluxos de trabalho padrão frequentemente exigem etapas de derivatização, grandes volumes de amostras e equipamentos especializados, como manuseio automatizado de líquidos, plataformas de homogeneização especializadas ou colunas de extração em fasesólida 8, 9, 10, 11. Esses requisitos podem limitar a acessibilidade e a escalabilidade, especialmente em estudos com camundongos onde a produção fecal por animal é mínima e a amostragem longitudinal ou específica de genótipo é comum 12,13,14. Como resultado, permanece uma lacuna metodológica para protocolos que permitem a extração de SCFA de pequenas fezes sem derivatização, mantendo a compatibilidade com os fluxos de trabalho padrão de cromatografia gasosa.
O protocolo descrito aqui aborda essa lacuna empregando uma estratégia de extração ácido-solvente em duas fases usando ácido clorídrico diluído e acetato de etil. O fluxo de trabalho consiste em homogeneização fecal, acidificação, particionamento de solventes orgânicos e centrifugação em baixa temperatura, e é projetado para operar com pequenas massas fecais de entrada. Ao contrário dos fluxos de trabalho baseados em derivatização, que exigem etapas adicionais de modificação química ou plataformas especializadas de preparação de amostras, esse protocolo permite a extração direta de SCFAs em um formato compatível com análise rotineira baseada em GC usando equipamentos laboratoriaispadrão 2.
Esse método é destinado a estudos que exigem extração de SCFA de quantidades limitadas de material fecal de camundongo, especialmente quando são necessárias medições em nível individual ou quando a disponibilidade de amostras limita o desenho experimental. É adequado para análise baseada em GC de SCFAs comuns (C2–C6) em amostras fecais, mas não foi projetado para aplicações que exigem detecção dependente da derivatização, quantificação ultra-traço além da sensibilidade ao GC ou avaliação de concentrações sistêmicas de SCFA.
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Protocolo
O Comitê Permanente de Animais do Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, EUA, aprovou o protocolo animal anterior, que foi projetado para minimizar o número de animais utilizados. Este protocolo segue as diretrizes e regulamentos dos Institutos Nacionais de Saúde. Este manuscrito foi elaborado de acordo com as diretrizes da ARRIVE. O diagrama do protocolo é mostrado na Figura 1, e os materiais necessários estão listados na Tabela de Materiais.
Figura 1: Diagrama do protocolo. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
1. Coleta e preparação de amostras fecais
- Colete amostras frescas de fezes (~30 mg) em tubos separados de microcentrífuga de 1,5 mL. Registre a massa exata de entrada fecal de cada amostra para permitir a normalização precisa das concentrações de SCFA.
NOTA: Certifique-se de que a coleta inclua frascos, luvas e pinças limpas para cada amostra. Todo o vidro e instrumentos devem ser autoclavados antes do uso. Esse protocolo foi validado para massas de entrada fecal de aproximadamente 20–50 mg por amostra, sendo ~30 mg usados como entrada representativa. Os volumes de extração são mantidos constantes dentro dessa faixa. - Coloque e rotule o número necessário de frascos de centrífuga correspondentes às amostras.
- Prepare ácido clorídrico diluído (0,5 M; pH 1–2) adicionando lentamente HCl concentrado (12 M, grau de reagente ACS) à água ultrapura.
ATENÇÃO: HCl é corrosivo; Pode causar queimaduras graves na pele, nos olhos e nas vias respiratórias. Perigoso de inalar. - Descongele as amostras em temperatura ambiente por 30–45 minutos, ou até que descongelem completamente.
2. Homogeneização e acidificação da amostra
- Adicione 255 μL da solução de 0,5 M de HCl a cada frasco da centrífuga.
- Pegue um frasco novo e encha com etanol 70% para usar na limpeza da pinça. Limpe as pinças mergulhando-as no etanol e depois secando-as em um papel toalha limpo.
ATENÇÃO: O etanol é inflamável e pode irritar pele e olhos; a inalação de vapores pode causar tontura. - Prepare um banho de etanol para os pilões, colocando-os em um recipiente e enchendo o recipiente com 70% de etanol até que todos os pilões fiquem completamente submersos.
- Retire a amostra correta da caixa de amostras. Tire a tampa do frasco e retire uma amostra (~ 30 mg) de fezes.
- Coloque as amostras fecais nos frascos correspondentes da centrífuga.
- Depois que todas as amostras são colocadas nos frascos corretos da centrífuga, remova um pilão do banho de etanol. Seque o pilão com uma toalha de papel limpa.
NOTA: Use um pilão novo para cada amostra. - Use os pilões para esmagar e dissolver corretamente as amostras de fezes, veja a Figura 2. Moa a amostra fecal até obter uma suspensão visualmente homogênea, sem fragmentos sólidos visíveis.
Figura 2: Moagem de amostras fecais usando um pilão. As fezes recém-coletadas são moídas para alcançar consistência uniforme para análise SCFA. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.
- Coloque os pilões usados em uma caixa vazia para lavar depois.
- Faça vórtice das amostras usando um misturador de vórtice do tipo pulso na velocidade máxima por 10 s, com tubos fortemente fechados.
NOTA: Certifique-se de que os frascos da centrífuga estejam bem cobertos para evitar derramamento da mistura.
3. Extração e separação de fases de SCFA
- Centrifuge as amostras a 16.000 × g por 10 minutos a 4 °C, garantindo o equilíbrio adequado da centrífuga.
- Após iniciar a centrífuga, rotule os novos frascos correspondentes às amostras. Remova as amostras da centrífuga assim que a centrifugação estiver concluída.
- Ajuste a pipeta de 200 μL para 120 μL. Colete cuidadosamente 120 μL do sobrenadante aquoso após a centrifugação, evitando perturbações do pellet. Transfira o sobrenadante para os frascos da centrífuga recém-rotulados e descarte o pellet.
- Adicione uma quantidade igual (120 μL) de acetato de etila nos frascos recém-rotulados com o líquido sobrenadante. Repita isso para todas as amostras.
ATENÇÃO: O acetato de etila é inflamável e pode irritar pele, olhos e sistema respiratório. Evite inalar vapores e contato prolongado. - Leve as amostras para a centrífuga novamente. Certifique-se de que a centrífuga esteja devidamente equilibrada e que a tampa do rotor esteja segura. Centrifuge a 2.374 × g por 20 minutos a 4 °C.
- Após a centrifugação, colete cuidadosamente 120 μL da fase orgânica superior sem perturbar a fase aquosa inferior. Transfira o sobrenadante extraído contendo SCFA para novos frascos de centrífuga rotulados.
NOTA: O volume coletado pode ser inferior a 120 μL. Se houver uma emulsão presente na interface, estenda a centrifugação ou resfrie as amostras no gelo até que a separação clara de fases seja alcançada. Amostras em branco processadas em paralelo sem material fecal podem ser incluídas como uma etapa opcional de controle de qualidade para avaliar os níveis de fundo dos SCFAs introduzidos por reagentes ou manuseio. - Examine frascos anteriores para garantir que a camada inferior não tenha sido levantada acidentalmente.
NOTA: As etapas envolvendo adição de ácido e manuseio com solventes orgânicos devem ser realizadas rapidamente, mantendo os tubos fechados sempre que possível, para minimizar perdas por volatilização ou evaporação.
4. Manuseio e armazenamento de extração
- Localize e etiquete corretamente uma caixa de extração, depois coloque as amostras extraídas dentro dela.
NOTA: As amostras podem ser pausadas com segurança após a coleta da fase orgânica, armazenando os extratos a −20 °C por até 24 horas em tubos fortemente fechados, e depois transferidas para −80 °C para armazenamento de longo prazo. - Coloque a caixa em um freezer a -80 °C para aguardar a análise SCFA.
NOTA: Como tanto o acetato de etilo quanto o SCFA são altamente voláteis, as amostras extraídas devem ser analisadas prontamente após o armazenamento a −80 °C. Armazenamento prolongado a longo prazo pode comprometer a integridade da amostra.
5. Análise de cromatografia gasosa
- Analise os SCFAs extraídos por GC usando uma coluna capilar de sílica fundida com fase estacionária de ácido graxo livre a vazões de 30, 300 e 20 mL/min para hidrogênio, ar e nitrogênio, respectivamente. Injete uma alíquota de 1 μL do extrato orgânico para análise.
- Para aplicações quantitativas, incorpore padrões internos e procedimentos de calibração (por exemplo, ácido 2-etilbutírico) conforme descritoanteriormente 2.
NOTA: Configurações detalhadas específicas de cada instrumento são fornecidas nos métodosreferenciados 14.
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Resultados
O protocolo acima terá fornecido alíquotas extraídas de SCFA de 120 μL, correspondentes ao número de amostras fecais das quais foram derivadas. A execução bem-sucedida do protocolo de extração é indicada pela presença de picos SCFA claramente resolvidos em tempos característicos de retenção, com intensidade do sinal acima do ruído de fundo. Quando realizado conforme descrito, o protocolo fornece perfis SCFA fecais adequados para comparação quantitativa posterior entre amostras. Quantific...
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Discussão
Este protocolo contém várias etapas críticas que garantem a extração eficiente e reprodutível de SCFAs de amostras fecais de camundongos de pequeno volume. O protocolo emprega um sistema de extração ácido-solvente em duas fases usando volumes definidos de ácido clorídrico diluído e acetato de etil, adaptado às propriedades fisicoquímicas dos SCFAs como ácidos orgânicos fracos e de baixo peso molecular. A acidificação desloca os SCFAs para sua forma protonada, reduzindo as interações iôni...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos com gratidão o apoio financeiro a este estudo fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde por meio de R21AG065606 e R21AG08176 concedido a Yiying Zhang, bem como o apoio da Fundação Familiar Borten e do doativo da Família Tang para Yiying Zhang.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Centrifuge | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| Centrifuge vials | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microtube Rack | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Ethyl acetate | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99.5% |
| Green pestles | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Certified (10 N, solução de estoque); diluído para 0,5 M para uso |
| 1000 µL pipette | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 µL pipette tips | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | Molecular Biology Grade, solução 70% |
| 200 µL pipette | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 µL pipette tips | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Tweezers | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vortex | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
Referências
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Reimpressões e permissões
