Avaliação funcional da barreira epitelial gengival de camundongos usando traçadores fluorescentes

Summary

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem padronizada para avaliar quantitativamente a integridade da barreira epitelial gengival murina, aplicando topicamente dextranos marcados com fluorescência de diferentes tamanhos moleculares na superfície gengival in vivo, seguido por imagens ex vivo usando um sistema de microscopia de fóton único.

Abstract

A barreira epitelial gengival serve como uma defesa fundamental na linha de frente na imunidade oral e na homeostase. Uma barreira epitelial intacta impede efetivamente a penetração de substâncias nocivas no ambiente oral, enquanto sua perturbação está intimamente associada à patogênese de condições como periodontite e líquen plano oral. Aqui, estabelecemos um método baseado em aplicações tópicas para avaliar a integridade da barreira epitelial gengival em camundongos. Primeiro, uma mistura de dextranos marcados com fluorescência e diferentes pesos moleculares (40 ou 70 kDa) em uma carboximetilcelulose de sódio a 2% foi aplicada topicamente na superfície gengival labial da região molar. Após um período de incubação de 30 minutos, a maxila era dissecada e fixada em um suporte personalizado para imagem imediata usando um sistema de microscopia de fóton único. Essa abordagem permite a visualização e quantificação de traçadores de diferentes tamanhos nas camadas epiteliais, fornecendo uma leitura funcional da integridade da barreira epitelial gengival aplicável a estudos de inflamação oral, cicatrização de feridas e modelagem de doenças.

Introduction

A barreira epitelial gengival constitui uma interface defensiva crítica na cavidade oral, preservando a integridade dos tecidos ao regular seletivamente o transporte da substância enquanto previne a invasão^{microbiana 1}. Composta por epitélio escamoso estratificado interligado por complexos de junção apertada, essa estrutura dinâmica controla precisamente a permeabilidade paracelular para restringir a penetração não seletiva de microrganismos, macromoléculas e^{solutos 2}. Múltiplos fatores podem comprometer a integridade da barreira gengival. A cavidade oral abriga a segunda comunidade microbiana mais diversa do corpo humano, com mais de 700 espécies bacterianas colonizando superfícies dentárias, fendas gengivais e mucosa^{oral 3,4}. As células epiteliais que revestem os tecidos gengivais estão persistentemente expostas a esse denso ambiente^{microbiano 5}.

Fatores de virulência secretados por patógenos periodontais (por exemplo, Porphyromonas gingivalis), incluindo lipopolissacarídeos, demonstraram interromper a função da barreira epitelial, desencadeando respostas inflamatórias nos tecidos gengivais e impulsionando a progressão patológica ^6,7. Mediadores inflamatórios e estressores mecânicos agravam ainda mais a disfunção da barreira, aumentando a suscetibilidade a doenças^{orais 8}. Probióticos orais podem ajudar a prevenir a doença periodontal ao promover a estabilidade da barreira epitelial gengival. No entanto, as interações biológicas entre microrganismos e células epiteliais gengivais na modulação da função da barreira permanecem em grande parte não esclarecidas^. Assim, o desenvolvimento de métodos confiáveis para avaliar a função da barreira epitelial é de importância fundamental.

A microscopia de varredura a laser de fóton único, reconhecida por sua alta resolução e sistema de detecção estabelecido, tem se mostrado particularmente valiosa para examinar amostras de tecido ex vivo ¹⁰. Metodologias avançadas de imagem melhoram significativamente a avaliação das propriedades da barreira gengival. A natureza superficial dos tecidos gengivales, com células epiteliais localizadas aproximadamente a 100 μm da superfície, o torna ideal para tais abordagens de imagem. Nossa pesquisa estabeleceu uma técnica de avaliação ex vivo utilizando dextranos marcados com fluorescência de diferentes pesos moleculares como traçadores de permeabilidade paracelular. Combinado com microscopia de varredura a laser de fóton único, esse método permite a quantificação precisa da função da barreira epitelial gengival, fornecendo insights sobre os mecanismos da doença periodontal e possíveis intervenções terapêuticas.

O protocolo estabelecido neste estudo, que combina entrega localizada de traçadores à base de gel com imagens tridimensionais ex vivo, é especificamente otimizado para enfrentar os desafios únicos de avaliar a barreira epitelial gengival. Primeiro, as abordagens existentes de injeção intravenosa de traçadores (Tabela 1) não conseguem avaliar com precisão a permeabilidade de sítios epiteliais minúsculos localizados a agentes^{externos 11}. Segundo, abordagens histológicas tradicionais requerem descalcificação e separação, que perturbam a arquitetura dos tecidos e são trabalhosas e^demoradas 12,13,14. Em contraste, nosso protocolo utiliza um gel altamente adesivo para alcançar uma retenção eficaz de traçadores na superfície local complexa. Além disso, por meio de uma imagem 3D, garante uma quantificação precisa e não destrutiva da profundidade e distribuição de penetração do traçador dentro do epitélio gengival, preservando assim totalmente a arquitetura espacial do tecido. Consequentemente, esse método é particularmente adequado para avaliação espaço-temporal de alta resolução da função da barreira epitelial gengival no ambiente oral complexo e confinado.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética de Pesquisa Animal, Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Pequim, e estavam em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Publicação NIH nº 85-23, revisada em 1996). Durante o processo, os animais experimentais foram cuidadosamente tratados para minimizar sua dor e desconforto.

Os detalhes de cada etapa de trabalho para avaliação da permeabilidade in vivo em epitélios gengivais de camundongos são descritos abaixo (Figura 1A). Aqui, fornecemos um exemplo de detecção da função da barreira epitelial tanto em modelos de periodontite de camundongos induzidos por ligadura quanto por Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). Todo o pessoal recebeu treinamento abrangente em bem-estar de animais de laboratório e técnicas assépticas.

1. Manejo de animais

1. Ao longo do estudo, os animais em casa sob condições padrão específicas livres de patógenos (FPS) com um ciclo de 12 horas de luz/escuro e forneçam alimento e água ad libitum.
2. Preparação e administração de anestésicos e traçadores
   1. Mantenha condições estéreis durante todo o protocolo e utilize ferramentas limpas com 75% de etanol.
   2. Use camundongos machos do tipo selvagem (WT) C57BL/6J na faixa etária adulta adulta de 8 a 10 semanas para o experimento. Divida os camundongos em três grupos: um grupo controle (não tratado) e dois grupos experimentais (modelos de periodontite induzida por ligação e P. gingivalis).
      NOTA: Em agrupamento, camundongos com peso corporal e idade de uma semana semelhantes devem ser selecionados para reduzir a influência da idade e peso na permeabilidade epitelial gengival. Modelos de periodontite de camundongos induzidos por ligadura e P. gingivalis representam modelos de periodontite de camundongos comumente utilizados. Para protocolos detalhados de modelagem, consulte a literatura sobre modelos de^periodontite de camundongos induzidos por ligadura e ¹⁶ para periodontite de camundongos induzidos por ligadura.
   3. Selecione traçadores fluorescentes com espectros não sobrepostos, como o dextrano rotulado com FITC (40 kDa; FD40) e dextrano marcado com rodamina B (70 kDa; RD70), para garantir detecção distinta de sinais usando filtros FITC e rodamina correspondentes.
   4. Dilua os traçadores. Para seguir este protocolo, misture FD40 (1 g/L) e RD70 (1 g/L) em um gel de carboximetilcelulose a 2% e armazene a 4 °C.
   5. Injeta intraperitonealmente 1,25% de tribromoetanol (200 mg/kg de peso corporal, 15-17 μL/g de peso corporal) para anestesiar os camundongos.
      NOTA: As soluções de tribromoetanol são sensíveis à luz. O álcool tert-amílico é um solvente orgânico inflamável, volátil e irritante. Todos os procedimentos envolvendo preparação, manuseio e administração devem ser realizados em uma exaustão química ou em uma área extremamente bem ventilada, estritamente longe de quaisquer fontes de ignição. O pessoal deve usar equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo luvas, óculos de proteção química e jaleco. Descarte de resíduos: Solução de tribromoetanol de resíduos, álcool tert-amilo e todos os suprimentos contaminados (por exemplo, seringas, pontas de pipeta, luvas) devem ser coletados e descartados como resíduos químicos perigosos, em estrita conformidade com as regulamentações e protocolos de Saúde e Segurança Ambiental (EHS) da sua instituição para produtos químicos inflamáveis e tóxicos.
3. Durante a anestesia, mantenha a temperatura central do corpo em 37 ± 0,5 °C usando uma almofada térmica controlada por reação. Aplique pomada ocular de eritromicina para evitar o ressecamento da córnea.
   NOTA: Providencie o cuidado adequado para todos os animais durante o estudo.
4. Após procedimentos cirúrgicos, certifique-se de que os animais sejam acomodados individualmente em uma cama macia, em uma gaiola de recuperação quente e silenciosa até estarem totalmente despejados. Monitore os animais duas vezes ao dia por 48 horas e reintroduza-os na gaiola de casa somente após a recuperação completa, conforme avaliado pela postura, atividade e comportamento alimentar normais.
5. Mantenha a cavidade oral aberta com uma mordaça bucal e aplique uma mistura de 5 μL a 50 μL de dois ou mais traçadores de permeabilidade paracelular com diferentes pesos moleculares topicamente para a superfície gengival labial da região molar (Figura 1B). Saia por 30 minutos. Se o animal engolir a mistura, reaplique-a.
6. Isolamento da maxila
   1. Após 30 minutos de aplicação dos traçadores de permeabilidade, fixe os camundongos em papelão, colocando-os em posição supina e prenda seus membros com fita.
   2. Após a fixação, abra a cavidade oral para isolar a maxila. Limpe suavemente os tecidos ao redor e enxágue bem a amostra com PBS.
   3. Coloque a maxila sobre uma lâmina de vidro, com argila de modelar posicionada em ambos os lados para facilitar a montagem segura de uma cobertura sobre a amostra.

2. Configuração de microscópio de fóton único

1. Posicione cuidadosamente a maxila do camundongo dissecada sobre o suporte de amostras projetado sob medida, garantindo uma posição estável para a imagem.
2. Adquira imagens usando um microscópio vertical de fóton único equipado com um objetivo de imersão em água 25×/NA 1.0, focando na região de suporte montada abaixo da maxila.
   NOTA: Sinais de fluorescência devem ser visíveis imediatamente após a remoção do gel traçante.

3. Imagem da maxila

1. Comece a fazer a imagem imediatamente após selecionar a região de interesse na superfície bucal do segundo molar dentro da maxilar.
2. Adquira imagens Z-stack com tamanho de passo de 1 μm, começando pela superfície gengival da maxila até uma profundidade de 100-200 μm, para reconstrução tridimensional (3D).
3. Realize imagens da série Z para avaliar a permeabilidade da barreira epitelial no maxilar. Configure os parâmetros do software no software referenciado da seguinte forma:
   1. No menu Arquivo , crie uma nova pasta e atribua a ela um nome descritivo para o conjunto de dados.
   2. Na aba Aquisição, defina o formato XY para 512 × 512 com resolução de 0,99 μm/pixel.
   3. Defina o fator de zoom para 1.
   4. Ajuste os comprimentos de onda de excitação para 488 nm (FD40) e 561 nm (RD70), com janelas de emissão de 500-550 nm e 570-620 nm, respectivamente.
      NOTA: Os valores de ganho foram definidos para 50 (488 nm) e 60 (561 nm), respectivamente.
   5. Para a série Z e imagens 3D, selecione o modo ND Acquisition. Ajuste o Z-step para 1 μm (ajuste conforme necessário).
4. Uma vez configurados os parâmetros, selecione o modo Live para visualizar a área gengival tanto em canais individuais quanto em canais de fluorescência fundidos dentro da janela de imagem.
5. Clique em Executar Agora para iniciar a aquisição após a configuração dos parâmetros.

4. Medição de permeabilidade

1. Divida a intensidade de fluorescência de FD40 e RD70 em diferentes canais. Não é necessário subtração de antecedentes; fundir as fatias do eixo Z. Depois, use o software ImageJ para calcular a intensidade de fluorescência e avaliar a permeabilidade e indicar a função da barreira epitelial.
   1. Clique em Arquivo e selecione Abrir para abrir a imagem maxilar tirada sob o microscópio de fóton único.
   2. Vá ao menu Imagem e mude o tipo de imagem para formato de 8 bits para análise.
      NOTA: Imagens capturadas por microscópios de fluorescência e sistemas confocais geralmente estão em formato RGB e não podem ser usadas diretamente para medição de intensidade de fluorescência. Eles precisam ser divididos em canais individuais ou imagens monocromáticas devem ser importadas diretamente.
   3. Abra o menu Analisar , escolha Definir Medidas e marque Área, Média e IntDen. Confirme clicando em OK.
   4. Selecione o canal a ser analisado e ajuste o limiar: Vá para Imagem | Ajustar | Limiar. O sistema aplicará automaticamente um valor padrão e um algoritmo, normalmente usando o vermelho para indicar regiões selecionadas.
      NOTA: Como imagens fluorescentes normalmente apresentam fundos pretos, também selecione a opção Fundo Escuro .
   5. Definir parâmetros de medição: Vá em Analisar e selecione Definir Medições. Na caixa de diálogo, marque Valor cinza médio e Limite até o limiar. Por fim, clique em OK.
      NOTA: Recomenda-se verificar o rótulo de exibição para que o nome da imagem apareça na tabela de resultados, facilitando a identificação do grupo experimental.
   6. Realize a medição: Selecione a ferramenta de Seleções à Mão Livre . Use o cursor para traçar manualmente e com precisão o contorno da região do sinal fluorescente no lado do tecido gengival. Clique em Analisar | Meça. A tabela de resultados aparecerá, onde o IntDen representa a intensidade de fluorescência.
2. Copie os resultados para uma planilha para cálculos e importe para gráficos.
3. Cálculo da Intensidade Relativa de Fluorescência: Primeiro, calcule a intensidade média de fluorescência do grupo controle. Depois, divida o valor da intensidade de fluorescência de cada grupo experimental pela média do grupo controle para obter a intensidade relativa de fluorescência.

Results

De acordo com o protocolo padronizado, a maxila do camundongo contendo os tecidos gengivais foi montada em um suporte personalizado (Figura 1C). O exame microscópico revelou sinais de fluorescência verde (FD40) e vermelho (FD70) na gengiva, demonstrando permeação traçante através da barreira epitelial. Após identificar a região de interesse sob a lente ocular, as imagens eram adquiridas usando o software. No grupo controle, ambos os traçadores fluorescentes ...

Discussion

O epitélio gengival serve como uma barreira física essencial contra invasão bacteriana, enquanto microrganismos orais exibem dupla capacidade regulatória, seja ao interromper a integridade da barreira com fatores de virulência ou promover sua manutenção. Essas interações biológicas determinam, em última análise, a homeostase tecidual ou a progressão da^{doença 17,18}. Com base nessa base, desenvolvemos uma abordagem metodológica ino...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 kDa FITC-labeled dextran	Sigma Aldrich	78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextran	Sigma Aldrich	R9379
Blunt tissue separation nickel	Bejinghuabo Company	NZW28
carboxymethylcellulose	MREDA	M049898
Disposable sterile syringe	Zhiyu Company		1 mL
ImageJ software	National Institutes of Health
Microtubes	Axygen	MCT-150-C	1,5 mL
NIS-Elements AR Image Software	Nikon
Phosphate buffered saline 1x	Servicebio	G4207-500
Single photon microscope Nikon A1 MP+	Nikon
Tissue scissors	Bejinghuabo Company	M286-05