Usando imagens em time-lapse, é possível acompanhar todo o processo de regeneração dos esferoides da Hydra . Este protocolo descreve a geração de esferoides Hydra , discute uma variedade de estratégias de montagem e detalha como realizar imagens ao vivo de longo prazo usando microscopia confocal de disco giratório, bem como microscopia de fluorescência de folha de luz.
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Artigo de método
Preparação e Imagem ao Vivo de Esferoides de Hidra em Regeneração
Neste artigo
Resumo
Resumo
Hydra é renomada por sua excepcional capacidade regenerativa. Notavelmente, pequenos fragmentos regenerantes de tecido da Hidra , chamados esferoides da Hidra , podem estabelecer um organizador de novo. Uma vez estabelecido, esse organizador direciona o tecido ao redor para se diferenciar nas estruturas orais apropriadas. Em poucos dias, o esferoide pode se desenvolver em um pólipo pequeno, porém totalmente padronizado. A escala de tempo relativamente curta desse processo permite imagens contínuas em time-lapse de todo o processo, oferecendo uma oportunidade única de estudar a dinâmica espaço-temporal da regeneração. Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho detalhado e apresentamos resultados representativos para gerar conjuntos de dados de time-lapse de esferoides da Hydra regenerando. O protocolo inclui um procedimento detalhado para geração de esferoides e diretrizes para selecionar amostras ótimas para imagem. Discutimos estratégias de montagem adequadas para a imagem de longo prazo de amostras vivas e demonstramos abordagens de imagem usando tanto microscópios confocais de disco giratório quanto microscópios de folha de luz. Os princípios descritos aqui são amplamente aplicáveis a outros sistemas modelo nos quais processos morfogenéticos dinâmicos podem ser estudados usando imagens de longo prazo.
Introdução
Hydra é um pequeno pólipo de água doce, mais conhecido por sua excepcional capacidade regenerativa. Fragmentos de tecido excisados do meio do corpo se dobra em um esferoide oco composto pelas duas camadas epiteliais da Hidra, o ectoderma e o endoderme. Durante a regeneração, esses esferoides da Hidra estabelecem um organizador denovo 1. Em aproximadamente 3 dias, o eixo do corpo se alonga, e as células nas extremidades da cabeça e do pé se diferenciam. Por causa desse período relativamente curto, todo o processo regenerativo pode ser capturado por meio de imagens ao vivo. Con....
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Protocolo
Todos os procedimentos descritos foram realizados em conformidade com as diretrizes éticas das regulamentações nacionais suíças para pesquisa animal. Antes de iniciar o experimento, a Hydra deve ser alimentada normalmente, 3 vezes por semana, por pelo menos 2 semanas. A Hydra usada nos experimentos deve ser saudável12, sem órgãos sexuais e sem brotação. Hidras recém-brotadas, que podem ser reconhecidas por seu comprimento menor em comparação com as outras hidras da colônia, também devem ser evitadas.
1. Preparação dos esferoides da Hidra<....
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Resultados
Geramos com sucesso conjuntos de dados de longo prazo de time-lapse para a regeneração de esferoides da Hydra usando tanto a microscopia confocal de disco giratório (SDCM) quanto a microscopia de fluorescência em folha de luz (LSFM). A regeneração ocorreu normalmente em ambos os sistemas de imagem: os esferoides romperam a simetria, alongaram-se e desenvolveram tentáculos e um pé em 3 dias (Figura 5A, Figura 6A,
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Discussão
Tanto SDCM quanto LSFM são bem adequados para gerar conjuntos de dados de longo prazo em time-lapse de esferoides Hydra em regeneração. Os princípios ópticos nos quais cada técnica se baseia são distintos e, portanto, oferecem vantagens e limitações únicas (Tabela 2). O SDCM é preferido quando não é necessário um olhar completo e de alta resolução da amostra. Múltiplas amostras podem ser visualizadas em um único experimento, tornando-o particularmente útil para .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Laure Plantard, da Instalação de Imagem Avançada e Microscopia da FMI, por sua valiosa contribuição. Esse trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Novartis.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 20×/0.8 Plan-Apochromat objective | Zeiss | 440640-9903-000 | Para microscopia confocal de disco rotativo |
| 20x/1.0 W Plan-Apochromat water dipping objective | Zeiss | 421452-9700-000 | Utilizado como objetivo de detecção no Zeiss Lightsheet 7 |
| Suporte impresso em 3D para montagem de câmara FEP | feito sob encomenda | ||
| Placa de imagem de fundo de vidro de 4 poços (#1.5H) | Ibidi | 80427 | |
| Agarosa | Carl Roth | 3810.4 | |
| Molde de alumínio para câmara FEP | feito sob encomenda | ||
| Cloreto de cálcio | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Ar comprimido | Durable | POWERCLEAN STANDARD 400 | |
| Placa de cultura celular (6 cm) | Thermo Fisher Scientific | 150288 | |
| D-(+)-glicose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Folha de FEP (espessura de 127 µm) | Adtech Polymer Engineering | ||
| FluoSpheres modificado por carboxilato (0,2 µm, vermelho escuro) | Thermo Fisher Scientific | F8807 | |
| Capilar de vidro | Brand | 701904 | |
| Pipeta pasteur de vidro (150 mm) | VWR | 612-1701 | |
| Hydra vulgaris | |||
| Software de imagem | Visitron | VisiView | Para microscopia confocal de disco rotativo |
| Microscópio de luz invertido | Zeiss | Axio observer 7 | Para microscopia confocal de disco rotativo |
| Microscópio de folha de luz | Leica | Viventis Deep LS2 | |
| Microscópio de folha de luz | Zeiss | Lightsheet 7 | |
| Agarosa de baixo ponto de fusão | Thermo Fisher Scientific | R0801 | |
| Cloreto de magnésio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sulfato de magnésio | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| Microscalpel | pfm medical | 200300745 | |
| Balão de pipeta | |||
| Transferpettor de haste de pistão | Brand | 701932 | |
| Cloreto de potássio | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Fogueira Bunsen de segurança | INTEGRA Biosciences | FIREBOY plus | |
| câmeras sCMOS | Photometrics | Prime 95B | Para microscopia confocal de disco rotativo |
| Bicarbonato de sódio | Fluka Analytical, Sigma-Aldrich | 71630 | |
| Citrato de sódio di-hidratado | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Piruvato de sódio | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Unidade de varredura confocal de disco rotativo (pinholes de 50 µm) | Yokogawa | CSU-W1 | Para microscopia confocal de disco rotativo |
| Estereoscópio | Leica | M80 | |
| TES | Sigma-Aldrich | T1375 | |
| Termoformador | Yuyao Jintai Machine Factory | Jintai JT-18 | |
| Prato de cultura de tecido (10 cm) | VWR | 734-2321 | |
| Tampão Tris-HCl | Roche Diagnostics | 10812846001 |
Referências
- Bode, P. M., Bode, H. R. Formation of pattern in regenerating tissue pieces of hydra attenuata: I. Head-body proportion regulation. Dev Biol. 78 (2), 484-496 (1980).
- Fütterer, C., Colombo, C., Jülicher, F., Ott, A. Morphogene....
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Reimpressões e permissões
