Atenuação mediada por Tanshinona-IIA da fibrose miocárdica pós-infarto via alterações de sinalização IL-33/ST-2 no tecido adiposo epicárdico de rato

Resumo

Este estudo demonstra que o Tanshinone IIA (Tan IIA) mitiga a fibrose pós-infarto do miocárdio, provavelmente por meio da modulação IL-33/ST2, conforme mostrado em modelos animais e acoplamento molecular, e validado por ELISA e Western blot.

Resumo

O infarto do miocárdio (IM), uma forma grave de doença arterial coronariana, frequentemente resulta em fibrose do miocárdio, um dos principais fatores que contribuem para disfunção cardíaca e insuficiência cardíaca. O tecido adiposo epicárdico (EAT) está cada vez mais implicado na patologia cardiovascular por meio da modulação da função cardíaca mediada por citocinas. Tanshinone IIA (TanIIA), um composto lipofílico derivado da Salvia miltiorrhiza, apresenta propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e anti-fibróticas. Este estudo teve como objetivo avaliar o potencial terapêutico do TanIIA para atenuar a fibrose miocárdica pós-MI e explorar seus mecanismos subjacentes usando uma abordagem integrativa que combina experimentos in vivo e análises in silico . Um modelo murino de MI foi estabelecido, e o acoplamento molecular foi empregado para avaliar a ligação do TanIIA a componentes-chave da via de sinalização do gene 2 expresso por interleucina-33/estimulação do crescimento (IL-33/ST2). Nossos resultados mostraram que o tratamento com TanIIA melhorou significativamente a função cardíaca, reduziu a lesão histológica e mitigou a fibrose miocárdica, juntamente com a diminuição dos níveis séricos do peptídeo natriurético N-terminal pró-cérebro (NT-proBNP) e da troponina cardíaca I de alta sensibilidade (hs-cTnI). TanIIA também atenuou respostas inflamatórias e estresse oxidativo no soro, miocárdio e EAT. Mecanicamente, o TanIIA reduziu a expressão de IL-33 e ST2, suprimiu a via do fator de diferenciação mieloide 88 (MyD88)/fator nuclear kappa-B (NF-κB) e reduziu os níveis do fator de crescimento transformante-β1 (TGF-β1). Análises in silico revelaram ainda que TanIIA exibia fortes afinidades de ligação para IL-33, ST2, MyD88 e NF-κB p65, com a interação mais estável prevista para ST2. Coletivamente, esses achados indicam que o TanIIA alivia a fibrose miocárdica induzida por MI ao modular a inflamação associada à EAT e o estresse oxidativo, potencialmente por meio da inibição multi-alvo do eixo IL-33/ST2. Esses resultados apoiam o TanIIA como um candidato terapêutico promissor para o manejo da fibrose miocárdica pós-infarto.

Introdução

O infarto do miocárdio, patologicamente definido como morte cardiomiocytária devido a isquemia prolongada, continua sendo um evento cardiovascular com risco^{de vida 1}. Apesar dos avanços significativos em estratégias de reperfusão e farmacoterapia, o IM continua sendo uma das principais causas de morbidade e mortalidade em^{todo o mundo 2,3,4,5,6}. Uma consequência fisiopatológica chave do IM é a fibrose miocárdica, a deposição excessiva de proteínas da matriz extracelular, que é um dos principais determinantes dos desfechos clínicos adversos^{subsequentes.} Essa cicatriz fibrótica, embora essencial para prevenir a ruptura da parede ventricular, frequentemente se torna um processo de reparo desadaptativo iniciado por vias complexas de sinalização inflamatória e intercelular 5,7,8,9,10. Ao substituir o miocárdio funcional por tecido cicatricial não contrátil, a fibrose desadaptativa leva ao aumento da rigidez ventricular, disfunção cardíaca progressiva e, por fim, insuficiência cardíaca ^9,11. Portanto, investigar novos tratamentos farmacológicos que visem e atenuem especificamente a fibrose pós-infarto é um objetivo terapêutico crítico para melhorar a morbidade e mortalidade do paciente a longo prazo.

Salvia miltiorrhiza (Danshen), uma medicina tradicional chinesa, e suas diversas preparações são amplamente empregadas para o manejo de doenças cardiovasculares. O Tanshinone IIA, seu principal constituinte lipofílico, é creditado com múltiplas propriedades cardioprotetoras, incluindo efeitos antiateroscleróticos, isquêmicos antimiocárdicos e^{antioxidantes} 12,13,14,15. Mecanisticamente, o TanIIA exerce seus efeitos anti-inflamatórios e anti-fibróticos modulando diversas vias de^{sinalização} 13,14,15,16,17. Notavelmente, foi demonstrado que o TanIIA ataca diretamente os adipócitos, suprimindo suas respostas inflamatórias e, assim, melhorando a disfunção celular¹⁸. No entanto, se esses efeitos protetores da TanIIA se estendem ao tecido adiposo epicárdico ainda precisa ser esclarecido.

O tecido adiposo epicárdico, um depósito visceral único de adiposo, está fortemente implicado na patogênese da doença arterial coronariana (DAC), fibrilação auricular (FA) e insuficiência cardíaca. Localizado anatomicamente entre o miocárdio e a camada visceral do epicárdio, sem uma camada fascial intermediária, o EAT facilita a comunicação paracrina direta com as estruturas cardíacas^adjacentes 19,20,21,22^. Em seu estado fisiológico, a EAT é cardioprotetora, fornecendo suporte metabólico e liberando adipocinas anti-inflamatórias e^{antioxidantes} 20,21,23,24,25,26. Por outro lado, durante condições patológicas, a EAT torna-se uma fonte de mediadores pró-inflamatórios, pró-oxidativos e pró-fibróticos que impulsionam remodelação cardíaca^adversa 27,28,29,30. Consequentemente, foi formulada a hipótese de que a TanIIA pode inibir a fibrose miocárdica ao atenuar as respostas inflamatórias e o estresse oxidativo na gordura epicárdica, potencialmente por meio de uma nova via de sinalização.

A interleucina-33, membro da família IL-1 de^{citocinas 31}, é reconhecida por suas potentes propriedades anti-hipertróficas e anti-fibróticas no sistema^{cardiovascular 25}. Seus efeitos biológicos são mediados por um complexo receptor distinto, ST2, que existe em duas isoformas: um receptor transmembrana (ST2L) que inicia a sinalização e um receptor de isca solúvel (sST2) que sequestra IL-33-32. Clinicamente, os níveis séricos de sST2 são agudamente elevados após um infarto do miocárdio (IM) e servem como um marcador prognóstico robusto para desfechos adversos em insuficiência cardíaca e miocardite 33,34,35,36. A cascata canônica de sinalização IL-33/ST2L envolve o recrutamento da proteína adaptadora MyD88 e a subsequente ativação do TRAF6, levando à fosforilação e degradação do inibidor de NF-κB (IκB) e à consequente translocação nuclear de NF-κB^37,38. Essa via está intrinsecamente ligada a outras citocinas inflamatórias chave; por exemplo, a sinalização IL-33/MyD88 pode promover a secreção da citocina anti-inflamatória IL-10-39, enquanto a citocina pró-inflamatória TNF-α pode, por sua vez, amplificar a resposta inflamatória ativando NF-κB para induzir a expressão de^{IL-33 40,41}. Importante destacar que tanto IL-33 quanto ST2 são expressas no tecido adiposo, onde se acredita que exercem efeitos anti-inflamatórios^locais 31,42,43. No entanto, se os efeitos cardioprotetores do TanIIA envolvem a modulação dos eixos IL-33/ST2 ainda não é explorado.

Portanto, o presente estudo foi projetado para testar a hipótese central de que o TanIIA previne a fibrose miocárdica ao mitigar a inflamação e o estresse oxidativo decorrentes do tecido adiposo epicárdico por meio da modulação da via IL-33/ST2. Especificamente, hipotetizamos que essa ação terapêutica é impulsionada pelo engajamento direto e multi-alvo do TanIIA com proteínas chave nessa cascata de sinalização. Para validar isso, adotamos uma abordagem dupla. Primeiro, um modelo de infarto do miocárdio em rato foi utilizado para confirmar a eficácia in vivo do TanIIA na atenuação da remodelação cardíaca adversa. Segundo, para fornecer uma base molecular direta para essas observações, o acoplamento computacional foi empregado para caracterizar a potencial ligação do TanIIA a quatro nós-chave da via — IL-33, ST2, MyD88 e NF-κB p65. Ao investigar o mecanismo desde o nível do tecido até eventos específicos de ligação molecular, este estudo visa estabelecer uma nova estrutura mecanicista para os efeitos cardioprotetores da TanIIA.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais e práticas de bem-estar animal foram realizados em estrita conformidade com os Regulamentos Éticos sobre o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Comitê Ético de Animais da Universidade de Medicina Chinesa de Jiangxi (nº JZLLSC2023-0702), China.

Simulações de acoplamento molecular
Uma abordagem de acoplamento molecular in silico foi empregada para explorar interações diretas entre TanIIA e IL-33, ST2L, MyD88 e NF-κB p65. As coordenadas 3D do TanIIA foram obtidas do banco de dados PubChem, e o arquivo SDF inicial foi posteriormente convertido para um formato PDB. A estrutura cristalina de IL-33 (PDB ID: 4KC3), ST2L (PDB ID: 4KC3), MyD88 (PDB ID: 7L6W) e NF-κB p65 (PDB ID: 1NFI) foi obtida do banco de dados de proteínas. O processamento inicial do receptor foi realizado no PyMOL (v2.3.4), onde moléculas de água e ligantes originais foram removidos, seguido por preparação adicional no AutoDockTools para adição de hidrogênio e atribuição de carga. Ambas as moléculas foram convertidas para o formato PDBQT. O AutoDock Vina (v1.1.2) foi utilizado para realizar a simulação de acoplamento dentro de uma grade box definida centrada no local ativo. A pose de ligação ideal foi selecionada com base na menor energia de ligação, e interações detalhadas foram identificadas usando a ferramenta web PLIP. A conformação final acoplada foi visualizada usando PyMOL (v2.3.4).

Animais
Ratos machos Sprague-Dawley (SD), classe SPF, com 6 semanas de idade e pesando 200 ± 20g (certificado nº SCXK(Su)2023-0009). Os ratos foram mantidos sob condições padronizadas, incluindo um ciclo de 12 horas de luz/escuro e temperatura de 22 °C ± 2 °C. Durante o experimento, os animais tiveram acesso ilimitado tanto à comida quanto à água.

Protocolo experimental
Um modelo de infarto do miocárdio em rato foi estabelecido por ligação da artéria coronária descendente anterior esquerda (LAD). Ratos operados por simulação passaram pelos mesmos procedimentos cirúrgicos sem a ligadura LAD. Brevemente, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% (50 mg/kg), seguido por intubação endotraqueal e ventilação. Foi realizada uma toracotomia esquerda para expor o coração. O LAD foi então ligado com uma sutura 4-0 não absorvível. A indução bem-sucedida do IM foi confirmada pela elevação do segmento ST em um eletrocardiograma contínuo e pelo clareamento visível da parede anterior do ventrículo esquerdo. Após a cirurgia, os ratos receberam cefoxitina sódica (200 mg/kg/d, i.p.) por três dias. Vinte e quatro horas após a cirurgia, os ratos sobreviventes foram aleatoriamente distribuídos em seis grupos (n = 10 por grupo):

Grupo simulado: recebeu injeções intraperitoneais de soro fisiológico (1 mL^·kg-1·^dia-1).

Grupo MI: recebeu injeções intraperitoneais de soro fisiológico (1 mL^·kg-1·^dia-1).

Grupo TanIIA-L (baixa dose): recebeu injeções intraperitoneais de TanIIA (7,5 mg·^kg-1·^dia-1).

Grupo TanIIA-M (dose média): recebeu injeções intraperitoneais de TanIIA (15 mg·^kg-1·^dia-1).

Grupo TanIIA-H (dose alta): recebeu injeções intraperitoneais de TanIIA (30 mg·^kg-1·^dia-1).

Grupo XST (controle positivo): receberam gavage oral de valsartano (30 mg·^kg-1·^dia-1).

Todos os tratamentos foram administrados diariamente por 28 dias consecutivos. As doses de TanIIA e XST foram selecionadas com base em estudos anteriores e em nossos dados preliminares não^{publicados 44,45}.

Eletrocardiograma (ECG) e ecocardiografia
Após 28 dias de tratamento, a função cardíaca foi avaliada por ecocardiografia transtorácica. Sob 2% de anestesia isoflurana (modo movimento), imagens em modo M foram adquiridas para determinar os diâmetros do ventrículo ventricular esquerdo na extremidade diastólica/sistólica (LVIDd/s). Fração de ejeção do ventrículo esquerdo (LVEF) e encurtamento fracionado (LVFS) foram posteriormente calculados a partir de uma média de três ciclos cardíacos consecutivos. Além disso, eletrocardiogramas foram registrados antes da cirurgia, 15 minutos após a ligadura e no ponto final experimental para monitorar a atividade elétrica cardíaca.

Amostragem e coloração com cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC)
O sangue da aorta abdominal foi centrifugado a 1370 × g por 15 minutos para isolar o soro, que foi armazenado a -80 °C. O coração e o tecido adiposo epicárdico foram rapidamente excisados e pesados. Para análises moleculares, os tecidos da EAT e da zona de fronteira do infarto foram congelados rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados a -80 °C. Outras amostras de tecido foram fixadas em paraformaldeído a 4% para exame histológico. Além disso, corações selecionados foram congelados a -20 °C, seccionados e corados com a tentativa de conceber para avaliar o tamanho do infarto. Materiais e tecidos animais são usados e manuseados em conformidade com as normas de segurança laboratorial.

Exame histológico
Para avaliação histopatológica, seções com parafina foram submetidas a coloração por hematoxilina e eosina (H&E) para observar a morfologia do miocárdio. A coloração tricroma de Masson foi utilizada para avaliar a extensão da fibrose miocárdica e o tamanho dos adipócitos epicárdicos, sendo quantificada a fração de volume de colágeno (CVF). Além disso, a proporção de colágeno tipo I para tipo III na área não infartada foi determinada por coloração de vermelho picrosírio (PSR). Todas as seções foram digitalizadas para análise quantitativa.

Imunohistoquímica
As seções do miocárdio embutidas com parafina foram desparafinizadas e reidratadas. A coleta de antígeno foi realizada utilizando um tampão de citrato (pH 6,0). As cesarias foram bloqueadas com 3% de BSA, depois incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra colágeno I, colágeno III, IL-33, ST2, MyD88, NF-κB p65 e TGF-β1. Posteriormente, as secções foram incubadas com um anticorpo secundário marcado com HRP por 1 h em temperatura ambiente. A coloração foi visualizada com DAB, e os núcleos foram contra-coloridos com hematoxilina. As imagens foram capturadas usando um scanner digital e analisadas com software de análise de imagens para quantificar a densidade óptica integrada (IOD) da coloração positiva.

Ensaio imunossorvente ligado a enzimas
As concentrações de hs-cTnI, NT-proBNP, IL-33 e ST2 foram quantificadas em amostras de soro. Além disso, os níveis de IL-10 e TNF-α foram medidos em soro, homogenatos miocárdicos e lisados de tecido adiposo epicárdico. Todos os ensaios foram realizados usando kits de ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) comercialmente disponíveis, de acordo com os protocolos do fabricante.

Western blot
Proteína total foi extraída de homogeneados tecidusuais e concentrações foram determinadas por ensaio de ácido bicinconínico (BCA). Quantidades iguais de proteína foram separadas por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio–poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF). Após bloqueio com leite desnatado a 5%, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários contra IL-10, fator de necrose tumoral α (TNF-α), IL-33, ST2, NF-κB p65, TGF-β1 e GAPDH (1:1000). Posteriormente, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário conjugado com HRP (1:5000) e visualizadas usando um reagente ECL. As intensidades das bandas foram quantificadas por software, e os níveis de proteína foram normalizados para GAPDH como controle interno.

Análise estatística
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando software de estatística médica. Os dados são apresentados como a média ± erro padrão da média. Para comparações entre dois grupos independentes, foi utilizado um teste t. No caso de múltiplos grupos, foi aplicado um ANOVA unidirecional ou bidirecional, seguido de um teste post hoc de Tukey. Para todas as análises, um P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Efeitos da TanIIA na função cardíaca em ratos com infarto do miocárdio (Figura 1)
Estado de saúde e mudanças no peso corporal: Ratos do grupo de IM apresentaram condição geral ruim, com distensão abdominal, enquanto ratos dos grupos TanIIA apresentaram melhora em estado de saúde, aumento na ingestão de alimentos e água, e maior atividade. Após 4 semanas, foi observado um aumento significativo no peso corp...

Discussão

O presente estudo investiga os efeitos da TanIIA na fibrose do miocárdio após um infarto do miocárdio, juntamente com os mecanismos subjacentes envolvidos. Os principais achados são os seguintes: (1) TanIIA atenua a remodelação cardíaca adversa e melhora a função cardíaca ao inibir a fibrose cardíaca. (2) A TanIIA foi encontrada inibindo a fibrose miocárdica ao atenuar as respostas inflamatórias e o estresse oxidativo na gordura epicárdica. (3) A TanIIA media efeitos antifibróticos atrav...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Quantificação de Proteínas BCA	Thermo Fisher Corporation	PICPI23223
Kit CAT	Biotecnologia de Ligações Enzimáticas de Xangai	202211202
Anticorpo de colágeno I	Wuhan Servicebio Biotechnology Co., Ltd	GB114197
Anticorpo de colágeno III	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL03186
Anticorpo GAPDH	Corporação de Tecnologia de Sinalização Celular	#5174
GraphPad Prisma	GraphPad Software Corporation	Versão 9.0
Kit GSH	Biotecnologia de Ligações Enzimáticas de Xangai	202211131
H& Solução de coloração E	Beijing Solarbio Technology Co., Ltd	H8070; G1100
Anticorpo anti-coelho de cabra marcado com HRP	Beijing Solarbio Technology Co., Ltd	SE134
Hs-cTnI  Uniforme	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	20220808
Anticorpo IL-10	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL03088
IL-10  Uniforme	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211172
IL-33  Uniforme	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211192
Anticorpo IL-33	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL04438
Software ImageJ	Institutos Nacionais de Saúde	versão Fiji
Image-Pro	Media Cybernetics, EUA	Versão 6.0
Ratos machos de Sprague-Dawley (SD)	Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd	SCXK(Su)2023-0009
Kit de coloração de maçã	Wuhan Bolf Biotechnology Co., Ltd	20221218
Kit MDA	Biotecnologia de Ligações Enzimáticas de Xangai	202211171
Anticorpo MyD88	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL02494
NT-proBNP  Uniforme	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	20220805
Fator nuclear kappa-B(NF-κ B)(p65) anticorpo	Abmart Corporation	TP56372
Babel Aberto	Projeto de toolkit de quimioinformática de código aberto	Versão 2.3.2
Membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF)	Merck Millipore	R9M2784
Solução PSR	Beijing Solarbio Technology Co., Ltd	G1472
Kit SOD	Biotecnologia de Ligações Enzimáticas de Xangai	202211201
Anticorpo ST2	Proteintech Group Corporation	11920-1-AP
Kit ST2	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211183
Soluções Estatísticas de Produto e Serviço (SPSS)	IBM Corporation	Versão 26.0
Injeção de Sulfotanshinona de Sódio	Shanghai Pharmaceutical First Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd	2012303
Reagente de luminescência ECL super sensível	Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd	MA0186
TGF-β 1 Anticorpo	ABclonal Corporation	A2124
Cápsula Titanvin Valsartan	Hunan Qianjin Xiangjiang Pharmaceutical Co., Ltd	211120
TNF-&alfa;   Uniforme	Shanghai Yuanjie Biotechnology Co., Ltd	202211202
TNF-&alfa; anticorpo	Shenyang Wanleibio Biotechnology Co., Ltd	WL01581
Solução TTC	Fuzhou Phygene Biotechnology Co., Ltd	20210620
Sistema de ultrassom de ultrassom de alta resolução para pequenos animais	VEVOcompany	Vevo 2100