Protocolo para Estudo da Regulação Honokiol da Sinalização Transformante do Fator de Crescimento Beta 1/SMAD em Modelos de Fotoenvelhecimento da Pele induzida pelo Ultravioleta A

Resumo

Este protocolo investiga se o honokiol melhora o fotoenvelhecimento induzido por UVA em fibroblastos dérmicos humanos e pele de camundongos ativando a via TGF-β1/Smad e reduzindo a expressão de MMP.

Resumo

Honokiol (HNK), um componente chave derivado da Magnolia officinalis, tem potencial para tratar doenças de pele. Atualmente, o impacto e o mecanismo de ação da HNK no fotodano induzido pelo ultravioleta A (UVA) na pele ainda não estão claros. Um modelo de dano foto-envelhecimento das células HDF e da pele de camundongos sem pelos foi construído por indução UVA. O impacto da HNK na viabilidade das células HDF normais e das células HDF induzidas por UVA foi examinado por meio do ensaio de viabilidade celular. Os níveis de SOD, GSH, CAT e MDA em células HDF foram medidos usando diferentes kits, e os níveis de ROS foram medidos usando DCFH-DA e Dihidroetídio. A coloração SA-β-galactosidase e TUNEL detectou senescência e apoptose em células HDF, e a citometria de fluxo avaliou a progressão do ciclo celular. O dano histopatológico à pele foi avaliado por meio de coloração patológica. Além disso, imunofluorescência e Western blot foram usados para avaliar os níveis de proteínas associadas à via de Ki67, colágeno, metaloproteinase da matriz (MMP) e TGF-β1/Smad na via de proteína. O tratamento com HNK (2,5-10 μM) não teve impacto adverso na viabilidade normal das células HDF, mas atenuou o dano celular HDF induzido pelos raios UVA, reduzindo o estresse oxidativo e a apoptose. O UVA induziu a senescência das células HDF, induziu parada na fase S, reduziu o Ki67, diminuiu o teor de colágeno e aumentou a expressão de MMP, enquanto o HNK atenuou efetivamente essas anormalidades induzidas pelo UVA. Além disso, a UVA causou rugas mais profundas, diminuiu o teor de água e colágeno, além de aumentar a espessura epitelial na pele de camundongos, enquanto a injeção subcutânea de HNK atenuou danos patológicos ao tecido cutâneo e aumentou o teor de água e colágeno. Além disso, o HNK ativou a via TGF-β1/Smad, e o inibidor TGF-β1 SB431542 prejudicou o efeito protetor do HNK contra danos foto-envelhecimento nas células HDF. Em conclusão, o HNK tem potencial para ser um medicamento para amenizar danos ao fotoenvelhecimento ao reduzir a expressão de MMP por meio da ativação da via TGF-β1/Smad, inibindo assim o fotoenvelhecimento induzido por UVA em células HDF e pele de camundongos.

Introdução

O processo de envelhecimento da pele é complexo e dividido em duas formas principais: envelhecimento natural e^{foto-envelhecimento 1}. Estudos indicam que até 80% a 90% do envelhecimento da pele é causado por fatores exógenos no ambiente (por exemplo, raios ultravioleta, poluição do ar), dos quais o fotoenvelhecimento induzido pela radiação ultravioleta a longo prazo tem os efeitos mais^{graves 2,3}. A radiação ultravioleta é dividida em UVC, UVB e UVA. Como o UVC não pode penetrar a camada de ozônio, pesquisas atuais sobre foto-envelhecimento focam em UVA (320-400 nm) e UVB (280-320 nm)^4,5,6. Comparado ao UVB, o UVA tem menor energia, mas é mais penetrante, passando pela epiderme e alcançando profundamente a derme, o que é uma causa importante do envelhecimento grave^{da pele.} Estudos anteriores mostraram que o dano causado pela irradiação UVB de 57 mJ^{/cm 2} e UVA de 20 M/cm² nas células HaCaT é^{comparável de 8}. O fotoenvelhecimento da pele causa mudanças na função e estrutura da pele, manifestadas especificamente como flacidez do tecido da superfície da pele, aprofundamento das rugas, perda de colágeno e aparição de uma cor cinza visível a olho nu; Em casos graves, uma variedade de lesões benignas e pré-cancerosas e tumores pode^{ocorrer 9,10}. Junto com o aumento das pesquisas sobre envelhecimento e anti-envelhecimento, os riscos à saúde do fotoenvelhecimento tornaram-se uma das maiores preocupações de saúde no mundo. Portanto, é fundamental investigar os processos fisiopatológicos subjacentes ao dano foto-envelhecimento induzido pelos UVA, com o objetivo de desenvolver novas opções terapêuticas para seu tratamento.

Extraído da Magnolia officinalis, uma erva medicinal tradicional chinesa, Honokiol (HNK) é um composto bioativo significativo com fórmula química C₁₈H₁₈O₂¹¹. O HNK apresenta várias atividades farmacológicas, e seu grupo hidroxila fenólico é altamente suscetível à oxidação e possui fortes efeitos antioxidantes e de captura de radicais^livres. Além disso, a HNK possui efeitos farmacológicos antibacterianos, anti-inflamatórios, antivirais, antitumorais, antidepressivos, neuroprotetores e anti-prematuros de insuficiência^ovariana 13,14,15,16. A HNK oral foi considerada essencialmente segura em estudos com animais e clínicos, e nenhum efeito adverso significativo foi^{identificado 17, 18, 19}. Estudos recentes descobriram que o HNK previne o câncer de pele induzido por^{UVB 20} e inibe a resposta inflamatória da pele induzida por UVB e a hipermetilação^{do DNA 21}, sugerindo seu uso potencial no tratamento de condições de pele. Comparado com agentes anti-fotoenvelhecimento amplamente utilizados, incluindo vitamina C e resveratrol, o HNK possui propriedades distintas e superiores: sua estrutura lipofílica confere melhor permeabilidade transdérmica do que a vitamina^{C hidrofila 22}; e apresenta maior fotosstabilidade e biodisponibilidade in vivo do que o resveratrol²³. Essas descobertas pré-clínicas apoiam a ideia de que a HNK tem potencial translacional promissor como candidata segura e eficaz para produtos de cuidados com a pele e intervenções clínicas contra danos foto-dano na pele induzidos pelo ultravioleta. No entanto, o impacto do tratamento com HNK nos danos do fotoenvelhecimento da pele causados pela UVA ainda não foi relatado.

O fator de crescimento transformante-β1 (TGF-β1) é uma citocina multifuncional crucial para o crescimento e desenvolvimento celular, reparo e regeneração de tecidos, e para o crescimento e desenvolvimento de células, tecidos e^{órgãos 24,25}. Foi demonstrado que o TGF-β1 transmite sinais para a célula principalmente por meio de membros da família de proteínas Smad, levando à regulação específica da transcrição de genes-alvo a jusante. Quando a sinalização TGF-β1 é ativada, resulta na fosforilação de Smad2 e Smad3^26,27. Estudos recentes mostraram uma forte conexão entre a via TGF-β1/Smad e fibrose cutânea e foto-envelhecimento ^28,29. Foi relatado que o alvo mamífero da rapamicina ativa a via TGF-β1/Smad nos tecidos da pele de ratos, o que por sua vez promove a síntese de ceramidas, importantes para reter a umidade da pele e manter a barreira^{cutânea 30}. Notavelmente, foi relatado que o HNK modulou a via TGF-β1/Smad em células estreladas hepáticas, o que, por sua vez, amenizou a fibrose^{hepática 31}. Portanto, modelos celulares e camundongos de lesão foto-envelhecimento induzida por UVA foram estabelecidos, com tratamento HNK de 2,5 a 10 μM em células HDF e intervenção de 5 mg/kg ou 10 mg/kg de HNK em camundongos sem pelos, para explorar os efeitos do HNK nos danos do fotoenvelhecimento e seu papel potencial na modulação da via TGF-β1/Smad. Esse estudo teve como objetivo desenvolver novas estratégias terapêuticas para o dano fotofísico causado pelos UVA.

Protocolo

Todos os experimentos de cultura celular foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança e conduzidos sob condições laboratoriais de Biossegurança Nível 2 (BSL-2). Experimentos com animais foram realizados após aprovação do Comitê de Ética Animal do 988º Hospital da Força Conjunta de Apoio Logístico do Exército Popular de Libertação da China (número de aprovação: 2023-089).

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos em estrita conformidade com as diretrizes institucionais e nacionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Ao final do experimento, camundongos foram eutanasiados por overdose de pentobarbital de sódio (100 mg/kg, injeção intraperitoneal). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento animal durante os procedimentos de alojamento, tratamento e amostragem. Os reagentes, produtos químicos, equipamentos e softwares usados no protocolo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura e processamento celular

1. Cultive fibroblastos dérmicos humanos (HDF) em meio de cultura de fibroblastos. Mantenha culturas a 37 °C em um ambiente de umidade saturada com 5% de_CO2.
2. Substitua o meio de cultura a cada 3 dias e passe o HDF na proporção de 1:3 quando confluente.
3. Irradie HDF com lâmpadas UVA (espectro de emissão: 320-400 nm) em uma dose de 5 J/^{cm 2}.
4. Reabasteça com substrato fresco imediatamente após 30 minutos de irradiação UVA. Repita a irradiação UVA uma vez ao dia por 8 dias^{consecutivos e 32}.
5. Trate o HDF com 2,5, 5, 10, 20 ou 40 μM HNK por 24 h ou 48 h nos experimentos de triagem^{dosificada 33}. Trate o HDF com 2,5, 5 ou 10 μM HNK por 24 horas, seguido por irradiação UVA (5 J/^{cm 2}) em experimentos subsequentes.
6. Expor HDF a 10 μM de HNK por 4 horas, depois incubar com o inibidor de TGF-β1 de 10 μM SB431542 por 24 horas e, finalmente, irradiar com UVA (5 J/cm²) no grupo HNK+SB431542.

2. Avaliação da viabilidade celular

1. Inocular o HDF em placas de cultura celular de 96 poços com uma densidade de 1×^{10 4} células/poço.
2. Após diferentes tratamentos, adicione 10 μL de reagente de sal tetrazólico 10% solúvel em água a cada poço até um volume final de 100 μL por poço, e incube as células a 37°C por 1,5 h no escuro.
3. Meça os valores OD450 das células usando um leitor de microplacas.

3. Determinação dos níveis de superóxido dismutase (SOD), malondialdeído (MDA), catalase (CAT) e glutationa (GSH)

1. Lave o HDF com 1 mL de PBS pré-resfriado (0,01 M, pH 7,4), adicione 200 μL de solução de preparação de amostra SOD (do Kit de Ensaio SOD) para lisar células sobre gelo por 15 minutos.
2. Centrifuge o lisado a 8000 × g por 5 minutos a 4 °C e colete o sobrenadante como amostra do ensaio.
3. Use um kit de ensaio proteico BCA (Ácido Bicincinínico) para determinar a concentração de proteína do sobrenadante e ajuste a amostra para 50 μg de proteína total em um volume de 50 μL.
4. Misture a amostra de proteína de 50 μg com o tampão de ensaio SOD até um volume final de reação de 200 μL, incube a mistura a 37 °C por 30 minutos no escuro, e então meça o valor OD450.
5. Pegue o mesmo sobrenadante de lisado celular usado para o ensaio SOD, meça os níveis de CAT, GSH e MDA usando os respectivos kits de ensaio.

4. Medição dos níveis celulares de ROS

1. Trate células HDF com diferentes condições, enxágue duas vezes com PBS de 500 μL e misture bem com 500 μL de sonda fluorescente de espécies reativas de oxigênio de 10 μM e incube a 37 °C por 20 minutos longe da luz.
2. Centrifuge a 1000 × g por 5 minutos em temperatura ambiente para coletar as células, e depois enxágue duas vezes com 500 μL PBS.
3. Resuspenda as células em meio de cultura celular de 500 μL e, em seguida, analise a coloração por citometria de fluxo.
4. Registre a intensidade de fluorescência usando software de análise de citometria de fluxo e então calcule os níveis de ROS com base na intensidade de fluorescência que um ROS maior corresponde a uma fluorescência verde mais forte.

5. Coloração β-galactosidase (SA-β-galactosidase) associada à senescência

1. Semear HDF em placas de cultura celular de 6 poços com densidade de 1×^{10 6} células/poço e cultivar até aderência. Após diferentes tratamentos, lave o HDF uma vez com 2 mL de PBS.
2. Adicione 1 mL de fixador de coloração de β-galactosidase em cada poço e incube as células em temperatura ambiente com fixador por 15 minutos.
3. Lave as células 3 vezes com 2 mL de PBS, adicione 1 mL de solução de trabalho de coloração em cada poço e então incube a 37°C durante a noite no escuro.
4. Observe e fotografe as células usando um microscópio óptico (as células senescentes aparecem azuis).

6. Ensaio do ciclo celular

1. Semear HDF em placas de 6 poços em 1×10⁶ células/pozo; após diferentes tratamentos, enxágue as células duas vezes com 2 mL de PBS.
2. Centrifuge a 1000 × g por 5 minutos em temperatura ambiente para coletar as células, adicione 1 mL de etanol a 70% (fixador de células) e misture suavemente pipetando. Coloque as células fixas em uma geladeira de 4°C por 12 horas.
3. Prepare 500 μL por amostra de solução de coloração celular misturando iodeto de propidio (PI, concentração final 50 μg/mL) e RNaseA (concentração final 200 μg/mL) em PBS. Expor as células a 500 μL de solução colorante, incubar no escuro a 37°C por 30 minutos.
4. Avalie a intensidade da fluorescência usando citometria de fluxo. Realize análise do ciclo celular usando um citômetro de fluxo.

7. Coloração TUNEL

1. Expõe células HDF de diferentes grupos de tratamento a 1 mL de paraformaldeído a 4% e incube em temperatura ambiente por 30 minutos.
2. Adicione 1 mL de PBS contendo 0,3% de Triton X-100 às células e incube em temperatura ambiente por 5 minutos.
3. Lave as células duas vezes com PBS, depois adicione uma solução de ensaio TUNEL de 500 μL em gotas para cobrir uniformemente as células. Incubar a 37°C no escuro por 1,5 hora.
4. Adicione 200 μL de solução de coloração DAPI para cobrir as células e incube longe da luz por 10 minutos a 25 °C.
5. Sele as células com um meio de montagem para preservação de sinal de fluorescência, depois observe-as e fotografe-as usando um microscópio de fluorescência (células TUNEL-positivas apresentam fluorescência verde).

8. Coloração por imunofluorescência

1. Semear células HDF de diferentes grupos de tratamento em placas de 12 poços. Quando a densidade celular atingir 50%-60%, exponha as células a 1 mL de paraformaldeído a 4% e incube em temperatura ambiente por 25 minutos.
2. Adicione 1 mL de albumina sérica bovina (BSA) a 5% em gota para bloquear a superfície celular e incube em temperatura ambiente por 30 minutos.
3. Adicione 500 μL de anticorpos primários Ki67 (1:300), colágeno I (1:100), metaloproteinase matricial (MMP)-1 (1:50) ou MMP-3 (1:100) gota a gota, e incube a 4°C durante a noite.
4. No dia seguinte, incube as células com 500 μL de anticorpo secundário marcado com fluoresceína isotiocianato (FITC) (1:100) a 37°C longe da luz por 1 hora.
5. Adicione 200 μL de solução de coloração DAPI para cobrir as células, incube longe da luz por 10 minutos, observe usando um microscópio de fluorescência e analise com software de análise de imagem (células positivas para colágeno I e MMP-1 apresentam fluorescência vermelha, células positivas para Ki67 e MMP-3 apresentam fluorescência verde).

9. ELISA

1. Adicione 100 μL de sobrenadante de cultura celular HDF a poços de placas de kit MMP-1 ou MMP-3 ELISA e incube a 37°C por 2 horas.
2. Lave os poços 3 vezes com 200 μL de PBS, depois adicione 100 μL do anticorpo correspondente a cada poço e incube a 37 °C no escuro por 1 hora.
3. Enxágue os poços 3 vezes com 200 μL de tampão de lavagem (fornecido no kit), sacuda o excesso de solução e incube as amostras com 100 μL de estreptavidina-HRP por 30 minutos a 37°C no escuro.
4. Após enxaguar com PBS, adicione 100 μL dos substratos A e B conforme as instruções do kit e incube a 37°C no escuro por 10 minutos.
5. Adicione 50 μL de solução de terminação, misture bem, avalie o valor OD₄₅₀ usando um leitor de microplacas e calcule a concentração.

10. Construção de modelos de camundongos por danos foto-envelhecidos

1. Fêmeas SKH1 de grau SPF doméstico (15-20 g, 4-5 semanas de idade) a 22 °C com umidade de 55%-60% e permitem acesso autônomo a alimentos e água. Desinfete instalações regularmente, incluindo recipientes de alimentos, garrafas de água e bicos de água.
2. Atribuir aleatoriamente os camundongos ao grupo controle (n=6) e ao grupo modelo (n=18). Grupos modelo irradiados com UVA a 0,35 J/^{cm 2} por 8 semanas³⁴; camundongos do grupo de controle da casa no mesmo ambiente sem irradiação UVA.
3. Divida igualmente os camundongos do grupo modelo em 3 subgrupos (n=6 cada).
4. Administrar injeções subcutâneas de HNK a 5 mg/kg ou 10 mg/kg em volume de 100 μL duas vezes por semana em dois subgrupos durante a irradiação UVA (registrado como grupo HNK de 5 mg/kg e grupo HNK de 10 mg/kg, respectivamente). Administrar injeções subcutâneas de 100 μL de soro fisiológico duas vezes por semana no terceiro subgrupo durante a irradiação UVA (registro como grupo UVA).
5. Avalie a formação de rugas na pele e o teor de água após modelagem^{bem-sucedida 35}.
6. Eutanasiar camundongos com pentobarbital de sódio (100 mg/kg) intraperitonealmente e então coletar tecidos dorsais da pele para experimentos adicionais.

11. Medição do conteúdo de colágeno I da pele

1. Colete 50 mg de tecidos dorsais da pele do camundongo, moa-os cuidadosamente em nitrogênio líquido e lise-os usando 500 μL de tampão de lise RIPA pré-resfriado por 30 minutos em gelo.
2. Centrifuge o lisado a 8000 × g por 5 minutos a 4 °C, colete o sobrenadante e meça o conteúdo de colágeno usando um kit de ensaio peptídico pro-colágeno I C conforme as instruções do fabricante.

12. Coloração por hematoxilina e eosina (HE)

1. Fixe os tecidos da pele do camundongo em 10 mL de paraformaldeído a 4% em temperatura ambiente por 24 horas, desidrate em etanol gradiente (50%, 75%, 95%, 100%, cada por 5 minutos), infiltre na parafina e corte em fatias de 4 μm.
2. Asse as fatias a 65°C por 8 horas, desparafine no xileno duas vezes por 10 minutos cada e reidrate em etanol gradiente em temperatura ambiente.
3. Tinga as fatias com solução de hematoxilina por 8 minutos, enxágue com água da torneira corrente por 1 minuto, diferencie com solução diferenciadora por 30 segundos e tinga com eosina por 1 minuto em temperatura ambiente.
4. Desidrate as fatias coradas em etanol gradiente, transparente em xileno, sele com meio de montagem e observe ao microscópio (o núcleo celular aparece azul-púrpura, enquanto o citoplasma, fibras de colágeno e eritrócitos aparecem rosados em graus variados).

13. Coloração de masson

1. Tinga seções de parafina dos tecidos da pele de camundongos usando o kit de coloração Masson^{trichrome 36}. Desparafinize as seções de parafina em xileno duas vezes por 10 minutos cada, adicione a solução de coloração de ferro Weigert para hematxilina e colore por 10 minutos.
2. Diferencie com solução de diferenciação de etanol ácido por 30 segundos, enxágue com água da torneira corrente por 5 minutos e depois tinga com solução de coloração Ponceau-fuchsina gota a gota por 10 minutos em temperatura ambiente. Faça azulamento reverso com a solução azul de Masson e depois enxágue com água destilada por 1 minuto.
3. Prepare uma solução de trabalho ácida fraca na proporção de água destilada: solução ácida fraca (fornecida no kit) = 2:1; Adicione 1 mL de solução ácida fraca de trabalho em gota e lave por 30 s em temperatura ambiente.
4. Despeje o excesso de líquido, adicione 1 mL de solução de ácido fosfomolíbdico em gota e trate por 2 minutos em temperatura ambiente. Adicione 1 mL da solução ácida fraca de trabalho em direção ao extremo, depois lave por 30 segundos.
5. Despeje o excesso de líquido, adicione 1 mL de solução de mancha azul anilina no vácuo e tinga por 1 minuto. Adicione 1 mL de solução ácida fraca de trabalho em gota e lave por 30 segundos.
6. Desidrate rapidamente em etanol 95% por 2 segundos. Desidrate em etanol absoluto duas vezes, 10 segundos cada vez.
7. Após a secagem, limpe as seções em xileno e monte com goma neutra. Observe a distribuição das fibras de colágeno em cada grupo sob um microscópio (as fibras de colágeno aparecem azuis, enquanto fibras musculares, citoplasma e eritrócitos são vermelho vivo, e os núcleos celulares aparecem nitidamente azul-escuros).

14. Medição dos níveis de ROS do tecido cutâneo

1. Pegue seções congeladas de tecido de pele de camundongo (preparadas dentro de 1 hora após a excisão), espalhe 1 mL de solução de limpeza em gota por toda a superfície da seção e deixe em temperatura ambiente por 10 minutos.
2. Sacuda a solução de lavagem e depois adicione 1 mL de sonda de espécie reativa de oxigênio de 10 μM para cobrir uniformemente as seções; incube a 37 °C longe da luz por 30 minutos.
3. Enxágue as seções duas vezes com PBS, adicione as lâminas de cobertura e observe usando um microscópio de fluorescência (áreas ROS-positivas apresentam fluorescência vermelha; quanto menor o nível de ROS, mais fraco o sinal de fluorescência vermelha).

15. Testes de indicadores bioquímicos

1. Colete soro de camundongos e prepare os reagentes de detecção de acordo com as instruções dos kits de ensaio correspondentes.
2. Meça as atividades da aspartato transaminase (AST) e da alanina transaminase (ALT) no soro de camundongos usando os respectivos kits.
3. Determine os níveis de nitrogênio ureico no sangue (BUN) e creatinina (CRE) no soro de camundongos usando os respectivos kits.

16. Western blot

1. Colete 50 mg de tecido ou 1×10⁶ células, lise as amostras no gelo por 30 minutos usando um tampão de lisão RIPA de 200 μL para obter proteínas.
2. Centrifuge a 8000 × g por 5 minutos a 4 °C e colete o sobrenadante. Avalie o teor de proteína nas células e tecidos usando o kit de ensaio de concentração de proteínas de BCA.
3. Realize eletroforese das proteínas amostrais em um gel SDS-PAGE a 12% e transfira proteínas separadas para membranas PVDF a 4 °C.
4. Bloqueie as membranas PVDF com 5% de BSA por 3 horas em temperatura ambiente. Enxágue as membranas com TBST (contém 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl e 0,1% Tween-20) 3 vezes, depois incube durante a noite a 4°C com anticorpos primários: P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:100), colágeno I (1:1000), Ciclina A2 (1:500), Cinase dependente de ciclina 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:1000), P-Smad2 (1:1000) ou p-Smad3 (1:1000).
5. No segundo dia, lave as membranas com TBST 3 vezes e depois incube com 1 mL de IgG anti-coelho de cabra (1:10000) em temperatura ambiente por 2 horas. Aplique 500 μL do reagente de quimioluminescência aprimorada (ECL) de forma uniforme às membranas, depois escaneie-as usando um sistema de imagem em gel.
6. Realize análise de valor cinza usando software de análise de imagens. Expresse o nível relativo de expressão como a razão entre seu valor cinza e o do GAPDH.

17. Análise estatística

1. Para ensaios celulares in vitro , todos os experimentos são repetidos independentemente três vezes (n=3, réplicas biológicas).
2. Para experimentos in vivo com animais, 6 camundongos são incluídos por grupo (n=6), o que está em conformidade com os princípios 3R para bem-estar e ética de animais de laboratório.
3. Todos os resultados são expressos como média ± desvio padrão. Realizar análise estatística usando softwares de análise estatística. A normalidade dos dados foi testada usando o teste de Shapiro-Wilk.
4. Para dados normalmente distribuídos, use ANOVA unidirecional para comparação multigrupo, seguido pelo teste pós-hoc de Tukey para comparações par a par entre grupos. Para dados não distribuídos normalmente, aplique o teste de Kruskal-Wallis não paramétrico. P< 0,05 indica uma diferença significativa.
5. Gerar gráficos usando software de gráficos.

Resultados

HNK alivia danos por estresse oxidativo nas células HDF causados pela UVA
Os impactos de várias concentrações de tratamento com HNK por 24 horas ou 48 horas sobre a viabilidade das células HDF foram examinados por ensaio de viabilidade celular para rastrear a concentração e duração adequadas do tratamento. Os resultados mostraram que 2,5, 5 e 10 μM de HNK não afetaram significativamente a viabilidade das células HDF normais após 24 horas ou 48 horas de tratamento, dem...

Discussão

A luz ultravioleta é um dos fatores ambientais que prejudica células e organismos. Estudos anteriores relataram que a UVA, com seu alto poder de penetração, é o principal tipo de luz ultravioleta que alcança a superfície da^Terra. Fibroblastos são células funcionais importantes na derme, e seu envelhecimento pode causar direta ou indiretamente o envelhecimento da pele^. Danos ao fotoenvelhecimento induzidos por UVA no modelo de células HDF e ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de ensaio de atividade ALT	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	P2711M	Kit de detecção de atividade da transaminase alanina
Kit de ensaio Amplex Red CRE	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	S0291S	Kit de detecção de creatinina
Meio de montagem AntiFade	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	P0126	Meio de montagem para preservação do sinal de fluorescência
Kit de ensaio de atividade AST	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	P2715S	Kit de detecção de atividade de Aspartate Transaminase
Kit de ensaio proteico BCA	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	P0012	Kit de determinação de concentração de proteínas
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	V900933	reagente bloqueante para ligação não específica
Kit de ensaio BUN	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	S0574S	Kit de detecção de nitrogênio com ureia sanguínea
Kit de ensaio CAT	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	S0051	Kit de detecção de atividade de catalase
Reagente CCK-8	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	96992	Solução de ensaio de viabilidade celular, que é um sal de tetrazólio solúvel em água
Anticorpo CDK2	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	PA5-79024	anticorpo primário para a detecção de CDK2
Agente quimioluminescente ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUA	HY-K1005	Reagente de detecção de quimioluminescência aprimorada
Anticorpo de colágeno I	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	PA1-26204	anticorpo primário para a detecção de colágeno I
Anticorpo Ciclina A2	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	PA5-34682	anticorpo primário para a detecção de ciclina A2
Solução de coloração DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	D9542	Corante de coloração nuclear
Sonda fluorescente DCFH-DA	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUA	HY-D0940	Sonda fluorescente de espécies reativas de oxigênio
Solução de diferenciação	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	C0161s	reagente para a etapa de diferenciação da hematoxilina
Sonda de dihidroétidio	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	S0063	Sonda de espécies reativas de oxigênio
Meio de cultura de fibroblastos	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNPM-H342	meio de cultura completo para crescimento de fibroblastos
IgG anti-coelho de cabra rotulado com FITC	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	F-2765	Anticorpo secundário marcado com isotiocianato de fluoresceína (FITC)
Citometria de fluxo	BD em biociências, San Jose, CA, EUA	BD FACSCaliburTM	Citômetro de fluxo
Software FlowJo	BD em biociências, San Jose, CA, EUA	v10.8	Software de análise de citometria de fluxo
Microscópio de fluorescência	Leica, Heidelberg, Alemanha	DM IL LIDEROU	Microscópio para imagem por fluorescência
Anticorpo GAPDH	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	PA1-987	Anticorpo de controle interno para normalização de proteínas
Sistema de Imagem em Gel	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	iBright CL1500	Sistema de imagem para detecção de proteínas
cabra anti-coelho IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	31460	Anticorpo secundário para imunodetecção
Software Graphpad Prism 9.0	GraphPad Software, San Diego, CA, EUA	Prism 9.0	Software de gráficos
Kit de ensaio GSH	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	S0053	Kit de detecção de conteúdo de glutationa
Kit de tingimento HE	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	C0105S	Kit de coloração histológica para análise de morfologia tecidual
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUA	HY-N0003	Honokiol, composto bioativo
Fibroblastos dérmicos humanos	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, China	SNP-H342	Células primárias de fibroblastos da pele humana
Software IBM SPSS Statistics 26.0	IBM Corporation, Armonk, NY, EUA	IBM SPSS Estatísticas 26.0	Software de análise estatística
Software ImageJ	Wayne Rasband, Instituto Nacional de Saúde Mental, EUA	Versão 1.54H	Software de análise de imagens
Anticorpo Ki67	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	MA5-14520	Anticorpo primário para a detecção de marcadores de proliferação celular
Microscópio óptico	Leica, Heidelberg, Alemanha	DM3000	Microscópio óptico para imagem em campo claro
Kit de coloração tricromática Masson	Solarbio, Pequim, China	G1340	Kit de coloração de colágeno e tecido conjuntivo
Kit de ensaio MDA	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	S0131S	Kit de detecção de nível de malondialdeído (marcador de peroxidação lipídica)
Leitor de Microplacas	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA	1410101	Instrumento de medição de absorção para ensaios baseados em células
Anticorpo MMP-1	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	PA5-27210	anticorpo primário para a detecção de metaloproteinase-1 da matriz-mestrial
Kit MMP-1 ELISA	Biotecnologia ligada a enzimas, Xangai, China	ml038199	detecção quantitativa de MMP-1 em amostras biológicas
Anticorpo MMP-3	Abcam, Cambridge, MA, EUA	AB52915	anticorpo primário para a detecção de metaloproteinase matricial-3
Kit MMP-3 ELISA	Biotecnologia ligada a enzimas, Xangai, China	ml105322	detecção quantitativa de MMP-3 em amostras biológicas
Goma neutra	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	C0173	Meio de montagem
Anticorpo P16	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	PA5-20379	Anticorpo primário para a detecção da proteína P16
Anticorpo P21	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	MA5-14949	Anticorpo primário para a detecção da proteína P21
Anticorpo P53	Abcam, Cambridge, MA, EUA	ab131442	Anticorpo primário para detecção de proteína P53
paraformaldeído	Solarbio, Pequim, China	P1110	Reagente de fixação celular e tecidular
PI	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	ST512	Iodeto de propidio para coloração de DNA na análise do ciclo celular
Kit de ensaio peptídico pro-colágeno I C	TAKARA, Tóquio, Japão	MK101	Kit de detecção de síntese de colágeno
Anticorpo p-Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	44-244G	anticorpo primário para a detecção de Smad2 fosforilada
Anticorpo p-Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	44-246G	anticorpo primário para a detecção de Smad3 fosforilado
Membranas PVDF	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	88520	Membrana de transferência de proteína para Western Blot
Buffer de lise RIPA	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	P0013B	Tampão de extração proteica para lisados celulares e teciduais
RNaseA	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	ST579	ribonuclease para remoção de RNA durante coloração de DNA
Kit de coloração SA-β-galactosidase	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	C0602	Kit de detecção de senescência celular
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, EUA	HY-10431	TGF-β 1 inibidor da via de sinalização
Géis SDS-PAGE	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	WG1403BX10	Géis de poliacrilamida para eletroforese proteica
Ramundongos sem pelos SKH1	Vitalriver, Pequim, China		Modelo animal para estudos de foto-envelhecimento da pele
Anticorpo Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	51-1300	anticorpo primário para a detecção de Smad2
Anticorpo Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA	51-1500	anticorpo primário para a detecção de Smad3
Kit de ensaio SOD	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	S0101S	Kit de detecção de atividade de superóxido dismutase
TGF-β 1 Anticorpo	Abcam, Cambridge, MA, EUA	ab215715	anticorpo primário para TGF-β 1 Detecção
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	X-100	Detergente não iônico para permeabilização de membranas celulares
Solução de ensaio TUNEL	Beyotime Biotechnology, Xangai, China	C1086	reagente de detecção de apoptose para fragmentação do DNA
Xylene	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	247642	Solvente orgânico para desparafinização de tecidos