Artigo de método

Isolamento e Cultura de Preadipócitos Brancos e Marrons de Embriões de Camundongos

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DOI:

10.3791/70101

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17 de abril de 2026

 ,  ,  , 
1Laboratory Lille Neuroendocrinology, Lille Neuroscience & Cognition, University of Lille, Inserm, CHU Lille

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos uma abordagem nova, robusta e reprodutível para isolar e cultivar preadipócitos brancos e marrons de embriões de camundongos, estabelecendo uma estratégia in vitro poderosa para dissecar os mecanismos celulares e moleculares que regem o compromisso e diferenciação da linhagem dos adipócitos, além de fornecer uma estrutura para investigar o impacto do desenvolvimento do tecido adiposo.

Resumo

O tecido adiposo desempenha um papel central na homeostase metabólica, e suas propriedades são moldadas durante o desenvolvimento embrionário por meio da diferenciação de adipócitos. Portanto, os preadipócitos embrionários representam um modelo relevante para estudar eventos precoces na formação e especificação de linhagem do tecido adiposo. Este artigo descreve um protocolo reprodutível para o isolamento e diferenciação in vitro de preadipócitos brancos e marrons isolados de embriões de camundongos no dia embrionário 15.5 (E15.5), estágio de desenvolvimento no qual os depósitos adiposos começam a se formar. O método fornece orientações detalhadas para microdissecção tecidual, digestão enzimática, cultura primária e condições de diferenciação específicas de linhagem que apoiam a viabilidade celular e a maturação adipogênica. Os resultados representativos incluem acúmulo de gotículas lipídicas e expressão de marcadores associados à linhagem, confirmando diferenciação bem-sucedida sob condições definidas de cultura. Usando essa abordagem, os preadipócitos embrionários podem ser direcionados para destinos de adipócitos brancos ou marrons, permitindo análises comparativas do momento do desenvolvimento, características de linhagem e perfis de expressão gênica. Esse protocolo oferece uma ferramenta prática e relevante para o desenvolvimento para investigar a formação do tecido adiposo e os mecanismos de programação perinatal em um ambiente experimental controlado.

Introdução

O tecido adiposo desempenha um papel central na manutenção da homeostase do corpo inteiro ao regular o armazenamento de energia, a sinalização endócrina e a termogênese adaptativa, interagindo extensivamente com órgãos locais edistantes 1,2,3. Dois principais tipos de tecido adiposo podem ser distinguidos: o tecido adiposo branco (WAT) e o tecido adiposo marrom (BAT), que diferem marcadamente em linhagem celular, função fisiológica, distribuição anatômica e atividademetabólica 4.

A WAT constitui o reservatório primário de energia do organismo. Os adipócitos brancos são altamente especializados para armazenamento de lipídios e são caracterizados pela presença de uma única grande gota lipídica (LD) que ocupa a maior parte do espaçocitoplasmático 5. Em contraste, o BAT é especializado em termogênese sem tremores. Adipócitos marrons contêm múltiplos pequenos LDs e apresentam alta densidade mitocondrial 3,6. A capacidade termogênica do BAT depende da Proteína de Desacoplamento 1 (UCP1), uma proteína da membrana mitocondrial interna que facilita o vazamento de prótons através damembrana 7. Ao desacoplar a fosforilação oxidativa da síntese de ATP, UCP1 dissipa o gradiente de prótons como calor, contribuindo assim para a manutenção da temperatura corporal8. Dadas suas diversas funções, WAT e BAT têm despertado considerável interesse não apenas como reguladores-chave e potenciais alvos terapêuticos em doenças metabólicas, mas também na biologia do desenvolvimento e evolutiva, imunologia e envelhecimento, devido às suas interações sistêmicas complexas e de longoalcance 9,10. Evidências acumuladas também indicam que a programação metabólica fetal está intimamente associada ao desenvolvimento do tecido adiposo, já que perturbações no ambiente intrauterino podem influenciar o número, a distribuição e a função dos adipócitos, predispundo assim os indivíduos à obesidade e a doenças metabólicas mais tarde navida 11.

Para investigar a biologia do tecido adiposo, a disponibilidade de adipócitos maduros é essencial. Sistemas de cultivo in vitro fornecem um ambiente controlado que permite a avaliação de fatores específicos que influenciam a adipogênese e a função dos adipócitos. Diversos protocolos foram estabelecidos para o isolamento e diferenciação de adipócitos de camundongos adultos ou filhotesneonatais 12,13,14,15. No entanto, esses progenitores dos adipócitos podem diferir das populações celulares originais que dão origem a tecidos adiposos durante o desenvolvimento. Em camundongos, os depósitos de BAT são os primeiros a se desenvolver durante a embriogênese, proporcionando aos recém-nascidos uma capacidade termogênica não tremedora, fundamental para a adaptação ao frio pós-natal. Depósitos de adipócitos marrons podem ser detectados na região interescapular já no dia embrionário 14,5 (E14,5)16. Os SLs começam a se formar em E15.5, e a expressão de UCP1 é iniciada por volta de E16.5. No embrião de camundongo, os preadipócitos do WAT inguinal (iWAT) também já estão presentes neste estágio16.

O protocolo descrito aqui foca em pré-adipócitos isolados em E15.5. Esse estágio corresponde ao período embrionário durante o qual as células progenitoras iniciam a diferenciação in vivo 16, representando assim os progenitores primários que dão origem à WAT e à BAT. Em contraste, progenitores adipogênicos isolados em estágios adultos ou neonatais podem já ter sido influenciados por fatores ambientais e provavelmente exibirão plasticidade mais restrita. Portanto, o uso de progenitores embrionários em E15.5 aumenta a capacidade de recapitular fielmente o programa adipogênico in vivo, pois essas células mantêm um alto grau de plasticidade do desenvolvimento e são mais propensas a seguir trajetórias de diferenciação fisiológica. Essa abordagem é de particular interesse para questões de biologia do desenvolvimento, especialmente para investigar os efeitos de fatores ambientais na diferenciação de pré-adipócitos durante o período perinatal, fornecendo um modelo valioso para estudar como exposições na vida precoce podem moldar o desenvolvimento do tecido adiposo e os resultados metabólicos a longo prazo. No entanto, os usuários devem ter cautela quanto a essa especificidade de estádio: o método é otimizado para embriões E15.5, e desvios na idade embrionária ou na precisão da dissecação podem impactar o rendimento ou a viabilidade celular. Além disso, a técnica de microdissecação exige prática para evitar contaminação com tecidos não adiposos, especialmente dado o pequeno tamanho dos depósitos embrionários. Este protocolo resume todas as etapas e procedimentos para isolar, cultivar, amplificar e diferenciar preadipócitos embrionários em adipócitos maduros marrons e brancos.

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Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com regulamentos locais e sob as diretrizes definidas pela Diretiva do Conselho Europeu de 22 de setembro de 2010 (2010/63/UE) (APAFIS#2617-2015110517317420).

Todos os resíduos biológicos e soluções enzimáticas devem ser manuseados e descartados de acordo com as diretrizes e regulamentos institucionais de biossegurança para materiais bio-perigosos. Especificamente:
- Resíduos biológicos: coletam em recipientes aprovados para riscos biológicos e descartam por autoclavagem ou conforme orientado pelo escritório de biossegurança da instituição.
- Soluções enzimáticas: inativam a atividade enzimática residual adicionando 10% de água sanitária por 30 minutos e descartam como resíduos químicos conforme as regulamentações locais.
- Consumíveis contaminados (pontas de pipeta, tubos, etc): colocar em sacos de biohazard e autoclave antes do descarte.
- Reagentes de fixação: descartar como resíduos químicos perigosos em recipientes designados.

Sempre use EPI adequado ao manusear resíduos.

1. Colheita de embriões de camundongos

  1. Eutanasie os camundongos grávidos (C57Bl/6J) de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais.
  2. Desinfete a área abdominal dos camundongos grávidos com etanol a 70% e faça uma incisão na linha média para expor o útero.
  3. Incenda a cavidade abdominal para remover os sacos vitelinos que contêm os embriões em E15.5 e coloque-os em uma caixa de agarose contendo 1x PBS frio (4 °C).
  4. Remova a membrana externa de cada saco vitelino e da placenta, e corte o cordão umbilical dos embriões.
  5. Coloque os embriões em uma nova caixa de agarose contendo PBS frio 1x.
    NOTA: Embora as estruturas do sistema nervoso central subjacentes à percepção consciente da dor não estejam totalmente desenvolvidas nessa fase gestacional, nociceptores periféricos começam a se formar entre E13 e E15. De acordo com as diretrizes institucionais de cuidado animal, para minimizar possíveis respostas nociceptivas, recomendamos que os embriões sejam eutanasiados por decapitação antes de qualquer manipulação experimental.

2. Dissecação de tecidos adiposos embrionários (Figura 1)

  1. Dissecação do BAT interescapular (Figura 1A)
    1. Corte um retângulo de uma placa de agarose a 5% e coloque o embrião dentro dela para imobilizá-lo. Encha o prato com PBS frio 1x. Coloque a caixa de agarose com o embrião sob um microscópio binocular.
    2. Remova a pele da parte de trás do embrião.
    3. Dissecar o morcego interescapular usando pinças finas e microtesouras.
    4. Separe cuidadosamente o BAT do tecido ao redor (tecido conjuntivo e músculo) usando microtesouras para obter uma amostra de BAT medindo aproximadamente 4–6 mm x 2–3 mm.
    5. Coloque o BAT em um tubo de 2 mL contendo 1 mL de glutamina Fria (4 °C) da Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) com 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (P/S).
  2. Dissecação do iWAT (Figura 1B)
    1. Coloque o embrião de lado (de um lado e depois do outro) sobre a placa de agarose.
    2. Dissece o iWAT usando pinças finas e microtesouras.
    3. Separe cuidadosamente o iWAT dos tecidos ao redor (tecido conjuntivo e pele) até ter dois depósitos medindo aproximadamente 2–4 mm x 0,5–0,8 mm.
    4. Coloque as duas amostras de WAT em um tubo de 2 mL contendo 1 mL de glutamina fria DMEM/F-12 com 100 U/mL de penicilina/estreptomicina (P/S).
      NOTA: Todas as dissecações devem ser realizadas sob um microscópio binocular no ambiente mais estéril possível, utilizando ferramentas previamente desinfetadas.

3. Digestão dos tecidos adiposos

  1. Remova o DMEM/F12 com uma pipeta e adicione nos tubos 200 μL de glutamina DMEM/F12 com 100 U/mL p/s, 0,2% de albumina sérica bovina (BSA), 0,5 U de colagênase D e 0,5 U Dispase II.
  2. Corte os tecidos com microtesoura nos tubos para reduzir ao máximo os pedaços de tecido e ajudar no processo digestivo pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
    NOTA: Amostras totalmente digeridas devem aparecer como uma suspensão turva, sem aglomerados visíveis de tecido.
  3. Incube a 37 °C (em banho-maria) por 15 minutos.
  4. Interrompa a reação adicionando 600 μL de glutamina fria DMEM/F-12 com 100 U/mL de p/s, 20% de soro fetal bovino (FBS). Resuspenda uniformemente pipetando para cima e para baixo 10 vezes.

4. Cultura celular primária

NOTA: A partir deste passo, todos os procedimentos devem ser realizados sob condições estritamente estéreis em um Armário de Segurança Biológica (BSC) para evitar contaminação. Use luvas estéreis, jaleco e óculos de proteção para manter a esterilidade e proteger contra riscos potenciais. Use plásticos descartáveis e estériles, técnica asséptica e certifique-se de que todos os reagentes e meios estejam estéreis. Evite contato com superfícies não estéreis para evitar contaminação.

  1. Placar as células em lâminas de poço e incubá-las em condições padrão (37 °C, 5% CO2) por 1 hora; para placas de 8 poços, coloque 200 μL/poço. Após a incubação, confirme que as células aderiram movendo suavemente a placa enquanto observa ao microscópio.
    NOTA: Neste estágio, diferentes amostras de BAT ou WAT podem ser agrupadas em um único tubo para obter culturas homogeneizadas nos diferentes poços (por exemplo, para testar o efeito de um tratamento em culturas semelhantes).
  2. Substitua o meio por glutamina pré-aquecida (37 °C) DMEM/F-12 com 100 U/mL de p/s, 10% de FBS e incube as células durante a noite a 37 °C, 5% de CO2.
    NOTA: Ao mudar o meio, células mortas/não ligadas e fragmentos de tecido que não podiam ser decompostos são removidos, restando apenas as células anexadas.
  3. Tratamento de diferenciação (72 h)
    1. Para diferenciação de adipócitos marrons, troque o meio usando glutamina pré-aquecida (37 °C) DMEM/F-12 por 100 U/mL p/s, 10 % FBS, 125 nM de indometacina, 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 nM triiodotironina (T3), 1 μM de rosiglitazona, 1 μM de dexametasona, e 850 nM de insulina, e incube a 37 °C, 5% deCO2 por 72 horas.
    2. Para diferenciação de adipócitos brancos, troque o meio usando DMEM/F-12 glutamina pré-aquecida com 100 U/mL p/s, 10% FBS, 0,5 mM de IBMX, 1 μM de dexametasona e 850 nM de insulina e incube a 37 °C, 5% de CO2 por 72 horas.
  4. Tratamento de manutenção (a cada 48 horas)
    1. Troque o meio usando dmem/f-12 glutamina pré-aquecida (37 °C) COM 100 U/mL p/s, 10% FBS, 1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone e 850 nM de insulina. Renove o médio a cada 48 horas.
      NOTA: Todas as concentrações listadas referem-se às concentrações finais de trabalho dos reagentes. Ajuste os volumes finais de meios de diferenciação e manutenção com base no número de poços a serem tratados, usando 200 μL por poço como volume padrão para placas de 8 poços.

5. Fixação e imunocoloração (Figura 2A)

  1. Aspire o substrato e lave as células com PBS frio 1x.
  2. Fixe as células por 10 minutos com formaldeído frio a 4% em 1x PBS.
  3. Lave as células com 1x PBS por 3 x 5 minutos.
  4. Permeabilize as células com 0,1% de Triton em 1x PBS por 10 minutos.
  5. Lave as células com 1x PBS por 3 x 5 minutos.
  6. Bloqueie os locais inespecíficos com 5% de soro de burro normal (NDS) em 1x PBS por 1 hora em temperatura ambiente (RT).
    NOTA: A escolha das espécies para o soro bloqueante depende da espécie na qual os anticorpos secundários são produzidos.
  7. Incubar anticorpos primários diluídos em 5% de NDS em 1x PBS durante a noite a 4 °C.
    NOTA: Não adicione anticorpos primários a um dos poços — isso servirá como controle negativo.
  8. Lave as células com 1x PBS por 2 x 5 minutos.
  9. Lave as células com 5% de NDS em 1x PBS por 5 minutos.
  10. Incube com os anticorpos secundários, DAPI e Bodipy por 1 hora na RT, coberto para proteger da luz.
  11. Lave os poços com 1x PBS por 3 x 5 minutos.
  12. Mantenha as células a 4 °C no escuro até a aquisição das imagens.

6. Crioconservação de preadipócitos

NOTA: É possível interromper a cultura e congelar as células antes ou depois do processo de diferenciação para armazená-las e reutilizá-las em culturas celulares subsequentes.

  1. Prepare meio congelante: 50% FBS, 40% DMEM/F-12 glutamina com 100 U/mL P/S, 10% Dimetil Sulfóxido (DMSO).
    ATENÇÃO: DMSO é um produto químico perigoso. É um irritante para a pele e os olhos, pode facilitar a absorção de outras substâncias tóxicas pela pele e pode causar danos se inalado ou ingerido. Sempre manuseie DMSO dentro do BSC para minimizar exposição e contaminação. Use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados (luvas estéreis, jaleco e óculos de proteção para evitar contato). Evite contato com a pele. Em caso de contato, lave imediatamente com bastante água. Armazene o DMSO em um recipiente bem fechado dentro do BSC quando não estiver em uso e garanta o descarte adequado conforme os protocolos de segurança laboratoriais.
  2. Lave as células com PBS pré-aquecido (37 °C).
  3. Adicione tripsina pré-aquecida (37 °C) a 0,05% para desprender quimicamente as células e incubar por 5 minutos a 37 °C, 5% de CO2. Verifique visualmente se há descolamento celular sob o microscópio.
  4. Pare a reação adicionando 3 vezes o volume de glutamina pré-aquecida (37 °C) DE DMEM/F-12 com 100 U/mL p/s, 10% FBS. Resuspenda de forma uniforme.
  5. Centrifuge 7 min em RT, 300 × g e descarte o sobrenadante.
  6. Resuspenda as células em 10 mL de meio congelante. Centrifuge 7 min em RT, 300 × g e descarte o sobrenadante, restando aproximadamente 3 mL.
    NOTA: Meça o volume exato para calcular o número total de células após a contagem.
  7. Dilua um pequeno volume 1:2 com Trippan Blue e conte as células vivas usando uma câmara Neubauer.
  8. Ajuste o volume com meio congelante para obter 5 × 104 – 1 × 105 células/frasco (volume final: 1 mL/frasco).
  9. Transfira frascos para um recipiente congelante (taxa de resfriamento: -1 °C/min) e armazene a -80 °C durante a noite.
  10. Transfira para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
    NOTA: Este protocolo permite viabilidade superior a 90% após o descongelamento.
  11. Descongele as células quando necessário, descongelando rapidamente o frasco em um banho-maria a 37 °C.
  12. Transfira o conteúdo do frasco para 4 mL de glutamina pré-aquecida (37 °C) DMEM/F-12 com 100 U/mL p/s, 10% FBS. Resuspenda uniformemente pipetando suavemente para cima e para baixo 10 vezes. Incube durante a noite a 37 °C, 5% de CO2.
  13. Substitua o médio por DMEM/F-12 glutamina fresca por 100 U/mL p/s, 10% FBS e renove a cada 48 horas.
    NOTA: É fundamental fazer essa mudança de meio para remover remanescentes de DMSO, pois a exposição prolongada pode comprometer a viabilidade, diferenciação e função celular. Garanta a substituição completa do meio para evitar efeitos citotóxicos.
  14. Prossiga com experimentos ou células de passagem quando atingirem 80% de confluência.

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Resultados

Como ilustrado na Figura 1, depósitos intactos de BAT e iWAT podem ser isolados eficientemente de embriões em E15.5. Embora o BAT seja facilmente detectável em embriões E15.5, detectar iWAT pode exigir treinamento. Em ambos os casos, é essencial microdissecar todo o tecido ao redor após a dissecação grosseira para evitar o cultivo de outros tipos celulares.

Os estágios iniciais de digestão e cultivo de preadipócitos brancos e pard...

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Discussão

A cultura de preadipócitos foi amplamente descrita em diversos contextos experimentais. No entanto, os protocolos existentes dependem predominantemente de tecidos adultos ou fibroblastos embrionários, e atualmente não existem métodos padronizados disponíveis para isolar e cultivar preadipócitos embrionários diretamente a partir de tecidos adiposos em desenvolvimento. Estudar essas células é particularmente importante, pois representam as populações autênticas de preadipócitos que residem...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Agradecemos a Christian Duhem pelo conselho. Reconhecemos o apoio do Instituto Nacional Francês de Saúde e Pesquisa Médica (INSERM). O M.C-M foi apoiado pelo ANR-23-CE13-0044. O M.A foi apoiado pelo Instituto Europeu de Genômica para Diabetes (EGID, ANR-10-LABX-0046), pelo Centro Nacional de Medicina de Precisão em Diabetes (PreciDIAB, ANR-18-IBHU-0001) e pelo Conselho Regional de Hauts-de-France (22005973). A Figura 2 foi criada no BioRender. Mayeuf-Louchart, A. (2026) https://BioRender.com/3pbzif1. O SB foi apoiado pela subvenção ANR-24-CHBS-0002.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3,5,3'-triiodotironinaSigma709719T3
3-isobutil-1-metilxantina  SigmaI7018IBMX
AgaroseSigmaA0169
ÁlcoolVWR1.59010.0500
Anticorpo anti-UCP1AbcamAB10983
Microscópio binocularLeica  MZ9.5
Gabinete de segurança biológicaTermo Científica51022482BSC, HeraSafe KS Classe II Gabinete de Segurança
BodipyInvitrogenD3922Excitação/Emissão 493/504 nm
Albumina sérica bovinaEuromedex04-100-812-CBSA
CentrífugaEppendorf5430 R
GramposFST (Alemanha Inoxidável)
Colanase DSigma11088882001
CriotubosSarstedt72.379
Placas de cultura (8 poços)Ibidi 80826
Placas de cultura (12 poços)Colega de CorningCLS3513Placa de poliestireno, fundo plano, estéril
DexametasonaSigmaD2915
Dispase IISigma4942078001
DMEM/F12Gibco31331Adicionada a glutamina
DMSOSigmaD2438
Anticorpo anti-coelho do burroInvitrogenA32795Alexa Fluo Plus 647
Eppendorfs 1,5 mLEppendorf15625367
FBSGibcoA5256701
Formaldeído 37%Termo Científica119690010
Recipiente congelanteTermo Científica  5100-0001
Hoechst InvitrogenH3570
IncubadoraTermo Científica50116048Incubadora de CO2 Heracell 150i
IndometacinaSigmaI7378
InsulinaSigmaI9278
  microscópio invertido equipado com um 10 e vezes; Iluminação por objetivo e halogênioCarl Zeiss Axio Vert.A1
Mouses C57BL/6JRio Charles
MicrotesourasFST (Alemanha Inoxidável)
NDSSigmaD9663
Câmara NeubauerTermo Científica10195580
PBS 10xGibco14200
PBS 1xGibco14190
Penicilina/EstreptomicinaGibco15140-122
Placas de PetriSarstedt83.3902
Placas qPCRTermo CientíficaAB-0600
Sonda qPCR para Fabp4Termo Científica4331182TaqMan analisa, Mm00445878_m1
Sonda qPCR para PpargTermo Científica4331182O TaqMan ensaia, Mm00440940_m1
Sonda qPCR para Ucp-1Termo Científica4331182TaqMan ensaia, Mm01244861_m1
Kit de transcrição reversa  Termo Científica4368813Kit de cDNA de alta capacidade
Kit de extração de RNAOmega Bio-TekR6934-02E.Z.N.A. Total RNA Kit II
RosiglitazoneSigmaR2408
Triton X-100Termo CientíficaA16046
Trippan BlueSigmaT8154
Tripsina-EDTAGibco25300054
Banho-mariaGrantSAP12 Capacidade de 12 L

Referências

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