Artigo de método

Avaliação colorimétrica da atividade da deiodinase 1 em microssomos do fígado humano usando a reação de Sandell-Kolthoff

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DOI:

10.3791/70104

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10 de abril de 2026

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1Experimental Toxicology and Ecology, BASF SE, 2Pharmacy, Pharmacology and Toxicology, Free University of Berlin, 3German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), German Centre for the Protection of Laboratory Animals (Bf3R)

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método colorimétrico para avaliar de forma confiável a influência de substâncias químicas na atividade da Deiodinase 1 (DIO1) em microrganismos hepáticos humanos usando a reação de Sandell-Kolthoff. Inclui critérios de aceitação pré-definidos e métricas estatísticas de desempenho, apoiando esforços contínuos para a inclusão das diretrizes de teste da OCDE.

Resumo

Esse método permite a identificação de substâncias testadas que inibem a atividade da DIO1 e podem, portanto, interferir na homeostase do hormônio tireoidiano. O protocolo apresentado descreve um método colorimétrico não radioativo para avaliar os efeitos das substâncias testadas sobre a atividade enzimática da Deiodinase 1 (DIO1) em microssomos hepáticos humanos. O ensaio é baseado na reação de Sandell-Kolthoff (SK), que quantifica o iodeto liberado durante a deiodinação da triiodotironina reversa (rT3) para diiodotironina (T2). O cério amarelo (IV) é reduzido a cério incolor (III) na presença de iodeto, permitindo detecção fotométrica a 415 nm. Nesse sistema padronizado, a concentração de cério (IV) é definida para 40 mM para melhorar a estabilidade e robustez do sinal nas condições descritas. Para garantir a confiabilidade e reprodutibilidade do ensaio, está incluído um sistema de controle abrangente: 6-propil-2-tiouracila (item de referência), aurotroioglicose (controle positivo), 1-tio-β-D-glicose sal de sódio (controle negativo) e 1% de dimetil sulfóxido (controle com solvente). O protocolo inclui um ensaio de medição de distância para determinar concentrações apropriadas para testes, padronização da atividade específica de liberação de iodeto por lote de microssomos e testes estruturados de interferência química na ausência de microssmosmos, com uma avaliação opcional de acompanhamento sem ditiotreitol (DTT) para identificar artefatos dependentes da DTT. O ensaio DIO1-SK é adequado para triagem de médio a alto rendimento e estudos de toxicologia mecanicista. Sua robustez, escalabilidade e aplicabilidade a microsmas humanos fazem dele uma ferramenta valiosa para investigar a perturbação endócrina. Este protocolo apoia esforços de validação regulatória.

Introdução

Disruptores endócrinos (DEs) são substâncias químicas que interferem na regulação hormonal e, consequentemente, causam efeitos adversos emhumanos 1,2. Deiodinases (DIO) são enzimas associadas à membrana, com a selenocisteína como um resíduo-chave em seus locais ativos. Essa família de enzimas compreende três isoformas distintas (DIO1, DIO2 e DIO3), que modulam coletivamente as concentrações do hormônio tireoidiano circulante (TH) e governam sua disponibilidade específica de tecido dentro das células3. A tiroxina (T4), que atua como prohormônio, e a triiodotironina (T3), a forma ativa, desempenham papéis vitais na regulação do gasto energético, crescimento, processos de desenvolvimento e termorregulação nocorpo 4. As isoformas DIO diferem nas características de sua especificidade do local de deiodinação, propriedades cinéticas e preferências desubstrato 3. DIO1 é a principal isoforma de deiodinase no fígado adulto e apresenta forte afinidade por substrato por triiodotironina reversa (rT3) e iodotironinas sulfatadas, enquanto DIO2 utiliza preferencialmente T4 e rT3, e DIO3 atua principalmente sobre T4 e T3. O uso de microssomos hepáticos humanos e rT3 como substrato permite a detecção seletiva da atividade DIO1, minimizando a interferência de outras isoformas. Embora as consequências precisas da inibição induzida por substâncias da DIO1 ainda não tenham sido totalmente esclarecidas, evidências de mutações genéticas humanas que afetam a DIO1 demonstram claramente que a DIO1 pode perturbar o sistema hormonaltireoidiano. Como resultado, há uma necessidade crítica de métodos robustos e reprodutíveis para investigar a inibição da DIO1.

O objetivo do método apresentado é quantificar a atividade DIO1 in vitro usando uma abordagem colorimétrica não radioativa baseada na reação de Sandell-Kolthoff (SK). O DIO1 catalisa a conversão do rT3 reverso em T2, um processo que resulta na liberação de íons iodeto. A reação SK permite a detecção sensível do iodeto liberado, possibilitando a determinação da atividade de liberação de iodeto (IRA) como medida direta da atividade do DIO1. Esse ensaio permite a detecção de efeitos inibitórios de substâncias testadas sobre DIO1, apoiando toxicologia mecanicista, triagem ou tomada de decisões regulatórias. É particularmente relevante para investigar a inibição da DIO1 como um evento molecular iniciador de vias adversas que levam à perturbação da tireoide, conforme evidenciado por esforços internacionais de validação como os coordenados pela EURLECVAM 6,7. O método foi originalmente desenvolvido em2012 8,9 e otimizadoainda mais no 6,7 em resposta à crescente necessidade de ensaios in vitro robustos, reproduzíveis e escaláveis que possam ser integrados a baterias de teste para triagem endócrina, especialmente no contexto do metabolismo do hormônio tireoidiano. Recentemente, foi publicada a aplicação de configurações analógicas baseadas em SK para medium-10 a screeningde alta produtividade 11, demonstrando a ampla aplicabilidade da abordagem baseada em SK.

Embora o ensaio DIO1-SK meça indiretamente a atividade da DIO1 ao quantificar produtos IRA em vez de TH, ele oferece várias vantagens em relação a técnicas alternativas. Diferentemente de métodos que dependem de substratos marcadospor radiodifusão 12 ou da quantificação baseada em espectrometria de massas de hormônios tireoidianos esgotadosou formados 13, a reação SK fornece uma leitura simples, escalável e econômica ao medir a liberação de iodeto em 415 nm14. Embora os métodos LC-MS/MS com extração em fase sólida (SPE-LC-MS/MS) ofereçam alta especificidade e sensibilidade para quantificar rT3 e T2, eles exigem instrumentação cara e são menos adequados para triagem de maior rendimento. Em contraste, o ensaio DIO1-SK pode ser implementado em ambientes laboratoriais padrão e já foi pré-validado para uso com microssomos hepáticos humanos, demonstrando alta reprodutibilidade e preditividade 6,7. Em um estudo comparativo, os resultados da reação SK, especificamente a liberação de iodeto, foram diretamente comparados com a quantificação de metabólitos do hormônio tireoidiano (rT3 e T2) usando SPE-LC-MS/MS 15. Os resultados revelaram uma forte concordância entre as duas abordagens em uma variedade de substâncias testadas e potências inibidoras. Para todas as substâncias testadas, as mudanças na atividade de liberação de iodeto (IRA) medidas pela reação SK refletiram de perto as alterações nos níveis de rT3 e T2 determinadas por espectrometria de massas. Isso reforçou ainda mais a validade do SK readout como substituto para a atividade DIO1. Essas análises comparativas confirmam que o ensaio SK oferece uma alternativa robusta e confiável a técnicas analíticas mais complexas, e que a liberação de iodeto pode ser medida com confiança para avaliar a inibição de DIO1 in vitro.

No entanto, o método SK apresenta certas limitações que devem ser consideradas: ele é suscetível a interferências de substâncias que contêm iodeto livre como impureza, liberam iodeto de forma não enzimática ou reagem com componentes do ensaio como o ditiotreitol (DTT). A DTT é incluída como um cofator redutor para manter a competência catalítica da deiodinase, apoiando a regeneração da selenocisteína em sítio ativo em seu estado reduzido durante a renovação. Como a DTT é um redutor forte, certas substâncias de teste (ou impurezas) podem sofrer reações redox que influenciam a leitura colorimétrica e, em alguns casos, levam a artefatos dependentes da DTT não relacionados à liberação enzimática de iodeto. Tais interferências podem levar a resultados falsos negativos para a inibição da DIO1, já que o iodeto medido pode não se originar da conversão enzimática da rT3. Assim, embora o ensaio SK seja adequado para triagem rotineira e para a maioria das substâncias testadas, o LC-MS/MS pode ser usado para confirmação sempre que houver suspeita de interferência no ensaio ou para substâncias com propriedades químicas complexas.

O ensaio DIO1-SK está atualmente sendo preparado para inclusão como diretriz de teste da OCDE em um projeto internacional PEPPER (Plataforma público-privada para validação de métodos de caracterização de disruptores endócrinos), que destaca sua crescente importância para aplicações regulatórias e a harmonização internacional das estratégias de testes de disruptores endócrinos. O ensaio pode ser integrado a baterias de teste in vitro abrangentes, apoiando tanto a avaliação de segurança química quanto investigações mecanicistas sobre perturbações endócrinas16. Quando combinados com ensaios que abordam outros eventos-chave ao longo da via de desfecho adverso à tireoide, contribuem para uma compreensão mais completa dos mecanismos de perturbação hormonal da tireoide.

Além disso, a escalabilidade e alta reprodutibilidade do protocolo o tornam ideal para triagem de média a alta cadência. Isso é essencial para avaliar grandes quantidades de substâncias durante o desenvolvimento de medicamentos e em ambientes acadêmicos, como demonstradorecentemente 11. Pesquisadores interessados na inibição de DIO1, seja para triagem, toxicologia mecanicista ou tomada de decisões regulatórias, se beneficiarão de um ensaio robusto, acessível e versátil. A validação desse método o tornará uma ferramenta padrão para pesquisas sobre a perturbação do sistema hormonal tireoidiano e para avaliação da segurança química.

Protocolo

NOTA: Antes de realizar o ensaio principal, uma série de etapas preparatórias é essencial para garantir a precisão, reprodutibilidade e validade do ensaio DIO1-SK. Essas atividades de pré-ensaio incluem a fundição de placas filtrantes preenchidas com resina e troca iônica, que são críticas para uma separação eficaz e minimização da interferência de fundo na reação SK. A reação de Sandell-Kolthoff é padronizada regularmente usando curvas padrão de iodeto para monitorar mudanças sistemáticas e manter a qualidade do ensaio. A atividade dos micrônomos hepáticos humanos é medida para determinar a capacidade específica de liberação de iodeto em lote, garantindo desempenho enzimático consistente em experimentos. Juntos, esses passos fornecem uma base sólida para o trabalho subsequente de ensaio principal e avaliação de dados, apoiando a geração de resultados reproduzíveis e interpretáveis.

1. Trabalho de pré-ensaio

  1. Preparação de tampões e reagentes
    1. Prepare todos os buffers e soluções de estoque com antecedência, conforme descrito na Tabela 1. Armazene aliquotas conforme indicado para garantir estabilidade e reprodutibilidade.
    2. No dia do ensaio, prepare a mistura de substrato fresca para cada placa de 96 poços. Para uma placa de 96 poços, combine 5,75 mL de tampão HEPES/EDTA (50 mM HEPES, 2,16 mM EDTA, pH 7,0), 0,5 mL de 1 M DTT descongelado e 10 μL de 6 mM rT3 (dissolvido em DMSO). Misture delicadamente e mantenha a mistura de substrato no gelo até o uso.
  2. Preparação da referência
    1. Prepare uma solução de referência de controle 6-PTU 10-1 M em um solvente apropriado (por exemplo, DMSO) frescamente no dia da realização do ensaio.
    2. Prepare uma diluição 1:10 deste estoque emdiH 2O (RI-C8) para alcançar uma concentração de DMSO de 10% e prepare uma série de diluições a partir desse estoque em 10% DMSO emdiH 2O, conforme descrito na Tabela 2.
  3. Preparação do controle positivo
    1. Prepare uma solução de estoque de 10-2 M do controle positivo Aurothioglicose em um solvente apropriado (por exemplo, DMSO) e armazene-a por até 6 meses a 4 °C.
    2. No dia do ensaio, dilua o estoque para 10-3 M emdiH 2O para alcançar uma concentração de DMSO de 10% de DMSO.
  4. Preparação do controle negativo
    1. Prepare uma solução de estoque de 10-2 M do controle negativo 1-Thio-β-D-sal de sódio na hora da realização do ensaio.
    2. No dia do ensaio, dilua o estoque para 10-3 M emdiH 2O para alcançar uma concentração de DMSO de 10% de DMSO.
      NOTA: Sempre use as precauções de segurança adequadas, especialmente ao manusear produtos químicos perigosos como arsenito de sódio e ácido sulfúrico. Todos os reagentes devem ser preparados com água desionizada e armazenados conforme as recomendações do fabricante. A mistura de substrato, uma vez preparada, e a alíquota de DTT descongelada são destinadas a uso único no dia do ensaio e não devem ser recongeladas.
  5. Fundição de resina de troca iônica
    1. Use um recipiente retangular transparente apropriado para a preparação.
    2. Adicione cerca de 250 g (ou a quantidade desejada) de resina de troca iônica em um recipiente grande e lave. Lave adicionando 10% de ácido acético; Deixe a suspensão de resina descansar por 10 minutos.
    3. Depois de deixar a suspensão estabilizar por 10 minutos, incline levemente e aspire o sobrenadante. Lave pelo menos 5 vezes no total ou até que não haja mais cor vazando no solvente.
    4. Após a última etapa de lavagem, adicione 10% de ácido acético para que ele represente aproximadamente 50% do volume total.
    5. Incline o recipiente para que a resina se mova para um lado e estabilize o recipiente na posição inclinada. Espere ~10 minutos para as fases se separarem.
    6. Coloque uma placa de filtro de 96 poços sobre uma placa de 96 poços de profundidade e adicione 100 μL de ácido acético a 10% em cada poço da placa de filtro de 96 poços.
    7. Corte as pontas usadas para fundição de resina a uma altura de ~1 cm para alargar a abertura na extremidade e funda 300 μL de resina de troca iônica em cada poço da placa filtrante de 96 poços.
      NOTA: As pontas usadas em nosso trabalho têm um volume máximo de 1.200 μL e podem ser acopladas a pipetas multicanal.
    8. Elude o ácido acético centrifugando em uma placa de poço de 96 de profundidade com 100–200 × g em uma centrífuga com rotor basculante para placas de microtitulação por 1 minuto. Verifique se a resina está distribuída uniformemente pela placa.
    9. Fele a placa com uma folha de plástico impermeável e armazene a 4 °C por no máximo 6 meses.
      NOTA: Os constituintes da resina de troca iônica são conhecidos por afetar a reação SK se não forem devidamente lavados. O sobrenadante removido pode ser usado diretamente na reação SK (usar 50 μL de amostra de sobrenadante, adicionar 50 μL de cério e, finalmente, 50 μL de solução de arsenita) e pode ser comparado com uma amostra de ácido acético de 10% (controle em branco) para garantir a lavagem completa dos componentes.
  6. Padronização da reação de Sandell-Kolthoff
    1. Prepare diluições de iodeto de uma fonte de iodeto respectiva (por exemplo, solução padrão de iodeto) com concentrações recomendadas de 1.500, 1.000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 e 1 nM usando um padrão de iodeto respectivo emdiH 2O.
    2. Adicione 50 μL dediH 2O puro como controle e 50 μL das diluições de iodeto preparadas a uma placa de 96 poços em triplicado, conforme descrito no layout da Figura 1.
    3. Adicione 50 μL de solução de cério de 40 mM a todos os poços e inicie a reação adicionando 50 μL de solução de arsenito de 25 mM a todos os poços.
    4. Assim que possível após adicionar a solução de arsenita, meça a absorção usando um leitor de placas a 415 nm (±2 nm) registrando a densidade óptica (OD) a cada minuto por 21 minutos, além de registrar a OD inicial.
    5. Avalie os resultados conforme descrito na seção 4.
      NOTA: Normalmente, um histórico deΔOD 21min > 0,3 no controlediH 2O puro exigirá atenção e investigação adicional das causas subjacentes (por exemplo, contaminação no lote As ou Ce, baixa qualidade da água).
  7. Avaliação da atividade dos microssomos
    1. Prepare a maior concentração (RI-C8) do item de referência (6-PTU) conforme descrito no passo 1.2.
    2. Prepare as seis diluições de microssomos conforme descrito na Tabela 3 e a mistura de substrato conforme descrito na Tabela 1.
    3. Adicione 10 μL de uma diluição solvente de 10% (v/v) emdiH 2O (por exemplo, 10% de DMSO emdiH 2O) e 10 μL de 10-2 M 6-PTU (RI-C8) em uma placa de 96 poços em triplicado, conforme descrito no layout da placa na Figura 2.
    4. Adicione 40 μL de diluições microssomas emdiH 2O (resultando em 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,68 e 0 μg de proteína microssômica por poço) à placa de 96 poços, conforme mostrado no layout da placa.
      NOTA: Os fornecedores normalmente fornecem a concentração estocada da proteína microssomal. Se não, métodos padrão de quantificação de proteínas podem ser utilizados, embora não os tenhamos aplicado neste estudo.
    5. Adicione 50 μL de substrato recém-preparado em cada poço e feche a placa com uma folha de plástico impermeável.
    6. Coloque a placa de 96 poços em um shaker em uma incubadora (37 °C a 850 rpm) e incube por 2 horas.
    7. Após o tempo de incubação, coloque a placa sobre gelo para interromper a reação.
    8. Conduza a troca iônica de forma análoga ao passo 2.2.
    9. Transfira quantidades apropriadas de amostra do poço profundo obtido na etapa de troca iônica para uma nova placa de 96 poços para medir diluições não diluídas (50 μL de amostra), 1:2 (25 μL de amostra + 25 μL de ácido acético a 10%) e 1:4 (12,5 μL de amostra + 37,5 μL de ácido acético a 10%), mantendo a disposição da placa inalterada.
    10. Avalie os resultados conforme descrito na seção 4 e determine o fator de diluição das amostras em 10% de ácido acético, bem como a concentração microssômica de proteína que ainda leva aos maiores valores possíveis deΔOD 21min -BG na reação de Sandell-Kolthoff sem atingir o platô de saturação.
      NOTA: Normalmente, uma liberação de iodeto deΔOD 21min > 0,5 é facilmente possível nas diluições 1:4 ou 1:2 do ácido acético dos 20 μg de proteína microssômica por amostra de poço e geralmente varia em torno deΔOD 21min de 1. Concentrações mais altas de proteína microssômica não são recomendadas para uso, pois aumentam a ligação de fundo e inespecífica durante o ensaio. Recomenda-se repetir a medição de uma série de diluição de 6 PTU usando a concentração de microssomos e o fator de diluição determinados para confirmar o resultado.
  8. Avaliação de solubilidade dos itens testados
    1. Dissolva o item de teste a 100 mM ou 200 mg/mL em um solvente adequado (por exemplo, DMSO) em temperatura ambiente. Misture ou faça vórtice e verifique a dissolução visualmente (microscópio).
    2. Se não estiver dissolvido, faça sonicação por até 5 minutos e verifique novamente. Se ainda não estiver dissolvido, aqueça a 37 °C por até 60 minutos e volte a verificar.
    3. Se insolúvel, dilua ainda mais ou prepare um novo caldo em concentração menor e repita o procedimento. Se o DMSO não for adequado, tente água ou etanol como solventes alternativos.
    4. Uma vez dissolvido, prepare uma diluição 1:10 emdiH 2O (solvente 10%) e repita a avaliação (mistura, sonicação, aquecimento conforme necessário).
    5. Para simular as condições do ensaio, prepare uma diluição de 1% do item de teste no tampão do ensaio e repita a verificação de solubilidade.
  9. Preparação de itens de teste e localização de distância
    1. Prepare a solução de estoque do item de teste na maior concentração solúvel em um solvente adequado (preferencialmente DMSO), conforme determinado durante a avaliação de solubilidade no passo 1.8.
    2. Para o ensaio de localização de alcance, prepare oito diluições de itens de teste por etapas consecutivas de diluição 1:10 (v/v) usando a solução original e 10% de DMSO emdiH 2O.
    3. Realize o ensaio de localização de distância para estimar o perfil de inibição do item testado realizando as etapas descritas na seção 2. Se o item do teste mostrar ≥25% de inibição em qualquer concentração, ajuste a faixa de concentração para as sequências finais do ensaio para incluir pelo menos três concentrações na faixa linear de inibição e duas concentrações abaixo de 10% IRA, se aplicável.
    4. Se o item do teste mostrar <25% de inibição em todas as concentrações testadas, reutilize a mesma série de diluição nas execuções finais do ensaio. Nesse caso, o ensaio de localização de distância pode contar como uma das três sequências independentes exigidas.
      NOTA: Realize pelo menos dois, idealmente três, experimentos independentes para cada item de teste para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados. Se outra diluição for escolhida para melhor cobrir a faixa de atividade, uma desvio da razão de diluição 1:10 é permitida. O corte de 25% nessa estratégia de teste (ver passos 1.9.3 e 1.9.4) distingue os efeitos dos itens de teste dos controles negativos, levando em conta a variabilidade da atividade de base enquanto oferece uma margem de segurança adicional. Esse limiar garante uma classificação confiável dos perfis inibitórios.

figure-protocol-1
Figura 1: Disposição das placas para a curva padrão de iodeto. Esta figura mostra o layout de placas de 96 poços usado para gerar a curva padrão de iodeto. Poços contêm diluições seriadas de iodeto que variam de 1 nM a 1.500 nM, além de controles apenasdiH 2O.  Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Disposição das placas para titulação de proteínas microssômicas e testes de itens de referência. Esta figura mostra o layout de placas de 96 poços para a titulação de proteínas microssômicas e o teste de inibidor de referência (6-PTU). As linhas contêm quantidades crescentes de proteína microssômica por poço, com e sem 6-PTU.  Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

2. Realização do ensaio DIO1–SK

  1. Incubação de microssomos com item de teste
    1. Prepare o item de referência conforme descrito na etapa 1.2, assim como o controle positivo e negativo, conforme descrito nas etapas 1.3 e 1.4. Prepare os itens de teste com concentrações adequadas seguindo o protocolo descrito nas etapas 1.8 e 1.9.
    2. Prepare a mistura de substrato conforme descrito na Tabela 1 e prepare uma suspensão de microssomos na concentração proteica pré-definida conforme a etapa 1.7, diluindo cuidadosamente a solução de microssomos descongelada e aliquotada emdiH 2O. Mantenha a suspensão de microssomos no gelo até que seja necessário para incubação.
    3. Seguindo os layouts das placas mostrados nas Figuras 3 e 4 (se mais de dois itens de teste forem avaliados simultaneamente), adicione 10 μL de concentrações de itens de referência, controle positivo e negativo, controle de solvente (solvente de 10% (v/v) emdiH 2O) e concentrações de itens de teste aos poços.
    4. Adicione 40 μL da suspensão microssoma em todos os poços. Adicione 50 μL da mistura de substrato recém-preparada às amostras.
    5. Selar a placa com uma folha de plástico impermeável e colocá-la em um shaker em uma incubadora (37 °C a 850 rpm) por 2 horas; Coloque a placa após a incubação sobre gelo para impedir a reação.
    6. Coloque a placa sobre gelo após a incubação para impedir a reação.
      NOTA: A placa pode ser armazenada no gelo até a medição para preservar a integridade da amostra. A primeira placa de ensaio contém oito concentrações do item de referência, enquanto cada placa adicional no mesmo dia contém apenas a maior concentração do item de referência, deixando mais espaço para itens de teste adicionais, se necessário.
  2. Separação por meio de placas filtrantes preenchidas com resina de troca iônica de 96 poços
    1. Coloque uma placa filtrante preparada preenchida com resina de troca iônica e 96 poços, conforme preparado no passo 1.5, sobre uma placa de 96 poços de profundidade e adicione 150 μL de ácido acético a 10% em cada poço da placa filtrante de 96 poços preenchida com resina de troca iônica para umedecer a resina nas colunas.
    2. Elude o ácido acético centrifugando na placa usada de 96 poços de profundidade com 100–200 × g em uma centrífuga com rotor oscilante para placas de microtitulação por 1 minuto.
    3. Substitua a placa usada de 96 poços de profundidade por uma nova de 96 de profundidade.
    4. Adicione 133 μL de ácido acético a 10% a cada poço da placa incubada de 96 poços do passo 2.1.6 e agite brevemente a placa para misturar as soluções.
    5. Transfira 175 μL das amostras preparadas na etapa anterior para a placa de filtro de 96 poços preenchida com resina de troca iônica, mantendo o layout inicial da placa.
    6. Passe as amostras pela resina e para a placa do poço de 96 de profundidade centrifugando (100–200 × g) em uma centrífuga com rotor oscilante para placas de microtitulação por 1 minuto. Remova a placa filtrante de 96 poços preenchida com resina de troca iônica.
      NOTA: A placa do poço com 96 de profundidade e amostras pode ser selada com uma folha plástica impermeável e armazenada a 4 °C por pelo menos 3 meses. Isso permite medições adicionais em caso de erros manuais/técnicos ou alterações no fator de diluição na reação ou medição de Sandell-Kolthoff nos dias seguintes.
  3. Reação Sandell-Kolthoff
    1. Dependendo do fator de diluição determinado das amostras em ácido acético 10% para o lote de microssomos usado (veja passo 1.7), adicione 50 μL da amostra não diluída ou devidamente diluída a uma nova placa de 96 poços.
    2. Adicione 50 μL de solução de cério de 40 mM (preparada conforme descrito na Tabela 1) a todos os poços e inicie a reação adicionando 50 μL de solução de arsenita de 25 mM (preparada conforme descrito na Tabela 1) a todos os poços.
    3. Assim que possível após adicionar a solução de arsenito, meça a absorção usando um leitor de placas a 415 nm (±2 nm) registrando a densidade óptica (OD) a cada minuto por 21 minutos, além de registrar a OD inicial.

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Figura 3: Disposição de placas para testes paralelos de dois itens de teste. Disposição de placas de 96 poços para testar dois itens de teste em triplicado em múltiplas concentrações, juntamente com réplicas de controles negativos, positivos, solventes e o item de referência. Usado como a primeira placa de ensaio do dia. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Disposição da placa para testes paralelos de três itens de teste. Disposição de placas de 96 poços para testar três itens de teste em triplicado em múltiplas concentrações, com réplicas dos controles negativo, positivo e solvente. O item de referência é incluído apenas em sua maior concentração, pois é totalmente testado na primeira placa (veja a Figura 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

3. Teste de interferência (microssomos ± e ± DTT)

  1. Prepare a maior concentração (RI C8) do item de referência (6 PTU) conforme descrito no passo 1.2 e prepare a solução e diluições do estoque do item de teste (incluindo a maior concentração do item de teste).
  2. Prepare a suspensão de microssomos na concentração definida por poço (veja passo 1.7) diluindo microssomos cuidadosamente descongelados e aliquotados emdiH 2O. Mantenha a suspensão de microssomos no gelo até o uso.
  3. Prepare duas misturas de substrato: a mistura padrão de substrato com DTT conforme descrito na Tabela 1, e uma mistura de substrato idêntica sem DTT (omitindo apenas DTT).
  4. Dispense nos poços designados de uma placa de 96 poços conforme a Figura 5: 10 μL de RI C8, 10 μL de 10% (v/v) de DMSO emdiH 2O (controle de solvente) e 10 μL de cada diluição do item de teste.
  5. Adicione 40 μL de suspensão de microssomos a poços designados "com microsssomas" e 40 μL dediH2Oa poços designados "sem microssomos", conforme a Figura 5.
  6. No gelo, adicione 50 μL de mistura de substrato com DTT aos poços designados "com DTT" e 50 μL da mistura de substrato sem DTT aos poços designados "sem DTT" (Figura 5).
  7. Sele a placa com uma folha de plástico impermeável e incube em um shaker em uma incubadora (37 °C, 850 rpm) por 2 horas.
  8. Após a incubação, coloque a placa sobre gelo para impedir a reação.
  9. Realize separação por troca iônica e quantificação de iodeto via reação SK conforme descrito nos passos 2.2 e 2.3, e avalie os resultados conforme descrito na Seção 4.
    NOTA: Esta configuração de placa única (Figura 5) testa a maior concentração de itens de teste em paralelo com vs. sem microssomos e com versus sem DTT para distinguir a atividade enzimática DIO1 dos artefatos do ensaio. Um aumento de IRA ≥20% em poços sem microssomos indica interferência SK (liberação/leitura de iodeto independente de DIO1), e a substância é classificada como "não aplicável no ensaio SK DIO1" e excluída da análise. Diferenças entre condições com TDT e sem TDT ajudam a identificar a liberação de iodeto dependente de DTT como um mecanismo adicional de interferência.

figure-protocol-5
Figura 5: Disposição da placa para testes de interferência. Esta figura mostra o layout de placas de 96 poços para testes de interferência, onde itens de teste, item de referência e controle de solventes são testados tanto com quanto sem microssomos na presença de DTT, bem como sem microssomas e sem a presença de DTT. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Avaliação de dados

  1. Avaliação da atividade do DIO1
    1. Determine os valoresΔOD 21min por subtração dos valores de 21 min de todas as amostras a partir dos valores iniciais medidos (0 min):
      figure-protocol-6
    2. Determine os valores ΔOD-BG subtraindo a média dos valoresΔOD 21min dos controles inibidos 10 3 M 6-PTU (RI) dos valoresΔOD 21min de todas as amostras:
      figure-protocol-7
    3. Normalize os valores do item de teste para os respectivos valores de controle de solvente via divisão do(s) item(is) de teste (TI) ΔOD21min-BG TI pela média dos valoresΔOD 21min -BG SC do respectivo controle de solvente (SC), gerando valores de atividade de liberação de iodeto (IRA) em %.
      figure-protocol-8
    4. Plote os valores IRA das diferentes concentrações dos itens de teste em um pacote de software de estatística, com os valores do IRA no eixo y (linear) e as concentrações dos itens de teste no eixo x (logarítmico).
    5. Use um algoritmo de ajuste de curva para visualizar uma relação concentração-resposta (por exemplo, "[Inibidor] versus resposta -- Inclinação variável (quatro parâmetros)" em software estatístico escolhido. "Top" representa a resposta máxima, "Bottom" representa a resposta mais baixa, e "HillSlope" descreve a inclinação da curva:
      figure-protocol-9
    6. Determine o IC50 do item de referência e, se aplicável, do item de teste.
    7. Calcule o coeficiente de variância (CV) da estimativa log IC50 do item de referência em %:
      figure-protocol-10
    8. Calcule o IRA do controle negativo normalizado para o controle do solvente em %:
      figure-protocol-11
    9. Calcule o IRA do controle positivo normalizado ao controle do solvente em %:
      figure-protocol-12
    10. Calcule o fator z:
      figure-protocol-13
    11. Para verificar a validade do experimento, compare os valores calculados com os critérios de aceitação na Tabela 4.
      NOTA: Todos os critérios devem ser cumpridos para obter uma execução válida do ensaio.
    12. Classifique os itens do teste como inibidores completos, parciais ou não inibidores com base em sua inibição máxima e nos valores de IC50 , conforme resumido na Tabela 5.

Resultados

A Figura 6 apresenta uma visão geral do fluxo de trabalho do ensaio DIO1-SK e das principais etapas de padronização necessárias para estabelecer com sucesso o método em um laboratório. O fluxo de trabalho (Figura 6A) resume as fases sequenciais do ensaio, incluindo o uso de microrganismos hepáticos humanos, incubação com itens de teste e controles, extração de iodeto via separação por troca iônica e a quantificação colorimétrica do iodeto usando a reação de Sandell–Kolthoff (SK). A Figura 6B destaca a estratégia de padronização que sustenta o desempenho robusto e os resultados válidos, incluindo (i) padronização da reação SK, (ii) teste de atividade microssoma específica por lote, (iii) avaliação de solubilidade e teste de interferência, (iv) um ensaio de determinação de distância e (v) ajuste das concentrações dos itens de teste com base na primeira execução válida do ensaio.

Um elemento central dessa estratégia é o teste de atividade microssômica específica para lote, pois os lotes de microssomos do fígado humano podem diferir substancialmente em sua atividade de desiodinação de rT3, exigindo a determinação de uma concentração enzimática adequada para cada novo lote antes do teste rotineiro de substâncias.

Essa estratégia de teste em etapas é fundamental para a implementação: somente após a verificação do desempenho inicial do ensaio (controles, comportamento de reação SK e atividade dos microssomos) e as condições padronizadas que o teste de substâncias pode ser esperado para fornecer perfis de inibição válidos e interpretáveis.

figure-results-1
Figura 6: Fluxo de trabalho e etapas de padronização do ensaio DIO1 SK. (A) O fluxo ilustra o uso de microssomos hepáticos humanos, a configuração da placa de 96 poços, a incubação com itens de teste e controles, extração de iodeto e quantificação colorimétrica via reação SK. Cada etapa é representada sequencialmente para destacar as principais fases do ensaio. (B) As etapas de padronização incluem a padronização da reação de Sandell-Kolthoff, teste de atividade microssoma específica por lote, avaliação de solubilidade e teste de interferência, ensaio de medição de distância e ajuste das concentrações dos itens de teste com base na primeira execução válida do ensaio. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Com base no fluxo de trabalho e na estrutura de padronização mostrada na Figura 6, a Figura 7 ilustra como os laboratórios determinam uma concentração adequada de proteína microssômica (e diluição pós-troca iônica) para alcançar uma faixa dinâmica suficiente, mantendo uma resposta de inibição sigmoidal para o inibidor de referência. Na Figura 7A, a ΔOD21min-BG aumenta com o aumento da proteína microssômica e depende da diluição pós-troca iônica (não diluída, 1:2, 1:4). A diluição que gera a maior ΔOD21min-BG, mantendo uma resposta sigmoidal, é selecionada para experimentos subsequentes (exemplo mostrado: diluição 1:2). Na Figura 7B, curvas de inibição 6-PTU são comparadas entre quantidades microssômicas de proteínas para identificar a menor concentração de proteína que ainda produz uma curva sigmoidal (exemplo mostrado: 5 μg de proteína/poço), equilibrando assim a sensibilidade com o fundo.

Importante destacar que essa etapa de otimização deve ser realizada por cada laboratório ao implementar o método, pois a concentração proteica necessária depende da atividade do lote microssomo utilizado, exigindo a padronização específica da concentração enzimática para cada lote.

figure-results-2
Figura 7: Atividade microssômica e inibição por 6-PTU. (A) O gráfico mostra o aumento da atividade à medida que o sinal de Sandell-Kolthoff corrigido pelo fundo (BG) (ΔOD21 min n- BG) com quantidades crescentes de proteína microssômica por poço (log10[μg proteína/poço]), testado em diluições não diluídas, 1:2 e 1:4. A maior diluição com o maior valorΔOD 21 min–BG, bem como com formato sigmoidal, será usada em experimentos futuros. Neste caso, é a diluição 1:2. (B) Curva concentração–resposta do inibidor de referência 6-propil-2-tiouracilo (6-PTU) mostrando a atividade de liberação de iodeto (IRA em %) plotada contra log10[concentração (M)] em diferentes cargas microssomais de proteína (5, 7,5 e 10 μg/poço). Os valores do IRA são normalizados para o controle do solvente. Os pontos de dados de ambos os gráficos representam a média ± DS de três réplicas técnicas (poços) por condição de um teste representativo de atividade microssomo. As curvas foram ajustadas por regressão não linear usando um modelo logístico de quatro parâmetros ("inclinação variável") (inibidor vs. resposta). A menor concentração de proteína com curva sigmoidal será usada em experimentos futuros; Neste caso, 5 μg/poço. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Uma vez concluídos os passos de fluxo de trabalho e padronização (Figura 6) e uma concentração adequada de proteína microssomal estabelecida para o lote selecionado de microssomos (Figura 7), os parâmetros centrais do ensaio estão em funcionamento para prosseguir com os testes rotineiros de substâncias. Nesta etapa, os itens de teste podem ser avaliados junto com o conjunto de controle de placa (item de referência, controle de solvente e controles positivo/negativo) no formato padronizado de placa, permitindo normalização robusta e interpretação consistente dos perfis de inibição.

A Figura 8 demonstra a discriminação do ensaio baseada no comportamento concentração–resposta na atividade de liberação de iodeto (IRA). O inibidor de referência 6-PTU (Figura 8A) mostra uma diminuição dependente da concentração na IRA, fornecendo o perfil esperado de inibição sigmoidal, conforme esperado para a verificação do desempenho do ensaio. Ácido tânico (Figura 8B) apresenta um perfil inibitório comparável ao inibidor de referência (inibição máxima > 90%) sob as condições apresentadas. As três maiores concentrações da substância testada apresentaram valores negativos de IRA. Valores de IRA <0% não refletem uma 'liberação negativa de iodeto' biologicamente significativa, mas surgem do procedimento de cálculo (subtração de fundo e normalização para o controle do solvente), que pode propagar pequenas flutuações no controle do solvente em valores normalizados negativos. Assim, valores de IRA abaixo de 0% são considerados equivalentes a 0% (linha de base) para interpretação dos resultados. O dibutilftalato (Figura 8C) não apresenta inibição (inibição máxima abaixo de 25%) em toda a faixa de concentração testada, representando um perfil não inibidor. Juntos, esses perfis ilustram que o ensaio pode diferenciar comportamentos inibitórios de comportamentos não inibitórios sob condições padronizadas. O sistema de teste também pode identificar inibidores parciais, que apresentam níveis máximos de inibição entre 25% e 90% (dados não mostrados). Mais detalhes sobre como esses grupos são categorizados podem ser encontrados na Tabela 5.

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Figura 8: O comportamento dose-resposta do ensaio DIO1–SK distingue inibidores de não inibidores. Curvas dose-resposta mostram a atividade de liberação de iodeto (IRA em %) representada em função da concentração log10 (M) para (A) o inibidor de referência 6-PTU, (B) um inibidor representativo (ácido tânico) e (C) um não-inibidor representativo (ftalato de dibutil). Os valores de IRA foram calculados após subtração de fundo e normalizados para o controle do solvente. Símbolos representam a média ± DS (n = 3) de um experimento independente, cada um realizado com três réplicas técnicas (poços) por concentração. As curvas foram ajustadas por regressão não linear usando um modelo logístico de quatro parâmetros ("inclinação variável") (inibidor vs. resposta). Valores de IRA abaixo de 0% são considerados equivalentes a 0% (linha base) para interpretação dos resultados. Esses dados demonstram que o ensaio fornece um perfil sigmoidal de inibição para o inibidor de referência e pode confirmar se uma curva concentração-resposta é inibitória ou não inibitória sob condições padronizadas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Em uma execução válida de ensaio, os controles de solvente (SC) mostram uma separação clarado sinal ΔOD 21min da condição de referência totalmente inibida (6-PTU, RI-C8). Em um conjunto de dados de exemplo (10 execuções independentes), cada placa incluía n = 9 réplicas técnicas para SC e a referência totalmente inibida (6-PTU em 10−3 M). Em todas as placas, os valores médios de SC ΔOD21min das placas variaram de 1,383 a 1,819 (média ± DS: 1,565 ± 0,114), enquanto os valores médios de ΔODda placa 21min para a condição inibida de 6-PTU variaram de 0,258 a 0,771 (média ± DS: 0,473 ± 0,087). O cálculo de ΔOD neste ensaio baseia-se na diferença entre OD0min eOD 21min, e a validade do ensaio é comumente apoiada por um limiar de fator z de >0,5.

Em 10 execuções independentes de ensaio, 6-PTU produziu uma curva de concentração-resposta sigmoidal com valores IC50 variando de 1,20E-06 M a 5,02E-06 M (média ± DS: 2,74E-06 M ± 1,13E-06 M). Os critérios de aceitação para os valores do IC50 na faixa de referência de 1.00E-06 a 1.00E-05 são baseados em dados de estudos de validação anteriores. No entanto, os valores do IC50 são significativamente afetados pelo lote específico de microssomos usados e podem apresentar variabilidade considerável. No entanto, espera-se que essas variações permaneçam dentro da mesma ordem de magnitude.

A qualidade do ensaio pode ser resumida usando o fator z′, que reflete tanto a janela do sinal quanto a variabilidade dos controles. No conjunto de dados descrito, seis curvas de referência foram associadas a fatores z′ variando de 0,544 a 0,774 (média ± DS: 0,658 ± 0,062), consistente com a meta de aceitação comumente usada de z′ > 0,5.

Na prática, execuções subótimas podem ser identificadas por desvios no fundo do ensaio e/ou falha em atender a critérios de aceitação pré-definidos. Por exemplo, um fundo elevado na reação de Sandell-Kolthoff é indicado quando o blank diH₂O puro mostra ΔOD > 0,3, o que justifica investigação (por exemplo, contaminação por reagentes ou problemas de qualidade da água). Tais aumentos de fundo podem reduzir a faixa dinâmica do ensaio e elevar a variabilidade do controle, contribuindo assim para a falha nos critérios de aceitação, incluindo um fator z abaixo de 0,5. Poços que apresentam artefatos técnicos óbvios (por exemplo, precipitação ou descoloração anormal) são excluídos da avaliação como valores atípicos. Outliers determinados por teste de boxplot também são excluídos. Se os critérios de aceitação não forem atendidos após a remoção dos casos fora do padrão, a execução do ensaio é considerada inválida e deve ser repetida.

Reagente/BufferInformações sobre preparação
Solução ácida de amônio e cério (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0,5 M H2SO4) (250 mL)Adicione 6,32 g de (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O e 125 mL de diH2O em um frasco volumétrico de 250 mL. Adicione 125 mL 1 M H2SO4 para atingir um volume final de 250 mL. Armazene em temperatura ambiente até 6 meses.
DTT (Aliquotas de 1 M)Aliquota preparou ou fornecia 1 M de solução DTT em H2O como 0,5 mL aliquotas em tubos microcentrífugas de 1,5 mL e armazenada a -20°C por até 6 meses.
HEPES (50 mM) / EDTA (2,16 mM) tampão (pH 7,0)Usando um frasco volumétrico de 250 mL, adicione 12,5 mL de solução de 1 M HEPES, 201 mg de ácido etilenediaminotetraacético (EDTA) e encha até 250 mL com diH2O. Armazene a 4°C por até 3 meses.
Solução rT3 ("tubos de mistura de substrato")Dissolva rT3 em DMSO até uma concentração final de 6 mM, aliquote-os em porções de 10 μL em tubos centrífugos de 15 mL e armazene-os a -20°C por até 6 meses.
Solução de arsenito de sódio (25 mM NaAsO2, 0,8 M NaCl, 0,5 M H2SO4) (250 ml)Adicione 0,81 g de NaAsO2, 11,7 g de NaCl e 125 mL de diH2O a um frasco volumétrico de 250 mL. Adicione 125 mL 1 M H2SO4 para atingir um volume final de 250 mL. Armazene em temperatura ambiente até 6 meses.

Tabela 1: Preparação de tampões e reagentes. Esta tabela detalha as etapas de preparação e as instruções de armazenamento para todos os buffers e soluções de stock usados no ensaio DIO1 SK, incluindo buffer HEPES/EDTA, DTT, solução rT3, solução ácida de amônio e cério de amônio e solução de arsenito de sódio.

Nome da diluição do item de referênciaConcentração de diluição de itens de referência [M]10% DMSO [μL]Item de referênciaConcentração final do item de referência no ensaio [M]
RI-C81.00E-0245050 μL de solução de estoque de referência de itens 10-1 M1.00E-03
RI-C71.00E-0345050 μL de RI-C81.00E-04
RI-C61.00E-0445050 μL de RI-C71.00E-05
RI-C53.16E-05342158 μL de RI-C63.16E-06
RI-C41.00E-0545050 μL de RI-C61.00E-06
RI-C33.16E-0645050 μL de RI-C53.16E-07
RI-C21.00E-0645050 μL de RI-C41.00E-07
RI-C11.00E-0745050 μL de RI-C21.00E-08

Tabela 2: Preparação das diluições de itens de referência. Esta tabela resume a preparação das diluições seriais para o item de referência (6-PTU), incluindo concentrações, volumes de DMSO e concentrações finais usadas no ensaio.

Microssomo por poço [μg]diH2O [μL]Diluição de microssomos [μL]Concentração final de enzimas no ensaio [μg/mL]
2078020 μL de solução de microssomo de 20 mg/mL200
10400400 μL de 20 μg de microssomo por diluição de poço100
5400400 μL de 10 μg microssomo por diluição de poço50
2.5400400 μL de 5 μg microssomo por diluição de poço25
1.25400400 μL de 2,5 μg de microssomo por diluição de poço12.5
0.68400400 μL de 1,25 μg microssomo por diluição de poço6.8

Tabela 3: Preparação de diluições de microssomos. Esta tabela fornece o esquema de diluição para proteína microssômica por poço, incluindo os volumes necessários de diH₂O e solução de microssoma para alcançar as concentrações finais de proteína microssômica para o ensaio.

Critérios de aceitaçãoValor de corte sugerido
Numeric
IC50 do item de referência [M]1*10-05 - 1*10-06
CV do log IC50 estimativa do item de referência [%]< 3
Controle negativo do IRA [%]80 - 120
Controle positivo IRA [%]20 <
Z'-Factor> 0,5
Binário
Forma do item de referência (sigmoidal?)sim
A curva final concentração-resposta do item de referência é composta por no mínimo seis concentrações de três réplicassim
A curva final concentração-resposta do item de teste é composta por no mínimo seis concentrações de três réplicassim

Tabela 4: Critérios de aceitação para o ensaio DIO1 SK. Esta tabela lista os critérios de aceitação para validade do ensaio, como faixa IC₅₀, coeficiente de variação, valores IRA para controles, fator z e requisitos para curvas concentração-resposta. As janelas de aceitação foram derivadas de estudos de validação DIO1-SK previamentereportados 6, incluindo uma avaliação de reprodutibilidade baseada em cinco execuções independentes que informaram a janela de referência IC₅₀. Em um conjunto de dados de exemplo com 10 execuções independentes, o desempenho do fator z variou de 0,544 a 0,774 (média ± SD: 0,658 ± 0,062), apoiando o limiar de aceitação z′ usado aqui.

Categoria (por eficácia)Subcategoria (por potência)Atividade inibitóriaLimiar
Categoria 1: inibidor totalR: Inibidor completo potenteInibe totalmente a atividade da DIO1 em uma concentração comparável ao item de referência 6-PTUInibição máxima. maior 90% e IC50 na faixa superior ou abaixo da IC50 da 6-PTU
B: Inibidor completo fracoInibe totalmente a atividade de DIO1 em concentrações mais altas do que o item de referência 6-PTUInibição máxima maior 90% e IC50 acima da faixa superior de IC50 da 6-PTU
Categoria 2: inibidor parcial-Sem inibição total, mas com controle negativo e solvente superiorInibição máxima entre 25% e 90%
Categoria 3: não inibidor-Não inibe DIO1 (assim como o controle negativo e solvente)Inibição máxima abaixo de 25%

Tabela 5: Classificação dos itens testados com base na potência e eficácia da inibição de DIO1. Os itens testados são categorizados em três grupos de eficácia (completo, parcial ou não inibidor) com base na máxima inibição da atividade da DIO1. Inibidores completos são ainda subcategorizados por potência, dependendo de seu IC₅₀ em relação ao item de referência 6-PTU.

Discussão

O ensaio DIO1-SK oferece uma alternativa não radioativa, econômica e escalável aos métodos tradicionais para avaliar a atividade do DIO1, como ensaios radiomarcados ou espectrometria de massa. Sua pré-validação para microsmas hepáticos humanos e forte concordância com as medições SPE-LC-MS/MS dos níveis de hormônio tireoidiano confirmam sua confiabilidade e relevância regulatória, como refletido pela inclusão no plano de trabalho da diretriz de teste da OCDE. A simplicidade da reação Sandell-Kolthoff (SK) torna o ensaio acessível a laboratórios sem instrumentação avançada.

No protocolo atual, vários aspectos práticos foram especificados com mais detalhes em comparação com procedimentos DIO1-SK publicados anteriormente para apoiar ainda mais robustez e reprodutibilidade em um formato rotineiro de 96 poços. Essas clarificações focam na justificativa do conceito de controle (solvente, controles negativo e positivo), na decisão de usar placas de resina de troca iônica recém-preparadas em vez de reutilizar placas previamente moldadas, e nas condições de reação SK que melhoram a robustez do manuseio em medições de placas multipoço, mantendo a interpretação biológica consistente com o trabalho de padronizaçãoanterior 6,7.

Apesar de suas qualidades, várias etapas críticas devem ser abordadas para quantificar com precisão o iodeto liberado durante a conversão mediada por DIO1 de rT3 para T2. Isso é alcançado por meio da reação de Sandell-Kolthoff, que requer tempo preciso e manuseio consistente dos reagentes para garantir a reprodutibilidade. A reação SK é um processo catalítico rápido no qual o iodeto acelera a redução do cério amarelo (IV) para cério incolor (III) pelo arsenito; A taxa de mudança de cor é diretamente proporcional à concentração de iodeto. Como a reação ocorre rapidamente após a adição da solução de arsênico, é essencial que a medição seja iniciada sem demora. Em um formato de placa com 96 poços, a adição lenta ou inconsistente da solução de arsênico pode introduzir variabilidade significativa entre os poços. Portanto, recomenda-se fortemente o uso de uma pipeta multicanal ou de um dispensador automatizado para garantir uma adição uniforme e rápida de reagentes em todos os poços.

Para maximizar a comparabilidade entre poços e entre placas, a ordem de adição de reagentes na reação SK deve ser mantida consistente com o fluxo de trabalho descrito: Cério está presente como substrato cromogênico, e a reação é iniciada pela adição de arsenita, que define o tempo de início e, portanto, requer dispensação rápida e sincronizada. Ordens alternativas de adição de reagentes não foram avaliadas nesse sistema; Portanto, não é recomendado alterar a ordem ao reproduzir o protocolo. Além disso, a concentração de cério pode influenciar as características práticas de desempenho da leitura SK (por exemplo, janela de sinal e robustez). Enquanto 25 mM de cério foi definido como condição padrão validada durante a padronização anterior de ensaios, concentrações mais altas como 40 mM mostraram aumentar a janela de sinal e o fator z′ sem afetar os valores de IC50 ou a interpretação biológica, como já descrito em trabalhosanteriores 6. Neste protocolo, 40 mM de cério é usado para garantir complexação completa e rápida de iodeto sob as condições do ensaio e para melhorar a robustez e a estabilidade do sinal em medições rotineiras baseadas em placas. Os critérios de aceitação (por exemplo, fator z, valoresIC 50 do inibidor de referência) são baseados no desempenho histórico observado em estudos de validação anteriores e são destinados a ser uma verificação rotineira de desempenho do ensaio.

O uso de microrganismos hepáticos humanos introduz variabilidade biológica, tornando essencial a padronização da atividade de liberação de iodeto específica por lote de microssomos. A preparação cuidadosa das placas filtrantes preenchidas com resina de troca iônica é necessária para evitar a distribuição desigual da resina pela placa do filtro e garantir a separação completa do iodeto de substâncias potencialmente interferentes. Com relação ao fluxo de trabalho da resina, placas filtrantes recém-fundidas preenchidas com resina de troca iônica foram escolhidas para minimizar o risco potencial de variabilidade adicional decorrente da saturação de resina, remanescente de iodeto ou proteína, e a possível perda de eficiência de ligação ao reutilizar. A reutilização de resina e placas de filtro é tecnicamente viável, mas pode apresentar alguns riscos que não foram avaliados sistematicamente neste estudo. Pode introduzir deriva de lote para lote se a capacidade de ligação da resina for reduzida ou se componentes residuais da matriz permanecerem na cama de resina após execuções anteriores. Para laboratórios que consideram reciclagem, uma recomendação pragmática é validar o desempenho da resina após o reuso (por exemplo, monitorando o comportamento de fundo e de curvas padrão e garantindo captura consistente de iodeto) e interromper o reuso caso seja observado aumento do fundo de fundo, redução da faixa dinâmica ou separação inconsistente. Recomenda-se utilizar placas filtrantes preenchidas com resina para uso único, pois esse protocolo foi desenvolvido especificamente com base nessa metodologia.

Além disso, a solubilidade de cada item de teste deve ser determinada em um veículo apropriado, pois a concentração máxima testada é limitada pela solubilidade (tipicamente até 1 mM com 1% de DMSO). Como todos os compostos de teste são aplicados no DMSO como solvente, o controle do solvente define a atividade base do DIO1 sob condições relevantes para o ensaio e serve como a condição de referência mais adequada para normalização e comparação. Em contraste, o sal de sódio 1-tio-β-D-glicose foi incluído como controle negativo porque é estruturalmente semelhante à aurothioglicose controle positivo (ATG), mas quimicamente inerte em relação à desiodinação por iodotironina, e não interfere nos sistemas redox microssômicos ou na atividade catalítica da DIO1. Sua inclusão ajuda a distinguir efeitos verdadeiros específicos de DIO1 de efeitos inespecíficos relacionados à adição de compostos, manuseio ou interações com matrizes de ensaio. Um controle sem tratamento/sem veículo não foi usado como condição de referência primária porque não refletiria o ambiente real de ensaio em que o DMSO está presente em todos os poços tratados com composto; portanto, o controle do solvente é a linha de base relevante para a interpretação do ensaio.

A resolução de problemas foca em identificar interferências na reação SK. Substâncias contendo iodo, quelantes ou fortemente oxidantes podem afetar artificialmente a leitura colorimétrica 14,17,18. Para resolver isso, o protocolo inclui testes de interferência sem microssomos. Além disso, o uso do ditiotreitol (DTT) como cofator também pode levar à liberação de iodeto não enzimático de certas substâncias testadas. Nesses casos, métodos ortogonais como SPE-LC-MS/MS são recomendados para confirmar a inibição de DIO1. Interferência não específica via efeitos gerais de desnaturalização (por exemplo, surfactantes) pode gerar falsos positivos, então uma estratégia geral para identificar os que tocam frequentemente, usando ferramentas in silico ou abordagens integradas de teste, pode ser valiosa.

O ensaio possui várias limitações. Ele é suscetível à interferência de substâncias testadas que reagem com componentes do ensaio ou liberam iodeto independentemente da atividade do DIO1. O ensaio não distingue entre inibição específica de DIO1 e interferência inespecífica na função enzimática ou integridade estrutural. Para melhorar a especificidade, a inibição de enzimas microssomais adicionais pode ser analisada em paralelo, e comparar potências inibitórias entre diferentes ensaios enzimáticos pode fornecer mais evidências.

Uma estratégia adicional para identificar possíveis artefatos é incluir testes de integridade ou viabilidade, como comumente realizados em ensaios in vitro baseados em células, para definir a concentração máxima de teste. Embora falte um teste direto de integridade para o ensaio DIO1-SK, seu uso dentro de uma bateria de teste in vitro permite a integração de dados de citotoxicidade de outros ensaios celulares para orientar a seleção de concentração. Se essas informações cruzadas não estiverem disponíveis, a concentração superior no ensaio DIO1-SK é limitada pela solubilidade, que pode não refletir exposições in vivo relevantes. No entanto, abordagens toxicocinéticas podem ser usadas para definir e interpretar melhor as concentrações de testes in vitro.

O ensaio DIO1-SK é particularmente valioso em triagem toxicológica e estudos mecanicistas de perturbação endócrina. Ele aborda um evento chave na homeostase do hormônio tireoidiano e pode ser integrado em baterias de teste in vitro. Sua robustez, reprodutibilidade e adaptabilidade a diferentes ambientes laboratoriais e necessidades de produtividade fazem dela uma ferramenta valiosa para avaliação de segurança química e validação regulatória. O ensaio fornece uma medida robusta in vitro da inibição de DIO1 sob condições padronizadas e apoia a classificação das substâncias testadas em relação a um inibidor de referência bem caracterizado (6-PTU). No entanto, dados in vivo sobre inibição de DIO1 são escassos, e a correlação direta entre os resultados da inibição in vitro e os efeitos in vivo não é atualmente aplicável para estimar a preditividade in vivo. Assim, os resultados do ensaio devem ser interpretados como evidências mecanicistas de interferência em um evento-chave no metabolismo dos hormônios tireoidianos e integrados com linhas adicionais de evidência (por exemplo, outros ensaios de MoA da tireoide e medições ortogonais quando necessário). Importante destacar que o ensaio DIO1–SK foi avaliado em múltiplos estudos orientados à validação (otimização/padronização, avaliação de predividade e análise de robustez/precisão)6,7,15, e à medida que o método avança rumo à implementação pela OCDE, o presente artigo fornece um nível de detalhe procedural passo a passo destinado a facilitar a transferência e a implementação consistente entre outros laboratórios.

Divulgações

Os autores K.S., N.H, D.F.-W. e R.L. são funcionários da BASF SE, uma empresa química, que pode usar o ensaio DIO1 para desenvolver e registrar produtos comerciais no futuro.

Agradecimentos

Os autores querem agradecer ao Dr. Andreas Weber por seu trabalho durante a criação inicial do ensaio DIO1-SK.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-Tio-β-D-glicose sal de sódioSigma-AldrichT6375-1GCAS 10593-29-0
3,3',5'-triiodotironina (rT3) Santa Cruz BiotecnologiaSC-209692CAS 5817-39-0
6-Propoli-2-tiouracila (6PTU)SupelcoP3755-10GCAS 51-52-5
Ácido acéticoThermo Fisher9526-33CAS 64-19-7
Balanço analíticoNANACapaz de pesar com precisão até 30 g com legibilidade de 0,1 mg
Óxido de sódio de arsênico (NaAsO2)Thermo Fisher041533.APCAS 7784-46-5
Placas de ensaio (formato de 96 poços)MerckZ707902-108EApor exemplo, placas de cultura de tecidos, placa de 96 poços, fundo plano, poliestireno, 0,34 cm², estéril, 108/cs, TPP
Aurothioglicose (ATG)Sigma-AldrichA0606-5MGCAS 12192-57-3
Tubos de Centrífuga 15 e 50  mLMerckZ707724-800EA, Z707716-320EApor exemplo, tubos centrífugos TPP, volumes 15 e 50 mL, polipropileno e nbsp;
Centrífuga com rotor oscilante para placas microtituladasNANADeve ser alto o suficiente para caber uma placa de poço de 96 de profundidade com uma placa de filtro de 96 poços no topo (pelo menos cerca de 6 cm de altura).
Sulfato de amônio de cério (IV) (Ce(NH4)4(SO4)4)Sigma-Aldrich22269-100G-FCAS 10378-47-9
Incubadora de CO2NANAcapaz de manter temperaturas de 37°C; C, 5% de CO2 e ≥ 90% de umidade
Placas de poço profundo (formato de 96 poços)Supelco575653-Upor exemplo, SPE 96-Deep Square Square Collection Collection Plate, volume de poço 2 mL, polipropileno
Dimetil sulfóxido (DMSO)AppliChemA3672.0250CAS 67-68-5
Ditiotreitol (DTT)Sigma-AldrichD9779-1GCAS 3483-12-3
Ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) Sigma-AldrichAPO456787707-500GCAS 6381-92-6
Placas de filtro (formato de 96 poços)MerckWHA77002810por exemplo, Micro-Plates, 96-poços, poliestireno transparente, 800 & micro; L, Ligação de DNA, Whatman
Selantes de placas estanques a gasesThermo Fisher232698por exemplo: fita de vedação, poliéster, estéril, fita de vedação, poliéster, estéril, Nunc
HEPESPan BiotechP05-01100CAS 7365-45-9
Microssomos do fígado humanoBiovitX008070por exemplo, INVITROCYP 150 - Microssomos do fígado humano combinados com doadores
Iodeto (padrão de CI)Supelco41271-100MLpor exemplo, padrão de iodeto para CI, 1000 mg/L em água, Sigma-Aldrich
Resina de troca iônica como a Dowex 50WX2Roth334.4CAS 12612-37-2; Mesh 100-200
Tubos de microcentrífuga 1,5  mLMerckEP0030120086-1PAKpor exemplo, Eppendorf & reg; Tubos microcentrífugas Safe-Lock, volume 1,5 mL, naturais
Dispensador multicanal capaz de entregar de 50 a 300 & nbsp; & micro; L por passoNANANA
Pipeta multicanal capaz de entregar de 10 a 100  & micro; L por passoNANANA
Medidor de pH com eletrodo e buffers de calibraçãoNANAcapaz de ler +/- 0,1 unidades de pH
Fotômetro para medição de absorvânciaTecan Trading AGNApor exemplo, Sunrise Absorbance Reader, INSTSUN-3
Pipetas capazes de entregar de 1 a 10  & micro; LNANANA
Pipetas capazes de entregar de 10 a 100  & micro; LNANANA
Pipetas capazes de entregar de 100 a 1000 nbsp; & micro; L NANANA
Pipetas para volumes maioresNANApipetas serológicas, por exemplo, 10, 25, 50 mL
Agitador de placasThermo FisherNApor exemplo, placa de microtitulação Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER, controlada diretamente
Pipeta repetidoraNANANA
Cloreto de sódio (NaCl)Sigma-AldrichS9888-25GCAS: 7647-14-5, por exemplo, cloreto de sódio, reagente ACS, etc; 99.0 %
Software de estatísticaNANACapaz de realizar análises de regressão que refletem características do ensaio e capaz de calcular concentrações inibitórias, por exemplo, GraphPad Prims 8, GraphPad
Ácido sulfúrico (H2SO4) Supelco1007311000CAS 7664-93-9
Frasco volumétricoNANACertificado com volume definido

Referências

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