O Valor Diagnóstico da LINC00426 no Diabetes Tipo 2 e na Doença Renal Diabética e seus Efeitos Regulatórios nas Células Renais

Resumo

A regulação negativa da LINC00426 promove a progressão da doença renal diabética (DKD) ao induzir apoptose nas células renais e aumentar a inflamação.

Resumo

O estudo investiga o valor diagnóstico da LINC00426 no diabetes tipo 2 (DT2) e na doença renal diabética (DKD), juntamente com seus efeitos regulatórios nas células renais. O estudo incluiu 280 pacientes com DMT (146 casos de DKD) e 186 controles saudáveis que visitaram durante o mesmo período. A reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real por transcrição reversa (RT-qPCR) confirmou que a LINC00426 sérica está reduzida em pacientes com DT2DM e DKD. A análise da característica operacional do receptor (ROC) avaliou o valor diagnóstico da LINC00426 para T2DM e DKD. A regressão logística multivariada identificou fatores de risco independentes para DKD. LINC00426 apresentaram valor diagnóstico para ambas as doenças e se correlacionaram negativamente com a razão albumina-creatinina da urina (UACR). Sua redução de regulamentação previu independentemente o desenvolvimento do DKD. Um ambiente de alta glicose (HG) inibe a expressão LINC00426 nas células HK-2 e HGMC. O ensaio CCK8, citometria de fluxo e ensaios imunossorvedores ligados a enzimas confirmaram que a HG também suprimiu a proliferação enquanto promovia apoptose e inflamação. Em contraste, a superexpressão de LINC00426 aumenta a capacidade proliferativa das células HK-2 e HGMC, inibe a apoptose e reduz as respostas inflamatórias. A regulação negativa da LINC00426 pode agravar a progressão da DKD ao inibir a proliferação das células renais (HK-2 e HGMC) e promover a apoptose e respostas inflamatórias.

Introdução

Diabetes mellitus tipo 2 (DT2) é um distúrbio metabólico^{crônico 1}. Relatórios indicam que a DM T2 e suas complicações se tornaram uma preocupação significativa de saúde pública^{global 2,3}, representando ameaças à saúde humana e ao desenvolvimento social. Devido a hábitos de vida pouco saudáveis adquiridos ao^{longo do tempo 4}, a prevalência de DT2 tem aumentado^{anualmente 5}. A nefropatia diabética (DN) foi renomeada para doença renal diabética (DKD) em 2007 ^6,7. Como uma complicação comum do^{DT2DM 8}, sua incidência e mortalidade entre pacientes diabéticos continuam a aumentar^anualmente. A DK frequentemente permanece latente em pacientes com diabetes de longa^{duração ou} se manifesta abruptamente¹¹. A DKD pode causar disfunção renal e danos endoteliais^. A DKD se manifesta principalmente como a perda urinária de grandes moléculas, como proteínas, após danos ao sistema de filtração ^{renal 14}. No entanto, para os pacientes, marcadores bioquímicos sanguíneos (glicose em jejum, insulina) servem como padrão ouro para o diagnóstico do DT2, mas a DKD continua difícil de detectar. Abordagens convencionais de tratamento não identificam ou avaliam prontamente a progressão da^{DKD 15}. Portanto, aumentar a conscientização sobre a doença e identificar novos biomarcadores diagnósticos é crucial para a prevenção e o tratamento tanto do DT2 quanto da DKD.

Nos últimos anos, o envolvimento do RNA longo não codificante (lncRNA) em diversas funções como^imunidade, regulação do câncer e metabolismo tornou-se cada vez mais reconhecido¹⁷. Evidências acumuladas agora implicam expressão desregulada de lncRNA na patogênese de doenças crônicas complexas, notadamente^{DKD 18,19}. Por exemplo, Zhang et ^al.20 identificaram, por meio de sequenciamento de alto rendimento, que o lncRNA evf-2 interage com hnRNP, promovendo o desenvolvimento de DKD ao aumentar a expressão de genes relacionados ao ciclo celular e fatores inflamatórios. Em um modelo de rato DKD, o USR0000B2476D de lncRNA foi identificado como envolvido na regulação^{imune 21}. LINC00426 é um lncRNA recém-descoberto que desempenha um papel importante na regulação dos fatores^{inflamatórios 22}. Estudos comparativos recentes de microarranjos sugerem que LINC00426 pode ter potencial como biomarcador para o desenvolvimento de^{DMT2 23}. Além disso, estratégias de bioinformática capturaram o envolvimento de LINC00426 na regulação imunal dentro do carcinoma de células^{renais 24}. Numerosos estudos também destacaram o envolvimento fundamental da inflamação no diabetes e do^{DKD 25} no diabetes e DKD. Estudos existentes mostraram que o^{DT2DM 26} e condições relacionadas ao^{pré-diabetes 27}, incluindo síndrome metabólica²⁸,^{obesidade 29} e doença cardíaca metabólica^{cardiovascular 30}, estão todas associadas a uma alta carga inflamatória. Além disso, complicações microvasculares diabéticas, como^{neuropatia 31}, nefropatia³² e retinopatia³³, assim como complicações macrovasculares³⁴, são todas respostas inflamatórias crônicas. Portanto, estudar a relação entre LINC00426 e DMT2 e DKD é muito importante para descobrir novos marcadores diagnósticos e revelar os mecanismos da DKD. No entanto, a literatura atual sobre o papel da LINC00426 em TD2M e DKD permanece limitada, sem evidências clínicas que esclareçam seu padrão de expressão, valor de risco independente e eficácia diagnóstica em pacientes com DKD.

Para preencher essa lacuna de pesquisa, o presente estudo incluiu 466 participantes, detectou expressão sérica LINC00426 via RT-qPCR, identificou fatores de risco independentes para DKD usando regressão logística e avaliou ainda mais o potencial diagnóstico de LINC00426 para T2DM e DKD por meio de análise ROC. Nossos achados esclarecem preliminarmente as características de expressão e o significado clínico da LINC00426 na DKD, preenchendo assim a lacuna de conhecimento existente e fornecendo novos insights sobre a patogênese da DKD e a exploração de biomarcadores.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Terceiro Hospital Xiangya da Central South University. Todos os pacientes e suas famílias expressaram apoio e assinaram formulários escritos de consentimento informado.

Coleta de Amostras
O tamanho da amostra foi calculado usando o software G*Power. O nível de significância (α) foi definido em 0,05, o poder estatístico (1-β) em 0,8, o tamanho do efeito (f) em 0,25 e uma taxa de evasão de 10% foi considerada. Os resultados do cálculo indicaram que pelo menos 123 participantes por grupo eram necessários ao estudar as populações do grupo controle, T2DM e DKD. No estudo propriamente dito, 186 participantes foram incluídos no grupo controle, 134 pacientes no grupo com DT2 e 146 no grupo com DKD. Todos foram voluntários que receberam tratamento no Third Xiangya Hospital da Central South University de julho de 2022 a junho de 2023. Desses, 72 pacientes não apresentaram complicações, enquanto 208 pacientes apresentaram uma ou mais complicações. As complicações incluíram principalmente neuropatia diabética, retinopatia diabética e doença renal diabética (DKD), com 146 pacientes diagnosticados com DKD. A classificação do diabetes foi determinada com base na insulina em jejum e nos níveis de glicose no sangue em jejum; Pacientes com diabetes tipo 1 foram excluídos para evitar ambiguidade diagnóstica. Casos de diabetes gestacional e condições especiais do diabetes foram excluídos.

Os critérios de inclusão foram os seguintes: idade ≥ 18 anos; prontuários médicos completos e documentação disponíveis; conformidade com as Diretrizes Chinesas de 2020 para a Prevenção e Tratamento do Diabetes Tipo^{2 37}. Os critérios de exclusão incluíam transtornos psiquiátricos comórbidos, comprometimento cognitivo ou incapacidade de cooperar com o estudo; condições infecciosas agudas; falência de órgãos; e tumores malignos.

Foi selecionado um grupo controle de 186 indivíduos saudáveis que passaram por exames médicos de rotina durante o mesmo período. Os participantes do grupo controle devem atender aos seguintes critérios: não ter histórico de diabetes ou outros distúrbios metabólicos; glicose em jejum normal (<6,1 mmol/L), glicose pós-prandial de 2 horas (<7,8 mmol/L) e hemoglobina glicada (<5,7%); e sem histórico de doença renal ou complicações, com indicadores normais de função renal (taxa de filtração glomerular, razão de albumina urina/creatinina).

Teste de Indicadores Relacionados ao Diabetes
Informações demográficas básicas foram registradas para cada participante do estudo na admissão. Na manhã seguinte, 5 mL de sangue venoso foram coletados de cada sujeito em jejum para testes de indicadores bioquímicos. Os níveis de glicose no sangue em jejum (FBG) foram analisados usando um medidor de glicose^{no sangue 35}. A hemoglobina glicida (HbA1c) foi medida com um analisador totalmente automatizado de HbA1c³⁶. As amostras de urina foram coletadas dentro de 24 horas após a inclusão do estudo. A concentração de albumina urinária foi medida usando um analisador de proteínas³⁷ pelo método imuno-turbidimétrico³⁸. O grau de insuficiência renal em pacientes com DKD foi avaliado pela razão albumina-creatinina urinária (UACR), um índice bem estabelecido para avaliar lesão renal precoce e progressão da doença em^{DKD 3,39}.

Cultura e Processamento Celular
Células epiteliais renais humanas HK-2 e células mesangiais glomerulares HGMC foram adquiridas. Especificamente, as células HK-2 foram cultivadas em meio K-SFM contendo 10% de soro fetal bovino, suplementado com solução antibiótica a 1%. As células HGMC foram cultivadas em meio completo de célula primária. As células foram mantidas em uma incubadora de 37 °C e 5% de CO₂ . A passagem e a transfecção foram realizadas quando a confluência ultrapassou 70%. Para indução de alta glicose (HG), as células foram semeadas em placas de 6 poços e expostas a 30 mM de D-glicose em 2 mL de meio de cultura por poço durante 48 horas (HK-2⁴⁰ e células HGMC⁴¹). Um grupo controle com baixa glicose foi tratado com 5,5 mM de glicose D + 24,5 mM manitol.

A sequência de comprimento total do LINC00426 foi clonada no plasmídeo de expressão eucariótica pcDNA3.1 para construir o plasmídeo de superexpressão LINC00426 pcDNA3.1. O vetor vazio pcDNA3.1 foi usado como controle negativo. A transfecção celular foi realizada usando o reagente Lipofectamina 3000, conforme as instruções do fabricante. Brevemente, células HK-2 e HGMC induzidas por HG foram semeadas em placas de 6 poços e transfectadas em confluência de 70%–80%. Para cada poço, 2,5 μg de DNA plasmídico (pcDNA 3.1 ou pcDNA 3.1 LINC00426) foram misturados com 5 μL do reagente Lipofectamina 3000 em Opti-MEM de 250 μL por 15 minutos em temperatura ambiente, segundo pesquisas^{anteriores 10}. O complexo de transfecção foi então adicionado gota em gota às células em meio de cultivo completo. Após 6 horas de incubação a 37 °C, o meio foi substituído por meio fresco, e as células foram cultivadas por mais 42 horas antes dos experimentos subsequentes.

Extração de RNA Total e Transcrição Reversa
O sangue restante foi centrifugado novamente a 3000 x g por 15 minutos, e o sobrenadante foi coletado e armazenado a -80 °C. O RNA total foi extraído de amostras de soro e células usando o método Trizol-fenol-clorofórmio, precipitado com etanol de volume igual, segundo pesquisas^{anteriores 42}. A concentração e pureza de RNA foram avaliadas usando um espectrofotômetro UV. O cDNA total foi sintetizado a partir de amostras usando a mistura de reagentes RT via um amplificador de PCR gênico. As condições de reação foram de 42 °C por 15 minutos, seguidas de 85 °C por 5 segundos. As amostras foram armazenadas brevemente a 4 °C.

Reação em cadeia quantitativa da polimerase em tempo real por transcrição reversa (RT-qPCR)
O RT-QPCR foi realizado usando mistura master SYBR qPCR. A expressão de LINC00426 sérica foi quantificada pelo instrumento quantitativo de PCR. Os dados foram normalizados usando β-tubulina como gene de referência interno, calculados pelo método 2^−ΔΔCt . O valor médio de Ct da β-tubulina foi de aproximadamente 25, variando de 23 a 27 em todas as amostras de soro. O coeficiente de variação do Ct (CV) foi de 2,5%. A ANOVA unidirecional não mostrou diferença significativa nos valores de β-tubulina Ct entre os grupos controle, T2DM e DKD, confirmando sua expressão estável e adequação como referência interna para a normalização LINC00426 sérica. Os primers envolvidos na reação estão listados na Tabela Suplementar 1. Condições de reação: pré-desnaturação a 95 °C por 10 minutos; 40 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s; extensão final a 60 °C por 15 s.

Análise do Western blot
A análise de Western blot foi realizada seguindo nossos protocolos experimentais estabelecidos. Brevemente, as células foram lisadas com tampão de lise RIPA suplementado com um coquetel inibidor de protease a 1%. Após a incubação em temperatura ambiente por 30 minutos, foi realizada a quantificação da proteína. Amostras de proteína foram desnaturadas a 95 °C, e quantidades iguais de proteína de 30 μg foram separadas por SDS-PAGE, seguidas por eletrotransferência para membranas PVDF de 0,45 μm. As membranas foram bloqueadas com leite desnatado em temperatura ambiente por 2 horas. Os anticorpos primários contra Bax, Bcl-2, Caspase-3, IκBα e p-P65 foram diluídos a 1:1000 com TBST, enquanto β-actina foi diluída a 1:3000. As membranas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 °C. Posteriormente, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de raiz-forte correspondentes em temperatura ambiente por 1 h. As bandas proteicas foram visualizadas usando um substrato ECL em um sistema de imagem em gel. Os valores de cinza da banda foram quantificados com o software ImageJ.

Kit de Contagem de Células-8 (CCK8)
Digere as células transfectadas com 0,25% de tripsina (sem EDTA) por aproximadamente 3 minutos, depois centrifuge a 800 x g por 5 minutos. Recolha o pellet e ressuspenda em meio de cultivo celular. Semeie 100 μL de suspensão de células (2 x 10³ células) em uma placa de 96 poços. Após a incubação por 24 horas a 37 °C com 5% de CO₂ para permitir a adesão celular, adicione 10 μL de solução de CCK8. A adição inicial da solução CCK8 é designada como 0 h. A absorvância em 450 nm é medida usando um leitor de microplacas em 0, 24, 48 e 72 horas.

Citometria de Fluxo
O efeito da transfecção na apoptose celular foi avaliado usando a solução de coloração de isotiocianato de Anexina V-fluoresceína (FITC)/iodeto de propidio (PI). Após a transfecção, as células foram digeridas usando o mesmo procedimento de digestão com tripsina descrito acima. As células foram lavadas com soro tampão fosfatado (PBS) e ressuspensas. Os pellets de células foram coletados por centrifugação a 800 x g por 5 minutos. Transfira 100 μL (aproximadamente 1 x 10⁵ células) para um tubo de citometria de fluxo, centrifuge a 800 x g por 5 minutos em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante. Ressuspender células em um tampão de ligação Annexin V-FITC de 195 μL. Adicione 5 μL de Annexin V-FITC e 10 μL de solução de coloração PI à mistura, depois misture bem. Incube no escuro em temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, coloque o tubo de citometria de fluxo tratado em um banho de gelo para armazenamento temporário. Antes da análise, filtre a suspensão da célula através de um filtro de malha de 200 micrômetros e resuspenda-se. Colete sinais celulares usando o sistema de citometria de fluxo sob excitação a 488 nm/636 nm.

Ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA)
Citocinas inflamatórias celulares foram medidas usando kits ELISA comercialmente disponíveis para fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina-6 (IL-6) IL-1 beta (IL-1β). O procedimento específico de detecção é o seguinte: adicionar 100 μL do padrão devidamente diluído aos poços padrão. Adicione 100 μL de meio basal celular a todos os poços em branco. Adicione 50 μL de sobrenadante celular e 50 μL de 1 x tampão de detecção aos poços de amostra. Subsequentemente, adicione 50 μL da solução de anticorpos de detecção aos poços apropriados. Cubra a microplaca e incube em temperatura ambiente por 2 horas. Descarte o líquido dos poços e lave 6 vezes com o buffer de lavagem. Para obter resultados ideais, certifique-se de que os poços estejam completamente secos. Adicione 100 μL de solução de trabalho de estreptavidina em cada poço novamente, fele a placa e incube em temperatura ambiente por 45 minutos. Por fim, adicione 100 μL de substrato cromogênico e depois incube-os no escuro por 20 minutos. Depois, adicione 100 μL de solução de parada e misture suavemente. A solução agora aparecerá como um líquido claro e amarelado de variada intensidade. Meça a densidade óptica (OD) da solução em 450 nm e 630 nm usando um leitor de microplaca. A diferença entre esses dois valores corresponde à concentração do fator inflamatório na amostra.

Análise estatística
Os dados foram processados e analisados usando software estatístico comercialmente disponível. Todos os resultados experimentais compreenderam três réplicas válidas. Comparações entre grupos utilizaram testes t de amostras independentes e análise de variância (ANOVA). Comparações múltiplas foram realizadas usando o método de Tukey. A curva ROC foi usada para avaliar o valor diagnóstico da LINC00426 para DT2DM e DKD. A análise de regressão logística avaliou os fatores de risco para DKD. P < 0,05 indicaram significância estatística para os respectivos resultados de dados.

Resultados

Comparação das características basais entre indivíduos saudáveis e pacientes com diabetes tipo 2
O estudo incluiu 280 pacientes com DM 2 e 186 indivíduos saudáveis como controles. A análise dos prontuários médicos dos participantes (ver Tabela 1) revelou que a idade média do grupo controle foi de 58,91 ± 17,63 anos, em comparação com 59,50 ± 17,14 anos para os pacientes com DM T2. No entanto, não houve diferenças significativas de gênero ou obesidade ...

Discussão

A DKD representa uma complicação microvascular grave no DT2. Sua manifestação mais antiga é a presença de microalbuminúria; detectar isso nos estágios iniciais poderia potencialmente atrasar a progressão do DKD. No entanto, a microalbuminúria carece de sensibilidade na análise de urina de rotina e, consequentemente, é frequentemente^{negligenciada.} Este estudo constatou que LINC00426 é reduzida em pacientes com DT2 e possui valor diagnóstico tanto para DMO2 quanto p...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0.25% trypsin	Gibco	25200056
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit	Beyotime	C1062S
Antibiotics for cell culture	Gibco	R-015-10
Aristo specific protein detector	GOLDSITE	GPP-100
Bax Antibody	Cell signaling Technology	2772
BCA protein assay kit	Beyotime	P0013B
Bcl-2 (124) Mouse Monoclonal Antibody	Cell signaling Technology	15071
beta-Actin (13E5) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell signaling Technology	4970
Blood glucose monitor	Yuwell	710
Caspase-3 Antibody	Cell signaling Technology	9662
CCK-8 reagent	Sigma	96992
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Clarity Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
Constant-temperature cell incubator	SaiLun	DHP-9032
D-Glucose	MedChemExpress	HY-B0389
Flow cytometer	Beckman coulted	CytoFLEX	Chloroform
Fluorescent quantitative PCR instrument	Roche	Light Cycler 96
Foetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F0193
Fully automated glycated haemoglobin analyser	Hanyu medical	HLC-723G11	Phenol
Gene PCR amplifier	Bio Rad	S1000
Glomerular mesangial cells, HGMC	Sunncell Biotechnology Co., Ltd.	SNP-H252
Human Basic IL-1 beta ELISA Kit	Invitrogen	ECH002
Human IL-6 ELISA Kit	Invitrogen	EH2IL6
Human kidney epithelial cells, HK-2	Sunncell Biotechnology Co., Ltd.	SNL-165
Human TNF alpha ELISA Kit	Invitrogen	KAC1751
IkappaB alpha (L35A5) Mouse Monoclonal Antibody	Cell signaling Technology	4814
K-SFM medium	Invitrogen	17005-042
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015
Mannitol	Sigma-Aldrich	M9647
Multifunctional enzyme-linked immunosorbent assay reader	TECAN	GENios Plus
NF-kappaB p65 (D14E12) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell signaling Technology	8242
non-fat milk	Biosharp	BS102-500g
Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium	Invitrogen	31985062
P3000 Reagent	Invitrogen	L3000-015
PBS buffer	Sangon Biotech	E607080
Phenol	Sigma-Aldrich	P1037
Phospho-NF-kappaB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell signaling Technology	3033
Primary cell complete medium	Sunncell Biotechnology Co., Ltd.	SNPM-H252
Prime Script RT reagent Kit	Takara	RR037A
PVDF membranes	Merck Millipore	SE1M003M00
rotease and phosphatase inhibitor cocktail	Beyotime	P1045
Trizol	Invitrogen	15596026CN
Ultraviolet spectrophotometer	Thermo	Nanodrop 2000