Artigo de método

Isolamento e Identificação de Células Sinovais Primárias Semelhantes a Fibroblastos de Pacientes com Artrite Reumatoide

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DOI:

10.3791/70116

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24 de fevereiro de 2026

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1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o método para isolar e identificar sinoviócitos primários fibroblastos (FLS) de alta pureza do tecido sinovial de pacientes com artrite reumatoide para modelagem confiável da doença e triagem de medicamentos.

Resumo

A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória autoimune crônica caracterizada por hiperplasia sinovial e destruição progressiva das articulações como sua principal característica patológica. Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLS) são reconhecidos como componentes celulares fundamentais na patogênese da AR, caracterizados por seu comportamento agressivo e tumoral, que media a destruição de cartilagem e osso. O isolamento e a purificação dos sinócitos semelhantes a fibroblastos da artrite reumatoide (RA-FLS) é uma ferramenta fundamental para investigar os mecanismos da doença e avaliar potenciais medicamentos terapêuticos. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para isolar, cultivar e validar funcionalmente a RA-FLS primária humana a partir de amostras de tecido sinovial ressecadas obtidas durante cirurgias de substituição de joelho em pacientes com AR. Esse método utiliza tecido sinovial fresco e emprega um processo sequencial de digestão enzimática com tripsina e colagênase tipo II para maximizar o isolamento da RA-FLS da matriz tecidual. Por fim, a identificação celular é alcançada por imunofluorescência de Vimentina e citometria de fluxo, complementada pela avaliação funcional da proliferação induzida por TNF-α. Esse protocolo permite a aquisição de culturas de RA-FLS de alta pureza com características fenotípicas específicas e resposta inflamatória, fornecendo aos pesquisadores um método confiável para obter RA-FLS de curto período, cultivadas e derivadas do paciente, adequadas para triagem de medicamentos, estudos mecanicistas e aplicações de engenharia de tecidos.

Introdução

A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória autoimune crônica caracterizada por poliartrite simétrica das articulações periféricas, com prevalência global estimada de 0,5%-1% e potencial para induzir várias complicações sistêmicas eextraarticulares 1,2,3,4,5. A característica patológica central da AR é a sinovite crônica mediada por respostas autoimunes, que ainda leva à formação de tecido pano invasivo que erode a cartilagem articular e o ossosubcondral 6,7. Entre elas, a sinovite representa a marca patológica mais antiga e central da AR. Sinoviócitos semelhantes a fibroblastos (FLS), que residem como as células residentes predominantes do sinovio, são fundamentais para orquestrar tanto a inflamação sinovial quanto a destruiçãoóssea 8,9. Durante a resposta inflamatória sinovial na AR, os sinoiócitos semelhantes a fibroblastos da artrite reumatoide (RA-FLS) perdem seu fenótipo "regulador" normal e, em vez disso, apresentam um perfil "pró-inflamatório" 10. Essa mudança leva à produção massiva de citocinas inflamatórias, que podem ativar vias metabólicas energéticas relacionadas, levando ao aumento da proliferação celular e amplificando ainda mais a cascata inflamatóriasinovial 11,12,13. Simultaneamente, a RA-FLS interage com outras células imunes (como macrófagos, células T e células B) para manter um estado inflamatório crônicopersistente 14,15. Além disso, os RA-FLS apresentam características semelhantes às cancerígenas, incluindo capacidade migratória aumentada, invasividade, proliferação descontrolada e resistência à apoptose, e estão ativamente envolvidos nos processos de erosão de cartilageme osso 16.

Nos últimos anos, as FLS têm sido amplamente utilizadas como modelos in vitro para estudar doenças inflamatórias articulares, como AR, tendência impulsionada em parte pelas limitações das farmacoterapias de primeira linhaatuais 17,18,19. Eles são empregados em culturas 2D, modelos 3D e sistemas organ-on-a-chip para investigar mecanismos de doenças, validar alvos terapêuticos e conduzir triagens dedrogas 20,21,22,23. Além disso, os RAFLS servem como base para aplicações avançadas, incluindo organoides sinoviais derivados de pacientes para prever a resposta dos DMARDs; edição genética via CRISPR/Cas9 para estudar a função gênica na progressão da AR; e como fonte celular para engenharia de enxertos funcionais de tecidosinovial 24,25,26.

Obter RA-FLS cultivado de curto prazo do tecido sinovial de pacientes com artrite reumatoide serve como o passo inicial para muitos experimentos. Comparadas às linhas celulares de FLS, as RA-FLS cultivadas de curto prazo e derivadas pelo paciente mantêm heterogeneidade entre pacientes e características específicas da doença, permitindo uma representação mais autêntica dos fatores transcricionais relacionados à doença e das diferenças regulatórias das vias. Consequentemente, o rendimento celular, a taxa de crescimento e o desempenho funcional podem ser influenciados por fatores específicos do paciente, como idade, duração da doença, histórico de medicação e atividade da doença, levando a um certo grau de variabilidade entre lotes. Portanto, os pesquisadores devem avaliar o histórico clínico da fonte de tecido antes do uso e realizar experimentos nas passagens iniciais (P3-P7) para manter a estabilidade fenotípica das células.

Este estudo detalha um protocolo simplificado para extração e identificação de RA-FLS do tecido sinovial do joelho. O método emprega digestão enzimática sequencial (tripsina seguida pela colagânase tipo II) combinada com dissociação mecânica suave. Evidências sugerem que tais estratégias enzimáticas otimizadas e em múltiplas etapas geralmente superam tratamentos com enzima única ou não sequenciais com enzimas mistas, o que pode comprometer a viabilidade celular e o fenótipo 27,28,29,30. Em comparação, o protocolo apresentado permite um isolamento mais eficiente e suave de RA-FLS de alta viabilidade e alta pureza, minimizando danos celulares e perda fenotípica para garantir adequação para ensaios funcionais posteriores.

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Protocolo

Este estudo coletou tecido sinovial de pacientes com artrite reumatoide submetidos a cirurgia de substituição articular no Hospital China-Japão Friendship. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito antes da cirurgia. As informações coletadas e as amostras biológicas foram tratadas com medidas rigorosas para garantir a privacidade dos pacientes e a segurança dos dados. Quaisquer amostras remanescentes de tecido sinovial foram descartadas de acordo com as normas de biossegurança. O uso de tecido sinovial da articulação do joelho de pacientes com artrite reumatoide neste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital da Amizade China-Japão (Aprovação nº: 2025-KY-223). Os reagentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Aquisição e preparação de tecido sinovial

NOTA: Coloque o tecido sinovial obtido durante a cirurgia em um recipiente estéril preenchido com solução salina a 0,9% ou PBS para evitar contaminação durante a transferência da sala de cirurgia para o gabinete de biossegurança. Use a imersão em etanol seguida de lavagem com uma solução de penicilina e estreptomicina como etapas críticas para prevenir contaminação bacteriana ou fúngica, garantindo o sucesso dos experimentos subsequentes.

  1. Imerga tecido sinovial fresco em um tubo centrífugo de 50 mL contendo PBS e transfira-o para um gabinete de biossegurança.
  2. Transfira o tecido sinovial para uma placa de Petri contendo 75% de etanol e imerga por 30 segundos para desinfecção.
  3. Remova o tecido gorduroso e ósseo do tecido sinovial usando tesouras cirúrgicas estéreis e pinças, e então transfira o tecido restante para uma nova placa de cultura.
  4. Lave o tecido sinovial obtido 3 vezes com PBS contendo 10% de penicilina/estreptomicina.

2. Digestão do tecido sinovial

NOTA: Use tripsina para interromper as junções celulares e a matriz extracelular dentro do tecido sinovial para isolamento subsequente. Aplique colagênase tipo II para degradar seletivamente a estrutura da matriz extracelular, facilitando a dissociação celular da matriz. Esterilize todas as tesouras cirúrgicas, pinças e peneiras celulares necessárias para a dissecação do tecido sinovial por autoclave antes do uso. Após a digestão, os fragmentos de tecido devem parecer soltos, com bordas desfiadas, e o meio pode ficar levemente turvo. O tecido não digerido permanecerá compacto e opaco.

  1. Triture o tecido repetidamente com tesoura até formar fragmentos de 1 mm × 1 mm.
  2. Adicione 0,25% de tripsina ao tecido e digiria a 37 °C em um shaker de temperatura constante (a 100-150 rpm) ou em uma incubadora celular por 30 minutos.
  3. Prepare uma solução de soro bovino fetal (FBS) a 10% usando Soro Salino Tamponado com Fosfato (PBS).
  4. Transfira o tecido para tubos centrífugos de 15 mL ou 50 mL de acordo com a quantidade de tecido, e neutralize e digere com PBS contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
  5. Centrífuga (4 °C, 500 × g, 5 min), então descarte o sobrenadante e retenha a bola.
  6. Ressuspenda o pellet no PBS.
  7. Centrífuga (4 °C, 500 × g, 5 min), depois descarte o sobrenadante e retenha o pellet.
  8. Adicione 100 mg de colagenase tipo II a 50 mL de meio DMEM para preparar uma solução de colagênase tipo II de 2 mg/mL.
  9. Filtre a solução preparada de colagênase tipo II através de uma membrana de 0,22 μm para esterilização.
  10. Adicione 2 mg/mL de colagênase tipo II e digiria em um shaker de temperatura constante a 37 °C (a 100-150 rpm) ou incubadora celular por 4 horas.

3. Isolamento e cultura de sinoviócitos semelhantes a fibroblastos

NOTA: Realize todos os procedimentos de cultura celular em um gabinete de biossegurança sob condições estéreis e use luvas estéreis para evitar contaminação.

  1. Prepare o meio DMEM completo suplementando o meio basal DMEM com 10% de soro bovino fetal, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina.
  2. Coloque um penador de células de 100 malhas sobre uma placa de Petri estéril e despeje o tecido sinovial e o fluido digeridos sobre o peneirador.
  3. Transfira o penador celular com tecido residual para outra placa de Petri estéril.
  4. Moa o tecido restante no peneiro usando a ponta de uma haste estéril de êmbolo de seringa de 20 mL até que restem apenas restos brancos e fibrosos, e nenhuma suspensão celular adicional possa ser expressa.
  5. Enxágue o escorredor com um volume apropriado de meio DMEM completo.
  6. Recolha todos os filtrados, centrifuge (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
  7. Ressuspenda o pellet em PBS, centrifuge (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
  8. Resuspenda as células em meio DMEM completo.
  9. Realize a contagem celular e transfira as células para um frasco de cultura.
  10. Incube o frasco em uma incubadora de culturas celulares (37 °C, 5% CO₂).
  11. Troque o médio após 48 horas.
  12. Digere as células com tripsina e passagem em uma proporção de 1:3 quando atingirem a confluência total.

4. Identificar RA-FLS usando coloração por imunofluorescência de vimentina

NOTA: Pré-aqueça a solução de PBS usada para lavagem de células em banho-maria ajustada a 37 °C. Todos os volumes de reagentes especificados nesta seção são padronizados para um formato de placa de 48 poços. Os volumes devem ser escalados proporcionalmente com base na área de crescimento ao usar placas de formato diferente.

  1. Digere as células com tripsina, ressuspenda as células colhidas e dilua para 1 × 104 células/L usando meio DMEM completo.
  2. Semeie RA-FLS em uma placa de 48 poços a 200 μL por poço.
  3. Coloque em uma incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO₂) e incube por 24 horas.
  4. Descarte o meio e lave as células três vezes com PBS pré-aquecido.
  5. Adicione 4% de paraformaldeído para fixar as células por 10 minutos, descarte o fixador e lave três vezes com PBS.
  6. Prepare 150 μL de solução 0,1% de Triton X-100 em PBS por poço. Garanta a mistura completa por meio de vórtice ou inversão suave antes do uso.
  7. Adicione solução 0,1% de Triton X-100 aos poços e incube por 10 minutos para permeabilizar as células.
  8. Descarte a solução 0,1% do Triton X-100 e lave três vezes com PBS.
  9. Adicione 150 μL de solução bloqueadora livre de animais por poço, incube em temperatura ambiente por 1 hora.
  10. Descarte a solução de bloqueio. Adicione 150 μL de solução primária de trabalho de anticorpos vimentina (diluída 1:200 em diluente de anticorpos) em cada poço.
  11. Incubar com anticorpos primários a 4 °C durante a noite.
  12. Descarte o anticorpo primário e lave as células cinco vezes com PBS.
  13. Adicione 150 μL de anticorpo secundário IgG anti-coelho conjugado Alexa Fluor 488 (diluído 1:50 em diluente universal de anticorpos) por poço e incube a 37 °C por 1 hora protegido da luz.
  14. Descarte o anticorpo secundário e lave as células três vezes com PBS.
  15. Adicione uma gota de meio de montagem antidesvanecimento contendo DAPI por poço e deixe secar por 10 minutos no escuro.
  16. Observe e capture imagens usando um microscópio de fluorescência invertida equipado com um objetivo de 20× e conjuntos de filtros apropriados para DAPI e FITC/GFP.
    NOTA: Lave as células com PBS enchendo completamente os poços com PBS, incubando por 5 minutos e depois removendo o PBS. Esse procedimento constitui um ciclo de lavagem.

5. Quantificar RA-FLS e avaliar a pureza usando citometria de fluxo

NOTA: Use Vimentina e CD90 como marcadores positivos para identificar RA-FLS, enquanto aplicam CD68, CD14 e CD11b como controles negativos para excluir contaminação por células imunológicas. A vimentina atua como uma proteína intermediária de filamento específica intracelular, predominantemente localizada no citoplasma da RA-FLS. O CD90 funciona como um marcador crítico de superfície altamente expresso na RA-FLS, permitindo sua distinção das células imunológicas. Embora CD68, CD14 e CD11b sejam expressos especificamente em macrófagos, monócitos e células mieloides, eles são empregados como marcadores negativos para excluir a contaminação por células imunológicas. Atribua fluorocromos aos marcadores da superfície celular com base na especificidade de ligação e garanta que não haja sobreposição nos canais de fluorescência. Por exemplo, neste experimento, CD90 e CD68 compartilham o mesmo fluorocromo; portanto, não as adicione ao mesmo tubo da centrífuga. Antes de incubar com anticorpos vimentina, adicione agentes fixadores e permeabilizantes para romper a membrana celular. Se o citômetro de fluxo tiver canais fluorescentes suficientes, marcadores como CD90 e CD68 podem ser atribuídos a diferentes canais para análise simultânea multicolorida, a fim de melhorar ainda mais a eficiência da detecção e o conteúdo de informações.

  1. Digerir RA-FLS de terceira geração usando tripsina livre de EDTA.
  2. Termine a digestão com meio DMEM completo, centrífuga (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
  3. Ressuspenda o pellet no PBS, realize a contagem celular e ajuste a concentração celular para 1 × 10⁶ células/mL usando PBS.
  4. Distribua as células em três tubos centrífugas, adicionando 200 μL de suspensão de célula a cada tubo.
  5. Adicione o anticorpo CD11b (diluído 1:100 em diluente universal de anticorpos) em volume final de 100 μL no tubo 1. Vórtice para misturar.
    1. Após 15 minutos de incubação, adicione 1 mL de agente de fixação/permeabilização ao Tubo 1, vórtice para misturar e incube por 30 minutos protegido da luz.
    2. Adicione 1 mL de buffer de fixação/permeabilidade ao Tubo 1 para terminar a permeabilização, vórtice para misturar, centrífuga (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
    3. Prepare 100 μL de vimentina e coquetel de anticorpos CD68 (cada um diluído 1:100 em diluente universal de anticorpos), adicione ao tubo 1, faça vórtice para misturar e incube protegido da luz por 30 minutos.
    4. Adicione 1 mL de buffer de fixação/permeabilização ao Tubo 1, vórtice para misturar, centrífuga (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
    5. Adicione 100 μL de anticorpo secundário IgG anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 488 (diluído 1:50 em diluente universal de anticorpos) ao Tubo 1. Vórtice para misturar e incubar protegido da luz por 30 minutos.
    6. Adicione 1 mL de buffer ao Tubo 1, o vórtice para misturar, centrifuge (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
    7. Adicione 300 μL de buffer ao Tubo 1 e vórtice para misturar para a amostra de carga.
  6. Adicione os anticorpos CD90 e CD14 (cada um diluído 1:100 em diluente universal de anticorpos) ao Tubo 2 até um volume final de 100 μL. Deixe o Tubo 3 sem anticorpos como controle negativo.
    1. Após 15 minutos de incubação, adicione 1 mL de PBS aos tubos 2 e 3.
    2. Os tubos centrífugos 2 e 3 (4 °C, 500 × g, 5 min) descartam o sobrenadante, adicionam 300 μL de buffer e fazem vórtice para misturar para a amostra de carga.
  7. Realize a aquisição por citometria de fluxo das amostras preparadas.
  8. Analise os dados da citometria de fluxo e realize estatísticas usando software compatível.

6. Medição da proliferação de RA-FLS induzida por TNF-α usando o ensaio MTS

  1. Digerir RA-FLS de terceira geração usando tripsina livre de EDTA.
  2. Termine a digestão com meio DMEM completo, centrífuga (4 °C, 500 × g, 5 min) e descarte o sobrenadante.
  3. Resuspenda o pellet em meio DMEM completo, realize a contagem de células e dilua para 1 × 10⁵ células/L.
  4. Semeie as células ressuspensas em uma placa de 96 poços a 100 μL por poço.
  5. Incube a placa em uma incubadora de cultura celular até que ocorra adesão celular, depois divida-se em grupos de controle e intervenção em branco.
  6. Adicione 10 ng/mL de TNF-α ao grupo de intervenção e um volume igual de PBS ao grupo controle em branco.
  7. Após 24 horas de intervenção, adicione 10 μL de reagente MTS a cada poço e continue a incubação na incubadora de culturas celulares.
  8. Após 1 hora de incubação, meça a absorvância (OD) a 490 nm usando um leitor de microplacas.
  9. Calcule a viabilidade da proliferação celular com base no valor OD de cada poço.

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Resultados

Usando o protocolo, isolamos com sucesso RA-FLS de curto período e de curto período derivados do paciente. Um diagrama esquemático do fluxo de trabalho procedural é fornecido (Figura 1). Na microscopia óptica, o RA-FLS exibiu um fenótipo morfológico predominante de células poligonais em formato de fuso e irregulares. As células apresentaram extensa disseminação citoplasmática com processos alongados. As bordas celulares apareceram ligeiramente indistintas em...

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Discussão

Esse protocolo estabelece um método reprodutível para o isolamento e cultura de curto prazo da RA-FLS em pacientes com AR, com seu sucesso evidenciado por alta viabilidade celular, fenótipo característico, expressão de marcadores específicos e resposta funcional a estímulos inflamatórios.

Passos críticos e considerações técnicas
A confiabilidade desse método depende de várias etapas críticas. Primeiro, o tecido sinovial fresco deve ser subm...

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Divulgações

Os autores não relatam conflitos de interesse neste trabalho e confirmam que o uso do Figdraw para gerar a Figura 1 segue os termos de licenciamento da plataforma.

Agradecimentos

Esse trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nºs 82074223 e 8207141673) e pelo projeto-chave no nível do governo central: O estabelecimento de uso sustentável para recursos valiosos da medicina chinesa (nº 2060302).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 488-conjugado anti-rabbit IgGBiotecnologia Zhongshan JingqiaoZF-0511
0,25% Tripsina-EDTA (1X)Gibco25200-072
4% de paraformaldeídoSolarbioP1110
Alexa Flour674 anti-humano CD68Biolegenda562111
Solução de Bloqueio Livre de AnimaisTecnologia de Sinalização Celular15019
APC anti-humano CD90Biolegenda559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD em Biociências657925
BD LSRFortessaBD em Biociências647177
BV605 anti-humano CD11bBidegend563015
Ensaio de Proliferação Celular (MTS) de Solução Única CellTiter 96PromegaG358A
Colanase IISolarbioC8150
Meio de Montagem Fluorescente contendo DAPIBiotecnologia Zhongshan JingqiaoZLI-9556
Meio de Montagem Fluorescente contendo DAPIBiotecnologia Zhongshan JingqiaoZLI-9556
Médio Eagle Modificado (DMEM) da Dulbecco, Glicose AltaHyCloneSH30022.01
Soro fetal bovino - Superfino (FBS)Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.ZQ0500
FITC anti-humano CD14Biolegenda325604
PBS, 1 e horários; (pH 7,4) Soro Tamponado de FosfatoServicebioG4202
Solução Mistura de Penicilina e Estreptomicina (Antibióticos Duplos) 100 e 10 vezes;Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.CSP006
QuickBlock Universal Proteico e Buffer de Diluição de AnticorposBeyotimeP0270-500ml
TNF-& alfa humano recombinante;Peprotech300-01A
Buffe de Coloração por Fator de TranscriçãoeBiociência00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
Solução de Tripsina (Livre de EDTA)Beijing Labgic Technology Co., Ltd.BL526A

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