Artigo de revisão

Métodos para Elucidar Mecanismos de Doenças em Transtornos do Neurodesenvolvimento

DOI:

10.3791/70127

⸱

6 de fevereiro de 2026

 , 
1Department of Neurology, University of Maryland School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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As opções de tratamento modificadoras da doença para pessoas que vivem com transtornos do neurodesenvolvimento são limitadas e não há curas. Para lidar com isso, são necessários esforços para definir mecanismos da doença e novos alvos terapêuticos. Nesta revisão, detalhamos várias técnicas que estão liderando o caminho nesses esforços.

Resumo

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Os transtornos do neurodesenvolvimento (NDDs) afetam 317 milhões de crianças e jovens em todo o mundo. Embora os NDDs sejam um grupo diversificado de transtornos que afetam múltiplos sistemas de órgãos, epilepsia, transtorno do espectro autista (TEA) e/ou deficiência intelectual (DI) são desfechos comuns. Infelizmente, existem poucas terapias modificadoras da doença e nenhuma cura para as NDDs. Recentemente, porém, edição genética, ensaios celulares/moleculares e modelos de células-tronco surgiram como técnicas promissoras para compreender profundamente as causas profundas da NDD, categorizar variantes genéticas e modelar com mais precisão os processos humanos da doença. Além disso, várias técnicas, especialmente a edição genética, já tiveram sucesso clínico. Nesta revisão, detalhamos vários métodos inovadores para validar funcionalmente variantes genéticas, modelos de células-tronco de NDDs e abordagens inovadoras de edição gênica. Compreender e aplicar esses métodos é crucial para descobrir novos mecanismos de doenças e alvos terapêuticos para NDDs, bem como para avançar abordagens técnicas do laboratório para a clínica.

Introdução

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Os transtornos do neurodesenvolvimento (NDDs) afetam 317 milhões de crianças e jovens no mundo1. Esses distúrbios podem incluir paralisia cerebral, síndrome do X frágil, síndrome de Angelman e complexo de esclerose tuberosa, entre muitos outros. Embora os NDDs sejam um grupo diversificado de distúrbios que afetam múltiplos sistemas de órgãos, epilepsia, transtorno do espectro autista (TEA) e/ou deficiência intelectual (DI) são desfechosfrequentes 2. De fato, um estudo relatou que crianças no Quênia com epilepsia e deficiências cognitivas, de visão, audição ou motrices morreram a uma taxa de 3 a 4 vezes maior que aquelasdo grupo 1 sem NDD.

Uma mudança de paradigma para o estudo das NDDs ocorreu com a conclusão do Projeto Genoma Humano em 2003. Avanços adicionais foram feitos ao definir as pontuações de risco poligênico por meio do GWAS, e a caracterização dos "distúrbios neurodesenvolvimentais" pelo DSM-5 em 20134. Embora haja avanços significativos na compreensão das causas genéticas das NDDs, existem poucas terapias direcionadas para NDDs específicos, e não existem terapias modificadoras da doença para o TEA e/ou DI associadas a elas.

Os ensaios e métodos de edição genética, eletrofisiológico e celular/molecular descritos nesta revisão estão na vanguarda da pesquisa em NDD. Embora não tenhamos coberto exaustivamente todos os ensaios, esses métodos representam abordagens inovadoras para identificar terapias modificadoras da doença. Um exemplo, enzimas deubiquitilantes (DUBs), é um grupo de enzimas que removem ubiquitina de proteínas. Como mutações dentro dos DUBs estão ligadas a NDDs, direcionar sua modificação pode ser uma terapia potencial para NDDs 5,6. Além disso, vias em nível de circuito, como aquelas envolvendo a subunidade receptorGABA A, e outras canalopatias estão sendo investigadas para definir mecanismos de doença associados à epilepsia, TEA eDI 7. Outro método relevante, a edição genômica CRISPR/Cas (Figura 1), é uma ferramenta poderosa usada para alterar diretamente o genoma, criar novos modelos experimentais e, recentemente, tratar doenças genéticasraras 8,9,10. O kit de ferramentas CRISPR continua a se expandir, e quatro abordagens, incluindo CRISPRi (Interferência/Inibição CRISPR), CRISPRa (Ativação CRISPR), edição principal e edição base, emergiram como inovações de pesquisa e clínicas impactantes. Por fim, este artigo detalha avanços no uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs, e suas derivações celulares, permitiram aos pesquisadores modelar com mais precisão muitas NDDs usando células derivadas depacientes 9,11,12. Importante, o desenvolvimento de organoides a partir de iPSCs possibilitou o estudo do processo de desenvolvimento que está na base de muitos NDDs de uma forma muito mais relevante para doenças humanas do que os modelosde roedores 13,14.

Esta breve análise detalha e expande as técnicas apresentadas acima. Além disso, vários estudos recentes que utilizam essas técnicas para obter maiores insights sobre NDDs, lacunas na literatura atual e direções futuras são discutidos.

Revisão e perspetiva

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Células-tronco pluripotentes induzidas e paradigmas experimentais associados

Células-tronco pluripotentes induzidas surgiram como um sistema poderoso para modelar NDDs. De fato, muitos processos de desenvolvimento ocorrem em modelos iPSC que são semelhantes aos observados durante o desenvolvimento cerebral humano e que não ocorrem durante o desenvolvimento cerebral emroedores 15. Portanto, os pesquisadores acoplaram modelos de células-tronco, incluindo culturas 2D, organoides e assembloides, a outros métodos experimentais para melhor compreender os mecanismos da doença nosNDDs 11, 13, 14, 16.

Recentemente, assembloides foram usados para modelar uma característica chave da neurogênese comprometida da síndrome de Down (DS) durante o desenvolvimentofetal 16. Utilizando tanto hiPSCs de DS quanto hiPSCs euploides isogênicos, a neurogênese foi induzida, seguida pela diferenciação em neurônios. Após 85 dias, imunocitoquímica e imagens foram usadas para observar o ciclo celular. Eles observaram que as células progenitoras neurais da DS não saíam do ciclo celular e não conseguiam se diferenciar em neurônios maduros, além de constatar que defeitos do ciclo celular alteram a fase neurogênica, causando neurogênese comprometida na DS16.

Enquanto muitos modelos de células-tronco focaram em neurônios, outros tipos celulares, incluindo células gliais, desempenham um papel importante na patologia daNDD 17. Um relatório recente focou no papel da gliogênese e dos astrócitos na síndrome do X Frágil (SFF). Usando hiPSCs, células progenitoras de astrócitos foram cultivadas e diferenciadas em astrócitos específicos do cérebro anterior, que não possuíam a proteína ribonuclear mensageira do Xfrágil 11. Eles observaram que esses astrócitos apresentavam metabolismo glicolítico e mitocondrial desregulado. Trabalhos anteriores da mesma equipe também demonstraram que a função adequada das mitocôndrias é necessária para controlar o disparo do potencial de ação em neurônios derivados de pacientes comFXS 11,18. Embora ainda haja mais trabalho necessário para entender o mecanismo pelo qual o metabolismo dos astrócitos e a disparação dos neurônios são alterados na FXS, esses estudos demonstram que os astrócitos podem tanto impulsionar a patologia da doença quanto ser um alvo terapêutico.

Edição do genoma

Francisco Mojica lançou as bases para a edição do genoma com a descoberta do CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), um sistema imunológico adaptativo para procariotos, no início dos anos1990. Com base nisso, Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier foram pioneiras em um método chamado CRISPR/Cas9 que utiliza o CRISPR acoplado à endonuclease Cas9 para isolar e alterar seletivamentegenes 20. Pouco tempo após a publicação dos estudos iniciais de edição genética CRISPR/Cas9, os pesquisadores começaram a manipular o sistema CRISPR/Cas para revelar informações genômicas novas ou editar genes de maneira única. Um método inovador é o CRISPRi – uma forma de silenciar um gene deinteresse 21,22. Ao usar uma nuclease Cas9 catalisticamente inativa em conjunto com cr- e tracr-RNAs, o acesso da RNA polimerase ao promotor é obstruído, desligando a expressão gênica de um gene específico ou conjunto degenes 22,23. As triagens CRISPRi têm sido usadas para identificar vários genes de risco para NDDs, bem como identificar as alterações funcionais associadas à perda de função nesses genes. Por exemplo, uma triagem recente do CRISPRi em assembloides derivados de iPSC testou 425 genes NDD quanto ao seu impacto no desenvolvimento interneurônio e revelou que a perda de vários genes candidatos impactou a estrutura do retículo citoesquelético eendoplasmático 24. Além disso, uma triagem CRISPRi revelou que a perda de ADNP, um gene de risco para TEA, resultou em alterações na poda microglial dassinapses 25. Assim, as triagens CRISPRi revelaram vários mecanismos convergentes e divergentes de doenças na NDD.

Complementar ao CRISPRi, o CRISPRa é uma ferramenta usada para aumentar a expressão gênica. Essa técnica acopla um Cas9 cataliticamente inativo a ativadores transcricionais e é direcionada por um RNA-guia. O CRISPRa também foi utilizado para entender como a ativação dos genes de TEA e de risco de NDD pode alterar fenótipos de doenças. Embora existam poucos estudos usando CRISPRa para resgatar fenótipos de NDD, o CRISPRa pode ter grande potencial terapêutico. Por exemplo, um estudo recente demonstrou que a ativação do ITGB3 (cuja haploinsuficiência está associada ao TEA) resgatou a função da rede e os fenótipos do TEA emroedores 23. De fato, muitas variantes do gene NDD causam doença devido à haploinsuficiência, levantando a possibilidade de que o CRISPRa possa ser usado para aumentar a expressão do alelo não afetado de forma modificadora da doença.

A edição de bases e a edição prime são métodos precisos dentro da caixa de ferramentas CRISPR para editar nucleotídeos específicos dentro do genoma. Ambos clivam uma única fita de DNA em vez de uma ruptura de fita dupla (DSB) como o CRISPR/Cas910,26. Embora a edição base seja mais específica do que a edição padrão em CRISPR/Cas9, ela é menos adaptável e, portanto, menos relevante para tradução do que a edição principal. A eficiência da edição de bases está em sua capacidade de corrigir mutações pontuais substituindo citosina por timina ou adenina por guanina e vice-versa 10. Por causa disso, a edição base é limitada nos tipos de mutações que pode causar. Assim, embora úteis, apenas mutações de transição podem ser executadas, não inserções ou deleções10. No entanto, a edição primária é uma forma altamente adaptável de edição genômica, com muitas aplicações possíveis. A edição prime utiliza um RNA guia de edição prime (pegRNA) e uma nickase Cas9 acoplada à transcriptase reversa, que pode facilitar inserções, deleções ou alterações em nucleotídeosindividuais 10. Infelizmente, por ser mais complexa tecnicamente e poder realizar alterações gênicas maiores, a edição primária pode ser menos eficiente do que a edição base. Portanto, ambos podem ser usados como ferramentas complementares e são úteis na edição genômica de distúrbios do neurodesenvolvimento. A edição de primeira linha já foi utilizada para tratar um paciente com um distúrbio genético raro27 e mostrou potencial no resgate de fenótipos de doenças em um modelo roedor de hemiplegia alternada nainfância 28.

Ensaios celulares e moleculares

As NDDs são causadas por variantes genéticas que impactam a função celular de maneirasdiferentes 29,30,31. Um grande desafio enfrentado por aqueles que estudam as NDDs é como determinar se uma variante específica do paciente causa ou não uma alteração funcional prejudicial na célula. Assim, há uma grande necessidade de ensaios que possam determinar rápida e com precisão se uma variante genética específica é causadora de doenças ou benigna. Um novo ensaio promissor é o ensaio de clivagemde ubiquitina 32. Enzimas deubiquitilantes (DUB) são um grupo de enzimas que removem ubiquitina das proteínas, prevenindo a degradação. Os DUBs são tanto tratamentos potenciais quanto causas de NDDs. Até agora, mutações em 12 DUBs foram identificadas como causalmente ligadas a NDDs, incluindo síndrome de Hao-Fountain, pseudo-TORCH syndrome, síndrome de microcefalia-malformação capilar, entreoutras 5. Para determinar se variantes específicas de pacientes causam doença, os ensaios in vitro de clivagem de ubiquitina tornaram-se o padrão ouro para medir a atividade enzimática do DUB e validar funcionalmente mutações. Esse método pode ser usado para avaliar o efeito das variantes genéticas nas DUBs. Um estudo recente focou em uma DUB que sofre mutação na deficiência intelectual ligada ao X 105, DUB Ubiquitin Specific Protease 27 (USP27X). Os pesquisadores demonstraram com sucesso um método para expressão e purificação do recombinante USP27X e um ensaio in vitro de clivagem em cadeia de ubiquitina. Essa abordagem permite a identificação da atividade enzimática que regula a renovação proteica nos neurônios e, portanto, pode ser importante para entender os mecanismos subjacentes à poda sináptica alterada, períodos críticos do neurodesenvolvimento e funçãodas proteínas 32. Curiosamente, há escassez de artigos publicados sobre DUBs e seu papel na doença, e, portanto, a extensão total da aplicabilidade desse ensaio permanece não testada e aberta a investigações adicionais.

Como muitas NDDs também são classificadas como distúrbios raros, a constatação genética clínica de variantes frequentemente identifica alterações genéticas como 'variantes de significado desconhecido' (VUS) devido à falta de estudos clínicos ou funcionais publicados anteriormente sobre essasvariantes 7,33,34. Assim, ensaios para determinar rapidamente se um VUS é patogênico são cruciais para determinar as causas genéticas das NDDs. Um exemplo são as variantes nos receptoresGABA A. Variantes genéticas no receptorGABA A são uma das principais causas de epilepsia genética e estão associadas a muitos tipos de convulsões e encefalopatias epilépticasdo desenvolvimento 7,35. Um estudo recente investigou subunidades do receptorGABA A e tentou identificar se as variantes causavam mudanças funcionais dentro da célula usando uma abordagem multimodal. Testes in silico foram usados para identificar VUS e prever variações patogênicas da subunidade γ2GABA A. As consequências moleculares das variantes foram então definidas e incluíram marcadores estruturais, físico-químicos ebiofísicos 7. Cada um desses domínios foi definido por meio de análise bibliográfica, modelagem in silico e eletrofisiologia patch-clamp. Uma vez selecionada uma região de referência, a modelagem neural piramidal foi usada para testar os efeitos da inibição mediada pelo receptorGABA A. Eles observaram que duas mutações de ß3 subunidades (ß3N110D e ß3T288N) e duas mutações de subunidades γ2 prejudicavam a inibiçãoGABAérgica 7. Esse protocolo demonstra que uma abordagem multimodal é frequentemente útil para determinar a patogenicidade da VUS. Embora não seja de alta cadência, essa abordagem também pode ser útil para outras VUS associadas a NDDs que não possuem um teste específico para validar funcionalmente variantes (por exemplo, DUBs) — especialmente se estiverem associadas a mudanças eletrofisiológicas.

Embora não seja uma abordagem inovadora, a eletrofisiologia patch-clamp continua sendo o padrão ouro para entender as propriedades elétricas dos neurônios e, assim, como as mudanças genéticas impactam as propriedades básicas dos neurônios também. Relevantes para as NDDs são ascanalopatias 36. Embora existam muitos tipos de canalopatias, as variantes do SCN1A foram bem estudadas e são a principal causa da síndrome de Dravet — uma encefalopatia epiléptica do desenvolvimento particularmentedevastadora 36. A validação funcional das variantes do SCN1A foi realizada usando uma abordagem combinatória de simulações automatizadas de patch-clamp e in silico. Aproveitando essa abordagem, os pesquisadores conseguiram resolver várias VUS e estabelecer correlações genótipo-fenótipo com base em mudanças funcionais nosneurônios 37. Em um estudo separado usando uma abordagem semelhante, modelos iPSC foram usados com eletrofisiologia automatizada de pinça de retalho e modelos in silico para classificar variantes gênicas nos canais de cálciodo tipo T 38. Focando no CACNA1G, um gene que codifica Cav3.1 em vários tipos de neurônios, CACNA1G foi mutado para formar 18 variantes de Cav3.1 que foram então transitoriamente transfectadas em neurônios. Em seguida, foram feitas gravações automáticas do patch-clamp, seguidas por abordagens manuais de patch-clamp e computacionais. Eles observaram que o patch-clamp automatizado e o patch-clamp manual produziam resultados semelhantes e que abordagens computacionais conseguiram determinar as mudanças funcionais induzidas por variantes genéticas específicas38. Enquanto os modelos computacionais fornecem uma forma relativamente rápida de prever as consequências funcionais das variantes genéticas, abordagens eletrofisiológicas continuam demoradas e exigem habilidades altamente especializadas que limitam a utilidade dessas abordagens ao tentar validar grandes números de variantes.

Matrizes multieletrodos (MEAs) são usadas para medir a atividade elétrica ao redor de pequenos grupos ou em grandes redes de células. Esse método difere da eletrofisiologia patch-clamp por focar em modelos multicelulares, enquanto patch-clamp é centrado em um único canal ou célula39,40. Por isso, os MEAs podem fornecer insights sobre como diferentes regiões cerebrais interagem entre si e podem ser usados para estudar doenças em escala de rede. Muitos estudos utilizaram MEAs para investigar modelos experimentais de epilepsia eTEA 14,39. Uma característica chave dos MEAs é que eles conseguem determinar as maneiras pelas quais diferentes tipos de células neuronais interagem (por exemplo, neurônios glutamatérgicos, interneurônios GABAérgicos, progenitores e células gliais)14. Isso torna os MEAs uma excelente abordagem para estudar assembloides cerebrais. Um estudo, realizado por Pan et al., utilizou esse método para estudar o desenvolvimento de redes neuronais. Os autores usaram células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) dos fibroblastos14 do prepúcio, que foram primeiro marcados viralmente e depois cultivados para gerar assembloides. Depois, os assembloides foram aderidos às placas MEA eregistraram 14. Importante destacar que, como os assembloides podiam ser estabilizados, registrados e submetidos a experimentos farmacológicos por aproximadamente 50 dias, esse paradigma poderia ser usado para analisar medicamentos terapêuticos para tratar epilepsia associada a NDDs. De fato, essa abordagem poderia ser usada para testar quaisquer NDDs em que mudanças nas propriedades da rede dos neurônios sejam conhecidas ou suspeitas14.

Conclusões

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As NDDs podem ser transtornos devastadores e possuem poucos tratamentos direcionados e nenhuma cura. De fato, a maioria das terapias tem como objetivo o manejo dos sintomas da doença (por exemplo, medicamentos anticonvulsivos para epilepsia). No entanto, avanços recentes na tecnologia levaram a novas técnicas de edição gênica, ensaios e sistemas modelo que permitem aos cientistas investigar as causas raiz das NDDs  (Figura 1). Esta revisão detalhou algumas das abordagens que estão na vanguarda dos esforços para encontrar novos tratamentos para NDDs e patologias relacionadas. Técnicas de edição gênica permitirão que os pesquisadores mirem diretamente nas mutações para melhor compreender os mecanismos da doença e, potencialmente, tratar pacientes com terapia gênica de precisão. Novos ensaios permitem a rápida classificação funcional de variantes genéticas, e modelos de células-tronco permitirão que os cientistas compreendam os primeiros mecanismos de desenvolvimento que impulsionam as NDDs, além de testar novas terapias. As técnicas detalhadas nesta revisão formam a base sobre a qual estudos futuros podem ser realizados com o objetivo de obter uma compreensão mais profunda dos mecanismos de NDD, além de levar a novas abordagens clínicas para tratá-los. À medida que o campo continua a evoluir, estudos futuros devem integrar técnicas como testes pré-natais, terapias fetais, imagens de alto conteúdo e farmacogenômica com as detalhadas nesta revisão.

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Figura 1: Resumo dos principais pontos fortes e fracos das abordagens técnicas. Os métodos detalhados no artigo e apresentados nas coleções de métodos complementares são resumidos. Uma força e fraqueza principais são detalhadas para cada técnica. Uma referência chave para cada técnica é fornecida na coluna do método. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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O financiamento foi fornecido pelo NIH NINDS RO1NS131223 ao PHI. A Figura 1 foi preparada usando o BioRender.

Referências

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