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Avaliação da Reserva de Fluxo Coronariano em um modelo murino de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada usando Ecocardiografia Doppler

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DOI:

10.3791/70135

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24 de março de 2026

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1Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing Medical University, 2Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Nanjing University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem rápida e não invasiva para avaliar a disfunção microvascular coronária em um modelo murino de insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF). A reserva de fluxo coronário (CFR) é determinada pela localização guiada por Doppler da artéria coronária esquerda, calculada como a razão entre a velocidade do fluxo coronário hiperêmico e a de base.

Resumo

A insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (HFpEF) constitui um considerável fardo global de saúde e um grande desafio clínico devido à ausência de terapias eficazes, e a fisiopatologia subjacente permanece difícil de alcançar. A disfunção microvascular coronária (DCM), altamente prevalente em pacientes com HFpEF, desencadeia isquemia miocárdica que prejudica tanto a função diastólica quanto a sistólica do ventrículo esquerdo. Considerando que a disfunção microvascular é uma característica central da HFpEF, a DCM agora é considerada um fator importante em sua patogênese. A reserva de fluxo coronariano (CFR), definida como a razão entre a velocidade máxima hiperêmica e a do fluxo sanguíneo em repouso, é um marcador altamente valioso da isquemia miocárdica. Além disso, serve como um indicador abrangente da disfunção vasomotora coronariana, medindo os efeitos hemodinâmicos combinados das artérias coronárias epicárdicas e microvasculares na perfusão miocárdica. Esse protocolo focava em avaliar as alterações na CFR em um modelo camundongo de HFpEF usando ecocardiografia Doppler. Neste estudo, camundongos controle mostraram um aumento maior que duas vezes na velocidade máxima do fluxo sanguíneo coronário com vasodilatação induzida por isoflurano em comparação com valores em repouso, enquanto essa resposta foi significativamente atenuada em camundongos HFpEF. Na HFpEF, uma redução do CFR prevê desfechos adversos e reflete disfunção microvascular subjacente, posicionando-a como uma ferramenta chave para estudar a progressão da doença e orientar a seleção dos pacientes.

Introdução

A insuficiência cardíaca (IC) com fração de ejeção preservada (HFpEF) tem sido a forma dominante de IC e está associada a um prognóstico ruim. No entanto, não há tratamento comprovado para reduzir sua morbidade e mortalidaderelacionadas 1,2. A presença de múltiplos fatores de risco, incluindo idade avançada, hipertensão, diabetes, dislipidemia e obesidade, fundamenta a complexidade e heterogeneidade na HFpEF3. Nos últimos anos, evidências acumuladas mostraram que a disfunção microvascular coronária (DMC) é um fator de risco independente e direto para a HFpEF, em vez de uma comorbidade 4,5,6. Disfunção microvascular coronariana envolvendo tanto anormalidades funcionais quanto estruturais está na base da isquemia subendocárdica, fibrose intersticial difusa e disfunção ventricular esquerda na HFpEF 7,8. Extensas pesquisas foram conduzidas sobre o papel patológico da DCM em doençascardiovasculares 9,10. Um estudo clínico mostrou que a disfunção microvascular (evidenciada por uma CFR comprometida <2,0) está diretamente associada a uma pior função diastólica do ventrículo esquerdo e pode ser um alvo terapêutico promissor na HFpEF11. Avaliação ecocardiográfica no estudo sobre a prevalência de disfunção microvascular em insuficiência cardíaca com fração de ejeção preservada (PROMIS-HFpEF) revelou que 75% dos pacientes com HFpEF apresentavam DCC, com base em medições de CFR na artéria coronáriaesquerda 12. Além disso, a DMC anormal correlacionou-se com um risco aumentado de desfechos adversos, incluindo um aumento significativo do risco demortalidade 13,14. Consequentemente, o uso da DMC como biomarcador-chave em modelos animais facilita muito a investigação da fisiopatologia da HFpEF e auxilia na validação da replicação bem-sucedida do fenótipo da doença.

Atualmente, métodos para avaliação da função microvascular coronariana, como tomografia por emissão de pósitrons (PET), ressonância magnética cardiovascular (CMR), reserva fracionária de fluxo (FFR) e índice de resistência microcirculatória (IMR), são difíceis de aplicar em estudos com roedores devido ao pequeno tamanho dos animais e à disponibilidade limitada de equipamentos de imagem dedicados. A reserva de fluxo coronário (CFR) é recomendada por diretrizes internacionais como ferramenta para interrogar a fisiologiacoronária 15,16. Além disso, o CFR serve como um marcador eficaz de isquemia cardíaca, um indicador de disfunção vascular coronariana e um indicador prognóstico valioso de riscocardiovascular 17. A ecocardiografia Doppler para avaliação da CFR é um método validado e reprodutível para avaliar a função vascular coronária global em modelos pré-clínicos de roedores. Embora estudos anteriores tenham relatado o uso de CFR em modelos de camundongo/rato de lesão por isquemia-reperfusãodo miocárdio 18,19, ele nunca foi aplicado em modelos animais de HFpEF. Além disso, o método de avaliação da CFR descrito neste estudo, que localiza rapidamente o LCA usando ecocardiografia Doppler colorida, pode ser estendido a uma variedade de modelos animais, incluindo cardiomiopatia diabética, cardiopatia hipertensiva e distúrbios inflamatórios ou autoimunes crônicos. No presente estudo, dada a ausência de estenose coronariana epicárdica no modelo murino, a redução da reserva de fluxo coronariano (CFR) reflete principalmente disfunção microvascular coronária, em vez de contribuições combinadas epicárdicas e microvasculares. Assim, o CFR serve como um marcador substituto confiável para CMD neste modelo HFpEF.

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Protocolo

Todos os procedimentos seguiram os protocolos aprovados pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Torre de Tambores de Nanjing (Aprovação nº 20011141) e seguiram as diretrizes Pesquisa em Animais: Relato de Experimentos In Vivo (ARRIVE) 20. Neste estudo, o modelo HFpEF foi estabelecido em camundongos machos C57BL/6J (BW, ~25 g) de seis a oito semanas. Durante toda a duração do experimento, os camundongos foram alojados em uma sala livre de patógenos específicos (FPS) sob condições controladas de temperatura (23 ± 1 °C), umidade (65%–70%) e um ciclo de 12 horas de luz/escuro. Todos os animais tinham acesso ad libitum a comida e água. Após o estudo, os camundongos foram anestesiados com 1,5% de isoflurano e eutanasiados por luxação cervical. Os reagentes e equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Estabelecimento do modelo de camundongo HFpEF

  1. Distribua aleatoriamente os camundongos em dois grupos: um grupo controle (CTRL) e um grupo HFpEF, com oito camundongos em cada um.
  2. Empregue um protocoloestabelecido 21,22,23,24,25 para induzir o modelo de camundongo HFpEF da seguinte forma:
    1. Alimente camundongos de seis a oito semanas com uma dieta rica em gordura (HFD, 60% de gordura) e forneça 0,5 g/L de éster metilígeno N-nitro-L-arginina (L-NAME) dissolvido em água potável por 8 semanas.
      NOTA: Prepare água L-NAME em garrafas marrons para evitar exposição à luz e refresque a cada 2–3 dias.
  3. Alimente camundongos de etários compatíveis com uma dieta normal padrão e forneça água potável regularmente pelo mesmo período que o grupo controle.

2. Avaliação da reserva de fluxo coronariano por ecocardiografia

  1. Anteceda a avaliação ecocardiográfica anestesiando o camundongo por meio da inalação de isoflurano vaporizado a 1,5% administrado a 1,5–2,0 L/min com fluxo de 100% de O₂ em uma câmara anestésica.
    ATENÇÃO: O isoflurano é um anestésico volátil. Garanta ventilação adequada durante a operação. Use luvas de nitrilo ao adicionar isoflurano líquido ao vaporizador para evitar contato com a pele.
  2. Confirme a ausência de reação ao beliscão da pele e à estimulação dos dedos ou caudas, e então posicione o animal deitado na plataforma de imagem.
  3. Troque a máquina de anestesia gasosa da câmara para a entrega da máscara e mantenha uma concentração constante de anestesia de 1,5% durante todo o procedimento.
  4. Adquira dados fisiológicos (ECG e respiração) aplicando gel condutor na folha de cobre (eletrodos de ECG) da plataforma de imagem e colando as quatro patas sobre elas.
    NOTA: Mantenha o isoflurano em 1,5% para manutenção e mantenha a temperatura corporal central próxima a 37 °C usando a plataforma de aquecimento embutida. Mantenha uma frequência respiratória alvo de 100–140 respirações por minuto para garantir estabilidade fisiológica durante a imagem de imagem.
  5. Remova os pelos do peito aplicando creme depilatório com um aplicador com ponta de algodão.
  6. Limpe o excesso de creme e pelos soltos com gaze embebida em água para se preparar para a imagem.
    NOTA: Remova completamente o creme depilatório residual para evitar irritação ou toxicidade da pele.
  7. Aplique pomada oftálmica lubrificante estéril em ambos os olhos para evitar a secagem escleral.
  8. Aplique gel de transmissão por ultrassom na área anterior do coração e posicione a plataforma de imagem em aproximadamente um ângulo de 30° a 45° em relação à horizontal.
    NOTA: Evite bolhas de ar no gel de ultrassom.
  9. Coloque o transdutor de ultrassom de alta frequência lentamente na linha paraesternal e alinhe-o paralelamente ao tórax para obter a visão ajustada do longo eixo paraesternal (PLAX) do ventrículo esquerdo (Figura 1A).
  10. Incline a sonda para garantir um contato leve com a parede torácica, evitando compressão.
  11. Pressione o botão Modo Brilhante para mudar para a imagem do modo de brilho.
  12. Ajuste o ângulo da sonda e da plataforma de imagem para localizar a artéria coronária esquerda (LCA).
    NOTA: Identifique o ventrículo esquerdo (VE), átrio esquerdo (LA), parede anterior do ventrículo esquerdo (LVAW), parede posterior do ventrículo esquerdo (LVPW), septo interventricular (IVS), aorta (AO), artéria pulmonar (PA), veia pulmonar (PV), válvula mitral (MV) e músculo papilar dentro da janela acústica.
  13. Ative o modo Doppler colorido pressionando o botão Doppler colorido na tela sensível ao toque. Na exibição em tempo real, o fluxo afastado da válvula aórtica (em direção à sonda) aparece em vermelho.
  14. Ajuste o ângulo e a posição da sonda para visualizar o LCA completo do seio aórtico até o sítio do ramo distal, minimizando a interferência do fluxo das veias pulmonares.
  15. Ative o modo Doppler de onda pulsada (PW). Posicione a janela de medição do peso de peso paralela à direção do fluxo sanguíneo do LCA (Figura 1B,C).
    NOTA: Mantenha o ângulo de insonação abaixo de 60° e aplique correção de ângulo em tempo real alinhando o cursor Doppler paralelo ao fluxo coronariano.
  16. Selecione Salvar Clipe para capturar a forma de onda de velocidade do fluxo LCA de base.
  17. Aumente a concentração de isoflurano para 3% e observe o aumento gradual da velocidade do fluxo coronariano.
  18. Após 45 s de exposição contínua a 3% de isoflurano, selecione Salvar Clipe para capturar a velocidade do fluxo hipergênico coronariano.
    NOTA: Monitore continuamente o fluxo sanguíneo do LCA. Se o volume da amostra PW se desviar devido ao movimento respiratório ou cardíaco, pause a aquisição, retorne ao modo Doppler colorido para reidentificar o LCA, reposicione a porta PW e retome o modo PW.
  19. Ao concluir, interrompa a inalação de isoflurano e retire o gel de ultrassom. Coloque o rato em uma almofada térmica até que ele se recupere totalmente, depois devolve-o à gaiola.

3. Análise estatística

  1. Medições médias de três ciclos cardíacos consecutivos rastreadas no software de análise para obter velocidades de fluxo de referência e pico do LCA. Calcule o CFR como a razão entre o pico hiperêmico da velocidade do fluxo coronário diastólico e o pico inicial do fluxo coronário (CFV).
  2. Implemente um projeto duplo-cego entre o experimentador e o analista de dados. Avalie a normalidade usando o teste de Shapiro–Wilk. Analise dados normalmente distribuídos usando um teste t de Student sem pareamento bifurcado. Analise dados distribuídos de forma não normal usando o teste Mann–Whitney U.

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Resultados

Neste estudo, 16 camundongos (HFpEF, n = 8; CTRL, n = 8) foram usadas. A artéria coronária esquerda foi identificada sob orientação Doppler colorida na visão do eixo longo parasternal (PLAX), e a velocidade do fluxo coronariano foi medida usando Doppler de onda pulsada (PW). Após a aquisição de imagens suficientes e reprodutíveis de cada camundongo em concentrações tanto de 1,5% (base) quanto de 3% (hiperêmica) de isoflurano,o CFR de 26 foi determinado por medição...

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Discussão

Este estudo apresenta um protocolo que utiliza um método não invasivo, direto e reproduzível para avaliar disfunção macro e microvascular em modelos animais HFpEF. A ecocardiografia Doppler para avaliação da Reserva de Fluxo Coronário é reconhecida pela Sociedade Europeia de Cardiologia como um método validado ereproduzível 15. Sob condições fisiológicas normais em camundongos C57BL/6J, espera-se que a reserva de fluxo coronariano seja ≥2,0. Neste estudo, em compa...

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Divulgações

Os autores afirmam que não existem interesses financeiros ou comerciais concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelos Fundos para Jovens Cientistas Distintos em Nanjing - Projeto-Chave, apoiado pela Fundação de Ciência Médica e Desenvolvimento de Tecnologia, Departamento de Saúde de Nanjing (JQX22001); Fundação de Pós-Doutorado em Ciências da China (2023M731631); Financiamentos para Ensaios Clínicos do Hospital Drum Tower Afiliado, Faculdade de Medicina da Universidade de Nanjing (2024-LCYJ-PY-29); Fundação de Pesquisa da Comissão Provincial de Saúde e Planejamento Familiar de Jiangsu (MQ2024049).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Monitor de fisiologia animalFujifilmVEVO 3100Monitore a frequência cardíaca, a frequência respiratória e a temperatura corporal
Camundongos C57GemPharmatech Co., Ltd
CâmeraCanon, JapãoEOS R50Registre as posições da plataforma de imagem e da sonda de ultrassom
Creme depilatórioVeet, francêsDepilação
GazeCurityCAR-6339-PKEstéril
IsofluranoRECOMPENSAR510-22-10Anestesia
N-nitro-L-arginina metiléster (L-NAME)Sigma-AldrichN5751Introdução ao modelo de camundongos HFpEF
Dietas de pesquisa, 60% de gordura    Research Diets, Inc.   D12492Dieta rica em gordura
Bolsa térmica termodinâmica cirúrgicaGlobalebio, ChinaGE0-20WControle de temperatura
Gel de UltrassomLaboratórios ParkerW60698LGel de transmissão por ultrassom
Plataforma de imagem pré-clínica Vevo 3100FujifilmVEVO 3100Ecocardiografia
Software VevoLABFujifilmVevoLAB 3.2.6Análise de dados de ecocardiografia

Referências

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