In Vivo Observação não invasiva de mudanças dinâmicas no eixo capilar, melanina e colágeno durante o ciclo do folículo capilar dos camundongos

Resumo

Este estudo apresenta um método não invasivo, in vivo , utilizando microscopia de dois fótons e de segunda geração harmônica para monitorar longitudinalmente a morfologia do corpo capilar, a dinâmica da melanina e a densidade dérmica do colágeno ao longo de todo o ciclo do folículo piloso em camundongos, fornecendo uma estrutura metodológica robusta para pesquisas terapêuticas sobre queda de cabelo.

Resumo

As avaliações tradicionais do ciclo do folículo piloso dependem de métodos histológicos invasivos, limitando a observação longitudinal contínua. Foi levantado a hipótese de que a imagem óptica não invasiva, especialmente a fluorescência excitada por dois fótons (TPEF) e a geração de segundo harmônico (SHG), podem rastrear e quantificar com precisão mudanças dinâmicas in vivo nos eixos capilares, melanina e colágeno ao longo de múltiplos ciclos de folículos capilares. Os fios de cabelo dos camundongos C57BL/6 foram monitorados in vivo durante as fases anágeno, catagênico e telógeno usando dermoscopia, fotografia e microscopia eletrônica. Especificamente, TPEF sob excitação e imagem de 800 nm foram usados para quantificar a dinâmica da melanina, enquanto SHG sob excitação de 950 nm foi usado para observar mudanças de colágeno interfolicular. Para garantir a precisão, as medições ópticas in vivo foram validadas cruzadamente: a dinâmica da melanina foi confirmada por meio de fotografia cutânea para a aparência geral do tecido e coloração por hematoxilina e eosina (HE) para expressão do bulbo capilar, enquanto as alterações de colágeno foram validadas avaliando a densidade e orientação das fibras usando um sistema de imagem polarizadora de cristais líquidos em seções coradas com Sirius Red. As observações demonstraram que, durante a fase anágena, o diâmetro do fio capilar e a produção de melanina aumentaram progressivamente, acompanhados por uma redução significativa na densidade de colágeno interfolicular. Durante as fases catagênica e telogena, os níveis de melanina diminuíram gradualmente, e a densidade do colágeno foi se recuperando gradualmente até os níveis de base. Este projeto estabelece uma metodologia validada e não invasiva in vivo para avaliar a dinâmica abrangente dos folículos capilares, fornecendo uma estrutura experimental robusta para a avaliação pré-clínica de agentes ativos para tratamentos de queda de cabelo.

Introdução

Os folículos capilares dos camundongos C57BL/6 exibem sincronicidade e regularidade, oferecendo conveniência experimental e tornando-os um modelo animal comum para o estudo de doenças de pele ^1,2. Os folículos capilares entram na segunda fase telógena na sétima semana após o nascimento do camundongo C57BL/^{6 3}. Na ausência de intervenção artificial, essa fase telógena será mantida até a décima segunda semana após^{o nascimento 4}. Esse período prolongado de telógeno é um ponto de tempo comum usado em pesquisas para sincronizar o ciclo de crescimento do folículo^{piloso 5}. Após a depilação artificial dos camundongos, os folículos capilares imediatamente entram na fase^{anágena 6}.

Após a entrada na fase de crescimento, as células-tronco na região da protuberância proliferam e se diferenciam na bainha radicular externa, crescendo para baixo para aumentar o comprimento do^{folículo 7}. A base do fio capilar se estende para cima à medida que o folículo se^aprofunda. As células-tronco do bulbo se diferenciam continuamente no eixo capilar e na bainha interna^{da radicular 9}. A secreção de colágeno e melanina na pele também muda rapidamente durante a fase^{anágena 10}, desempenhando um papel importante no desenvolvimento do folículo^capilar. Em estudos relacionados à queda de cabelo, a secreção de melanina geralmente é avaliada pela cor da pele, o que não permite quantificação precisa¹³. Até o momento, a pesquisa sobre colágeno tem focado predominantemente no desenvolvimento e envelhecimento, em vez da dinâmica cíclica da quantificação.

Atualmente, uma grande limitação na avaliação dos ciclos dos folículos capilares e terapias regenerativas é a dependência de desfechos histológicos destrutivos, o que exige a eutanasia de diferentes grupos de animais em pontos específicos¹⁴. Isso impede o acompanhamento contínuo e longitudinal do mesmo microambiente folicular ao longo de múltiplos ciclos. Além disso, técnicas convencionais não invasivas, como dermatoscopia, não têm penetração suficiente no tecido para visualizar alterações foliculares^{profundas 15}, e a observação macroscópica falha em quantificar com precisão a melanina, tornando a raiz deficiente em melanina do pelo de clube difícil de detectar durante as fases de regressão tardia e^{repouso 16,17}. Enquanto várias tecnologias ópticas avançaram a observação longitudinal in ^{vivo 18,19}, como a polarimetria de cristal líquido para avaliação de fibras de colágeno^20,21, a microscopia confocal cutânea para observação^{da pigmentação 22,24} e a tomografia de coerência óptica para medir a espessura da pele 25,26,27, a microscopia multifóton oferece uma solução singularmente atraente. O uso combinado de fluorescência por excitação de dois fótons (TPEF) e geração de segundo harmônico (SHG) oferece vantagens distintas: permite o corte óptico de alta resolução e sem marcação profundamente na derme, possibilitando a quantificação simultânea in vivo da autofluorescência da melanina e da arquitetura das fibras de colágeno sem corantes^{exógenos 28,29}. Neste estudo, os autores hipotetizam que a imagem não invasiva TPEF/SHG pode quantificar dinamicamente e com precisão essas mudanças estruturais com uma precisão comparável aos padrões de ouro histológicos invasivos. Ao abordar esse problema científico chave, este estudo visa estabelecer uma estrutura robusta e longitudinal de imagem in vivo para apoiar a avaliação não invasiva de agentes terapêuticos para^{alopecia 30}.

Protocolo

Todos os métodos que envolvem o uso de vertebrados foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais. Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso Animal do Centro de Pesquisa Experimental da Academia China de Ciências Médicas Chinesas (Código de Protocolo: ERCCACMS11-2210-03). Todos os materiais utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

Preparação animal e observação macroscópica
Machos C57BL/6 camundongos, com idades entre 6 e 7 semanas e pesando 20 ± 2 g, foram obtidos de um fornecedor comercial. Os camundongos foram divididos em uma coorte de análise histológica (n = 39) e uma coorte contínua de imagem in vivo (n = 3). O pelo dorsal de todos os camundongos foi depilado para sincronizar o ciclo do folículo capilar. O estado de crescimento capilar foi examinado dia sim, dia não, do dia 2 ao dia 26 após a depilação. As costas dos camundongos da coorte de imagem foram fotografadas dia sim, dia não, até o dia 26 usando uma câmera. Uma distância focal fixa de 15 cm foi mantida, e condições de iluminação ambiente padrão e consistentes para documentar com precisão as mudanças macroscópicas.

In vivo Imagens TPEF e SHG
As sessões de imagem foram realizadas nos dias 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 e 26 após a depilação. Os camundongos foram anestesiados usando isoflurano. A perda completa de consciência era garantida observando a frequência respiratória e testando o reflexo do pé com uma leve pinçada no dedo do pé. O camundongo anestesiado foi fixado no palco de um microscópio de dois fótons. Para a imagem TPEF da melanina, o microscópio foi equipado com um objetivo de imersão em água de 25x (abertura numérica = 1,05), e o comprimento de onda de excitação foi ajustado para 800 nm. Foi realizada uma varredura em z-stack da autofluorescência da melanina, atingindo uma profundidade total de varredura de 45 μm. O tamanho do passo foi definido para 2 μm, a resolução da imagem para 1.024 × 1.024 pixels, e a velocidade de aquisição para 4 μs/pixel. Para a imagem SHG de fibras de colágeno, o comprimento de onda da excitação foi ajustado para 950 nm usando o mesmo objetivo de imersão em água de 25x. Foi iniciada uma varredura em pilha z da superfície superior da derme até uma profundidade total de varredura de 45 μm, mantendo um passo de 2 μm, resolução de imagem de 1.024 × 1.024 pixels e velocidade de aquisição de 4 μs/pixel. Após a sessão de imagem, o camundongo foi cuidadosamente retirado do palco do microscópio, o isoflurano foi descontinuado e o camundongo foi colocado em um almofadeiro térmico até recuperar totalmente a consciência antes de ser devolvido à gaiola doméstica.

Coleta de tecidos e processamento histológico
Uma coorte distinta e separada de três camundongos do grupo histológico foi eutanasiada dia sim, dia não, do dia 2 ao dia 26, de acordo com as diretrizes institucionais, garantindo que nenhum camundongo fosse reutilizado para amostragem histológica longitudinal. Uma amostra de tecido dorsal de 2 cm × 2 cm de espessura total, centrada precisamente na interseção das linhas médias horizontais e verticais nas costas de cada camundongo, foi excisada cirurgicamente. O tecido cutâneo excisado foi colocado de forma plana sobre um cartão rígido para evitar o enrolamento das bordas e imediatamente imerso em um tubo de ensaio contendo 4% de paraformaldeído. Os tecidos fixos foram desidratados e incorporados para preparar seções de parafina com 6 μm de espessura. Antes da descera, as seções de parafina eram aquecidas em um aquecedor de ferrolho por 120 minutos. As seções foram coradas com hematoxilina e eosina (HE) e Sirius Red usando kits padrão de coloração conforme as instruções do fabricante. As seções foram montadas com goma neutra e observadas usando um microscópio invertido. Para imagens polarizadas por cristais líquidos, as seções desenceradas e tingidas com Sirius Red foram fotografadas sob um microscópio de luz polarizada. Um ângulo unificado do polarizador era estabelecido cruzando o polarizador e o analisador exatamente a 90° para alcançar um fundo máximo escuro (estado de extinção), e esse ângulo específico era consistentemente travado em todas as capturas de imagem subsequentes.

Dermoscopia in vivo e microscopia eletrônica dos eixos de cabelo
Antes da arrancada, a área de crescimento dorsal dos pelos foi avaliada in vivo usando um dermatoscópio clínico com ampliação de 20x. A regeneração capilar foi quantificada usando um sistema padrão de pontuação 0–3 baseado na emergência e densidade do fio capilar (0 = nenhum cabelo visível; 1 = emergência de cabelo esparso; 2 = densidade moderada; 3 = denso e cobertura total do cabelo). Para garantir uma amostragem imparcial, a área depilada dorsal de cada camundongo foi visualmente dividida em quatro quadrantes iguais. Um gerador de números aleatórios foi usado para selecionar dois quadrantes por camundongo, e cinco fios de cabelo recém-crescidos foram firmemente arrancados de cada quadrante selecionado usando pinças estéreis. Os fios de cabelo arrancados foram imediatamente imersos e fixados em glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) por 4 horas a 4 °C para preservar a ultraestrutura. Os eixos de cabelo fixos foram lavados três vezes em tampão fosfato de 0,1 M e desidratados sequencialmente através de uma série graduada de etanol (50%, 70%, 80%, 90% e 100%) por 15 minutos em cada concentração, seguido por secagem em ponto crítico usando_CO2 líquido. Os fios secos de cabelo eram montados horizontalmente sobre fita de carbono dupla-face condutora, presa a tocos de alumínio. As amostras foram revestidas por sputter com uma camada de ouro de 10 nm usando um revestimento a vácuo por 60 s para evitar a carga de elétrons. As amostras revestidas foram inseridas em um microscópio eletrônico de varredura, e os fios de cabelo foram observados usando uma voltagem de aceleração de 5,0 kV. As mudanças morfológicas ultramicroscópicas foram avaliadas sistematicamente capturando imagens em ampliações de 500x e 1.000x, documentando especificamente o diâmetro do eixo capilar e a integridade estrutural e disposição das escamas cuticulares.

Análise de dados e estatística
Os parâmetros da imagem foram medidos e quantificados usando software genérico de análise de imagem. Todas as análises estatísticas e representações gráficas foram realizadas usando software padrão de análise estatística. Para dados contínuos de monitoramento in vivo obtidos dos mesmos animais em múltiplos pontos de tempo, a significância estatística foi determinada usando análise de variância por medidas repetidas (RM-ANOVA) seguida pelo teste pós-hoc de Bonferroni. Para dados histológicos envolvendo amostras independentes de animais, foi utilizada uma ANOVA unidirecional comum seguida do teste pós-hoc de Tukey para avaliar diferenças estatísticas. Todos os resultados foram expressos como média ± desvio padrão (DS). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas em *p < 0,05, p < 0,01 e ***p < 0,001.

Resultados

Observação de pelos de camundongos
Observações fotográficas do crescimento dos pelos murinos são apresentadas na Figura 1A. O aparecimento dos pelos através da superfície da pele começou no dia 10, com desenvolvimento contínuo mantido entre o dia 12 e o dia 16 (p < 0,05). A cobertura capilar estabilizou do dia 18 ao dia 26 (p > 0,05) (Figura 1B). Além disso, a dermoscopia facilitou a observa...

Discussão

O modelo de mouse C57BL/6 foi selecionado porque sua segunda fase telógena dura de forma estável da semana 7 à semana 12. Como a janela de observação de 26 dias está inteiramente dentro dessa fase estática, as profundas mudanças dinâmicas observadas são explicitamente impulsionadas pela progressão do ciclo induzida pela depilação, excluindo totalmente as flutuações naturais relacionadas à idade. Quando a depilação é realizada durante a fase telógena, os folículos capilares entram imediat...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
C57BL/6 mice,	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	SCXK (Jing) 2021-0006	Usado para modelos de animais
Digital DSLR Camera	Canon	EOS 80D	Usado para tirar fotos da parte de trás dos ratos
H&E Staining Kit	LtdSolarbio Science & Technology Co.	G1120	Usado para coloração de seções de tecido
Inverted Microscope	Olympus	BX51	Usado para tirar fotos
lsoflurane	RWD Life Science Co.	R510-22-16	Usado para anestesiar animais
Mai Tai DeepSee	SpectraPhysics	Mai Tai HP	Usado para TPEF e SHG em imagens in vivo
Medical Electronic Dermatoscope	China Chuanghong Medical Technology Co.	CH-DSIS-2000	Usado para imagens in vivo da cor da pele
Polarized Light Microscope	Olympus	BX51-P	Usado para imagem de coloração Sirius Red
Scanning electron microscope (SEM)	Hitachi High-Tech Corporation	SU8010	Para observação de ultraestrutura do eixo do cabelo
Sirius Red staining kit	Solarbio	G1472	Para coloração de fibras de colágeno
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R500	Usado para anestesiar animais