Imagem de Superresolução e Gerenciamento Compartilhado: Um Protocolo para Microscopia Confocal com Detecção de Multiplex

Summary

Este protocolo detalha as aplicações avançadas de imagem e o gerenciamento de recursos compartilhados de um sistema de microscópio confocal de varredura a laser integrado a um detector de matriz multiplexada para imagens celulares e subcelulares de alta resolução. O fluxo de trabalho permite imagens multimodais desde confocal até super-resolução (~120 nm) dentro de uma única plataforma, tornando a visualização em escala nanométrica mais acessível.

Abstract

A microscopia de superresolução (SRM) supera o limite de difração da microscopia óptica convencional, permitindo a visualização em nanoescala de estruturas subcelulares. No entanto, a adoção generalizada de técnicas como microscopia de depleção de emissão estimulada (STED), microscopia de localização fotoativada (PALM) / microscopia de reconstrução óptica estocástica (STORM) e microscopia de iluminação estruturada (SIM) pode ser dificultada por fatores como alta fototoxicidade, preparação especializada de amostras ou operação complexa. Aqui, apresentamos um protocolo abrangente que utiliza uma plataforma confocal de varredura a laser integrada a um detector multiplexado de super-resolução. Esse sistema, combinado com processamento computacional, permite uma transição direta entre imagens confocais e super-resolução dentro do mesmo fluxo de trabalho. O protocolo oferece uma abordagem amigável para imagens rápidas, de alta resolução e baixa fototoxicidade. O método detalhado abrange capacidades de imagem multimodal, incluindo fluorescência multicolorida, contraste diferencial de interferência (DIC), reconstrução tridimensional de pilha Z, imagem de células vivas em time-lapse, mosaico de grande área e vários modos de super-resolução oferecidos pelo detector de matriz multiplexada. Comparações sistemáticas demonstram que os modos de super-resolução alcançam uma resolução lateral de aproximadamente 120 nm, representando uma melhoria de cerca de duas vezes em relação ao limite de difração da microscopia convencional de campo amplo e uma melhoria significativa tanto na resolução quanto na relação sinal-ruído (4-8 vezes) em comparação com a operação confocal padrão na mesma plataforma. A discussão também aborda pontos-chave de um modelo de gestão compartilhada de recursos essencial para apoiar a operação sustentável dessa tecnologia. Este guia integrado serve como um recurso valioso tanto para pesquisadores novos quanto experientes e para gestores de instalações que buscam adotar e maximizar o potencial dessa forma acessível de imagem avançada em pesquisa em ciências da vida.

Introduction

A visualização de estruturas subcelulares dinâmicas é fundamental para o avanço da pesquisa em ciências da vida. No entanto, a resolução da microscopia óptica tradicional é limitada pela difração a aproximadamente 200 nm lateralmente, restringindo sua capacidade de resolver processos subcelulares dinâmicos. Para superar essa barreira, várias técnicas de super-resolução foram desenvolvidas. No entanto, técnicas como microscopia STED, PALM/STORM e SIM frequentemente apresentam barreiras para a adoção generalizada em ambientes multiusuário, incluindo alta fototoxicidade, necessidade de fluoróforos especializados ou preparação de amostras, procedimentos complexos de alinhamento ou processamento computacional^{intensivo 1,2,3}.

Nesse contexto, sistemas de microscópio confocal equipados com um detector de matriz multiplexada oferecem uma alternativa atraente ao permitir a imagem de superresolução por meio da detecção multi-pixel e reatribuição computacional, reduzindo significativamente o limiar^{técnico 4}. Essa abordagem utiliza um arranjo detector de fosfeno de arseneto de gálio (GaAsP) de 32 elementos para coletar mais fótons de cada ponto de varredura. Algoritmos inteligentes subsequentes de deconvolução reatribuem essa informação, reduzindo efetivamente o volume de detecção. Esse processo alcança resoluções espaciais de aproximadamente 120 nm lateralmente e 350 nm axialmente, representando uma melhoria de cerca de 2 vezes em relação ao limite de difração da microscopia de campo amplo e resultando em um aumento de 4 a 8x na relação sinal-ruído em comparação com o modo confocal padrão no mesmo^{instrumento 4,5,6}. Essa combinação única de resolução aprimorada, qualidade superior do sinal e compatibilidade com rótulos e protocolos fluorescentes comuns constitui sua principal vantagem para aplicação ampla.

Consequentemente, essa forma de microscopia de super-resolução acessível encontrou ampla aplicação em pesquisas em ciências da vida, permitindo estudos detalhados de morfologia de organelos, dinâmica do citoesqueleto, interações vírus-hospedeiro e co-localização molecular em células fixas e^{vivas 7,8}. Sua relativa suavidade o torna particularmente adequado para observações em time-lapse prolongadas de amostras vivas.

A integração desses sistemas avançados em instalações centrais é crucial para democratizar o acesso, mas sua operação sustentável e eficaz apresenta desafios distintos. Em instalações institucionais centrais, como na Escola de Medicina da Universidade de Zhejiang, o desempenho e o impacto ótimos dependem criticamente de três pilares: (1) protocolos de imagem padronizados e reprodutíveis, (2) manutenção rigorosa de rotina e (3) uma estrutura eficaz de gestão para acesso compartilhado. Embora existam recursos valiosos para aspectos específicos, como métodos de imagem para sistemas^{anteriores 9}ou princípios gerais de gestão^{de instalações 10,11}, atualmente falta um guia abrangente que integre protocolos detalhados e reproduzíveis para plataformas modernas de detectores multiplexados com um modelo comprovado de gestão de recursos compartilhados. Este artigo sobre protocolo tem como objetivo preencher essa lacuna.

O objetivo geral é fornecer um guia abrangente e passo a passo para implementar e utilizar de forma eficaz um sistema confocal com detector de matriz multiplexada para imagens de superresolução dentro de um ambiente de recursos compartilhados. It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical; e gestores de instalações que estabelecem ou otimizam tal serviço. Aqui, detalhamos sistematicamente a configuração do sistema, protocolos de imagem multimodal (abrangendo modos multicoloridos, 3D, célula viva, mosaico e super-resolução) e um modelo comprovado de gerenciamento compartilhado. Este guia integrado serve como um recurso para maximizar o potencial e a acessibilidade dessa poderosa modalidade de imagem.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo amostras biológicas foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos das Instalações Centrais da Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang e aprovados pelo Comitê de Biossegurança Institucional (Certificado de Aprovação nº BSL20235710079).

NOTA: Todos os procedimentos envolvendo culturas celulares devem ser realizados em condições estéreis em um gabinete de segurança biológica Classe II, salvo indicação em contrário. Este protocolo assume que o sistema de microscópio está instalado e que as potências do laser são calibradas. Especificações detalhadas e fornecedores recomendados para reagentes-chave, consumíveis e equipamentos (por exemplo, placas de imagem, vidro de cobertura, meio de montagem) estão listados na Tabela de materiais.

1. Preparação da amostra

NOTA: A imagem de superresolução bem-sucedida começa com a preparação ótima da amostra. O uso de placas de imagem de alta qualidade com cobertura de 1,5 mm (0,17 mm) de vidro é essencial para igualar o colar corretor das metas de imersão em óleo de alta NA e evitar aberrações esféricas. Todos os passos de centrifugação devem ser realizados a 300 × g por 5 minutos, salvo indicação indicativa.

1. Preparação de amostra de célula fixa para imagem multicolorida e super-resolução (por exemplo, células COS7)
   NOTA: Este protocolo descreve a imunocoloração para microtúbulos (Alexa Fluor 568) e mitocôndrias (Alexa Fluor 488), com contracoloração nuclear 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), conforme mostrado na Figura 1.
   1. Cultive células de COS7 no meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 10% a 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de CO₂ .
   2. Células de placa em placas de imagem de fundo de vidro de 35 mm com densidade de 1,0 × 10^{células de 5} por prato. Permita que as células aderam e cresçam até 60-70% de confluência (tipicamente 24 horas).
   3. Aspire o meio de cultura e lave as células suavemente com solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-aquecida (37°C). Fixe as células adicionando 1 mL de paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS e incube por 15 minutos em temperatura ambiente (RT).
   4. Aspire a solução de PFA (trate como lixo perigoso). Lave as células três vezes com 2 mL de PBS, incubando por 5 minutos por lavagem com balanço suave.
   5. Permeabilização e bloqueio: Incubar as células com 1 mL de tampão de permeabilização/bloqueio (0,1% v/v) Triton X-100, 1% (v/v) de albumina sérica bovina (BSA) em PBS) por 30 minutos na RT.
   6. Incubação primária de anticorpos: Incubar células com uma mistura de anticorpos primários contra α-tubulina (monoclonal de camundongo) e TOMM20 (policlonal de coelho) em tampão de diluição de anticorpos (1% de BSA no PBS) a 4°C durante a noite (ou 1-2 horas na RT). Use 300 μL por recipiente para cobrir a superfície do vidro.
   7. Lavagem: Aspire cuidadosamente a solução primária de anticorpos. Lave as células três vezes com 2 mL de PBS contendo 0,05% Tween-20 (PBST), 5 min por lavagem.
   8. Coloração de anticorpos secundários e nuclear: Prepare uma mistura de anticorpos secundários fluorescentes e DAPI em tampão de diluição de anticorpos (1% BSA/PBS), protegido da luz.
      1. Use IgG anti-rato de burro conjugado com Alexa Fluor 568 (1:500) e IgG anti-coelho conjugado com Alexa Fluor 488 (1:500).
      2. Inclua DAPI em concentração final de 1 μg/mL para coloração nuclear. Aplique 300 μL dessa mistura nas células e incube por 1 hora em RT no escuro.
   9. Lavagem final: Aspire a solução de tingimento e lave as células três vezes com 2 mL de PBS, 5 minutos por lavagem.
   10. Aplique o meio de montagem: Aspire cuidadosamente o PBS do prato de imagem, deixando a amostra levemente úmida. Aplique imediatamente uma pequena gota (~20 μL) de meio de montagem anti-descolorimento endurecido (por exemplo, ProLong Gold) diretamente na região do fundo de vidro.
   11. Cobrir e curar: Abaixe suavemente um copo de cobertura de alta precisão #1.5 sobre a gota, evitando bolhas. Deixe o suporte curar durante a noite em RT no escuro, ou por 2-4 horas a 37°C se for necessário curar mais rápido.
2. Preparação de amostra de células vivas para imagem em time-lapse (por exemplo, células de Hep3B expressando uma marca de proteína fluorescente).
   NOTA: Este protocolo descreve a imagem de células Hep3B expressando estabilidademente uma proteína fluorescente (por exemplo, EGFP) direcionada a mitocôndrias.
   1. Cultive células Hep3B em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de FBS. Células de placa em placas de imagem de fundo de vidro de 35 mm (1,5 cm de cobertura de vidro) com uma densidade de 0,8 × 10⁵células/prato. Permita que as células cresçam até aproximadamente 70-80% de confluência para obter saúde ideal e densidade de imagem (tipicamente 18-24 horas).
   2. Preparação para a imagem de imagem: No dia da imagem, substitua suavemente o meio padrão de cultura por 2 mL de meio de imagem pré-equilibrado (37°C, 5% CO₂ ), livre de fenol vermelho e baixa fluorescência, suplementado com 10% de FBS e, se necessário, 25 mM de tampão HEPES para estabilização do pH fora de uma incubadora de_CO2 . Isso minimiza a fluorescência de fundo e mantém o pH fisiológico durante a imagem.
      NOTA: Permita que o prato se aclimate no palco do microscópio pré-aquecido dentro da câmara ambiental por pelo menos 30-45 minutos antes de iniciar a aquisição em time-lapse para garantir a temperatura, foco e estabilização da saúde celular.

2. Inicialização, inicialização e alinhamento básico do sistema de microscópio

1. Energia da unidade principal do microscópio, do módulo de lançamento de laser (contendo lasers de estado sólido em 405, 488, 561 e 640 nm), da fonte de luz LED e do computador de controle.
   1. Deixe os lasers aquecerem e estabilizarem por pelo menos 15-20 minutos. Isso é fundamental para uma potência estável do laser, especialmente para experimentos quantitativos ou de time-lapse.
2. Inicie o software operacional do microscópio.
3. Na interface principal, selecione 'Microscópio' > 'Inicializar' ou siga o assistente de inicialização do software.
4. No software, navegue até o painel 'Aquisição'. No menu suspenso das lentes objetivas, selecione 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Óleo ' ou a objetiva apropriada para seu experimento.
5. Aplique uma gota de óleo de imersão (índice de refração = 1,518) diretamente na lente frontal da objetiva. Evite introduzir bolhas.
6. Para imagens de células vivas, ative a câmara ambiental e o sistema de estabilização ativa de foco (por exemplo, 'Foco Definido' >) pelo menos 45-60 minutos antes da imagem. Ajuste a temperatura para 37°C, CO₂ para 5% e umidade para >60%. Permita que o sistema se estabilize. Verifique a estabilidade usando os sensores da câmara.
7. O sistema agora está pronto para carregamento de amostras e configuração dos parâmetros de imagem.

3. Imagem por fluorescência multicolorida

1. Coloque a amostra preparada no palco do microscópio. Levante cuidadosamente o palco até que o vidro da cobertura entre em contato com o óleo de imersão.
2. No software de aquisição, navegue pela aba 'Aquisição' e selecione Criar um novo experimento.
3. Adicione múltiplas trilhas de imagem (canais) correspondentes aos fluoróforos utilizados. Para o exemplo na Figura 1, configure:
   1. Faixa 1 (DAPI): Excitação 405 nm, detecção 410-480 nm.
   2. Faixa 2 (Alexa Fluor 488): Excitação 488 nm, detecção 495-550 nm.
   3. Faixa 3 (Alexa Fluor 568): Excitação 561 nm, detecção 570-620 nm.
4. Para cada faixa, ajuste o diâmetro do orifício confocal para 1 Unidade Airy (1 UA).
5. Otimize a potência do laser e o ganho do detector para cada canal usando o seguinte processo iterativo:
   1. Selecione o primeiro canal (por exemplo, DAPI). Mude para o modo de varredura 'Live'.
   2. Ajuste a potência inicial do laser para um valor baixo (por exemplo, 0,1-0,5%). Ajuste o ganho do detector para um nível moderado dentro de sua faixa linear (por exemplo, 700 V para um PMT GaAsP).
   3. Aumente gradualmente a potência do laser até que as estruturas alvo fiquem claramente visíveis acima do fundo na imagem ao vivo.
   4. Abra a tela do Histograma . Certifique-se de não haver saturação de pixels (histograma não empilhado na borda direita). Reduza a potência do laser se necessário.
   5. Ajuste o ganho do detector para obter uma imagem brilhante e de baixo ruído. Evite ganhos acima de 850 V para evitar ruído excessivo.
   6. Repita os passos 3.5.1-3.5.5 para todos os canais de fluorescência restantes.
      NOTA: Equilibre potência do laser, ganho e tempo de permanência dos pixels para maximizar a relação sinal-ruído enquanto minimiza danos fotográficos. Para células vivas, priorize menor consumo de energia e tempos de permanência mais curtos.
6. Defina o formato da imagem (número de pixels) e o tempo de permanência dos pixels.
   1. Defina o tamanho do pixel para satisfazer o critério de Nyquist: tamanho do pixel ≤(resolução / 2,3). Para imagem confocal padrão (resolução lateral ~250 nm), defina o tamanho do pixel ≤108 nm.
   2. Use o botão de amostragem 'Nyquist ' do software para calcular isso automaticamente, se disponível.
   3. Defina o tempo de permanência dos pixels. Use um tempo de permanência mais longo (por exemplo, 1,0-2,0 μs) para maior relação sinal-ruído, ou um tempo de permanência menor (por exemplo, 0,5-1,0 μs) para imagens mais rápidas.
7. Certifique-se de que o modo 'Varredura Sequencial' esteja selecionado entre as faixas para minimizar a interferência.
8. Clique em 'Iniciar' para adquirir uma única imagem. Salve a imagem com os metadados relevantes.

4. Imagem de contraste por interferência diferencial (DIC)

1. Na aba 'Aquisição' do software de aquisição, selecione 'Adicionar um novo canal ' e configure-o para detecção de luz transmitida.
2. Selecione o detector de luz transmitida apropriado (frequentemente chamado de T-PMT (tubo fotomultiplicador de luz transmitida) ou ESID (detector de interface de sistema externo) no software).
3. Configuração do prisma DIC e polarizador:
   1. No painel de controle de hardware ou interface de software, selecione o prisma DIC correspondente ao seu objetivo (por exemplo, 'DIC III' para um objetivo 63x).
   2. Insira o prisma selecionado no caminho da luz.
4. Ajuste o polarizador e o controle DIC para um contraste ideal:
   1. Gire o analisador (polarizador) até que o fundo na imagem 'Live' pareça escuro ou muito escuro.
   2. Enquanto observa a imagem ao vivo, ajuste lentamente a posição do controle deslizante do DIC em pequenos incrementos.
   3. Otimize até que características celulares (por exemplo, membranas, núcleos) apareçam com um alívio distinto em sombra, pseudo-tridimensional, contra um fundo cinza neutro.
5. Defina o comprimento de onda de iluminação para DIC para um valor na faixa visível (por exemplo, 488 nm ou 546 nm).
6. Ajuste a intensidade da transmissão (potência do laser ou da lâmpada) e o ganho do detector para o canal de luz transmitida para obter uma imagem clara sem saturação.
7. Adquira a imagem DIC.

5. Aquisição de Z-stack para reconstrução tridimensional

NOTA: Antes de definir a pilha Z, configure todos os parâmetros de imagem (potência do laser, ganho, orifício minúsculo, tamanho do pixel) em um único plano focal ótimo, conforme descrito na Seção 3. Isso garante configurações consistentes em todas as seções ópticas.

1. Na aba 'Aquisição', selecione o modo 'Z-stack'.
2. Defina o volume de interesse:
   1. Usando uma varredura ao vivo em alta velocidade, foque na estrutura superior de interesse.
   2. Clique em 'Definir primeiro' (ou 'Top').
   3. Foque cuidadosamente na estrutura mais baixa de interesse.
   4. Clique em 'Definir Último' (ou 'Final'). O software exibirá a profundidade total.
3. Defina o Tamanho do passo Z para satisfazer o critério de amostragem de Nyquist na direção axial. (tipicamente d_r/2.3, onde d_r é a resolução axial). Para um objetivo de óleo de 63x/1,4 NA, use 0,3-0,4 μm.
4. Alternativamente, use o botão 'Optimal' ou 'Nyquist' do software para calcular automaticamente o tamanho do passo.
5. Configure parâmetros de imagem (potência do laser, ganho, orifício = 1 UA) para cada canal conforme descrito na Seção 3. Para sinais fracos, considere aumentar ligeiramente a potência ou ganho do laser em comparação com uma única imagem 2D.
6. Comece a aquisição para coletar toda a pilha de imagens.
   NOTA: Tempo total de aquisição = (Tempo de Frame de uma única fatia) × (Número de fatias)
   Planeje de acordo, especialmente para amostras vivas.
7. Reconstrução e Visualização 3D:
   1. Use o módulo 'Processing' do software (por exemplo, função de projeção 3D) ou abra a pilha de imagens em softwares dedicados como ImageJ/Fiji.
   2. Gerar projeções de intensidade máxima (MIP) para visualizar todos os sinais em foco em uma única imagem 2D.
   3. Para uma representação 3D verdadeira, aplique renderização por volume. Ajuste o brilho, a opacidade e a iluminação conforme necessário.
   4. Gerar vistas ortogonais (seções transversais XZ e YZ) para inspecionar a extensão axial e o registro.

6. Imagem em time-lapse para células vivas

1. Prepare as células vivas conforme descrito na Seção 1.2. e montar a antena no palco do microscópio pré-aquecido dentro da câmara ambiental.
2. Deixe a amostra se aclimatar por pelo menos 45-60 minutos, conforme descrito na Seção 2.6, para garantir a estabilização.
3. Navegue até um campo de visão com células saudáveis e bem espaçadas e adquira um único instantâneo de alta qualidade usando parâmetros otimizados pela Seção 3.5.
4. Ative o sistema de estabilização de foco ativo (por exemplo, Foco Definido ou similar). Isso é inegociável para experimentos de longo prazo para compensar a deriva térmica.
5. Na aba 'Aquisição', selecione o modo 'Série Temporal'.
6. Selecione o modo de imagem apropriado com base no equilíbrio necessário entre velocidade, resolução e fototoxicidade:
   1. Para máxima resolução espacial em processos menos dinâmicos, selecione o modo 'SR' (SuperResolução).
   2. Para um equilíbrio adequado para muitas dinâmicas de organelos, selecione 'SR 2 Y ' ou 'SR 4 Y ' (modos acelerados de superresolução).
   3. Para imagens em altíssima velocidade sem superresolução, selecione o modo 'Confocal' ou 'Co 2 Y'.
7. Defina a linha do tempo experimental: Defina a duração total do experimento e o intervalo de tempo (Δt) entre quadros consecutivos. (por exemplo, 5-30 s para motilidade mitocondrial)
8. Otimize os parâmetros de imagem para minimizar danos fotográficos:
   1. Comece com a menor potência do laser que gera um sinal detectável.
   2. Ajuste o ganho do detector dentro de sua faixa linear (600-850 V) para alcançar um nível de sinal viável, preferindo ganho ao aumento de potência do laser.
   3. Use a velocidade de varredura mais rápida (menor tempo de permanência em pixels) compatível com os requisitos de qualidade de imagem.
9. Comece a aquisição em time-lapse. Monitore os primeiros quadros para estabilidade de foco e saúde celular.

7. Imagem por varredura de tiles de grande área

1. Na aba 'Aquisição', selecione o modo 'Tile Scan'.
2. Defina a Região de mosaico usando um de dois métodos:
   1. Baseado em layout: Especifique o número de peças nas direções X e Y (por exemplo, 3 x 3).
   2. Baseado em ROI: Desenhe manualmente um retângulo sobre a imagem 'Live' para definir a região de interesse. O software calcula automaticamente o número de peças necessárias.
3. Defina a sobreposição entre os blocos adjacentes para 10-15%.
   NOTA: Essa sobreposição fornece informações suficientes para que o algoritmo de costura do software crie uma imagem composta sem interrupções.
4. Configure parâmetros de imagem (potência do laser, ganho, resolução) para um único tile como faria para uma imagem estática.
   NOTA: Para áreas em mosaico muito grandes, considere usar um modo de varredura mais rápido (por exemplo, 'Co 2 Y') para manter o tempo total de aquisição viável e minimizar o fotobranqueamento.
5. Comece a aquisição de azulejos. O software automaticamente adquire e costura os azulejos.
6. Após a aquisição, inspecione cuidadosamente a imagem costurada, especialmente nos limites dos azulejos, em busca de quaisquer artefatos. Use as ferramentas manuais de ajuste de costura do software, se necessário.

8. Imagem de superresolução usando o detector de matriz multiplexada

1. Na aba 'Aquisição', navegue até o seletor de modo, clique em 'Smart Setup' e selecione o modo 'Airyscan'. Depois, escolha 'SuperResolução' como modo de operação para o detector de matriz multiplexada.
2. Escolha o modo específico de aquisição com base nas prioridades experimentais:
   1. Modo 'SR': Para a maior resolução espacial possível (~120 nm lateral). Use para amostras fixas.
   2. Modo 'SR 2 Y': Proporciona equilíbrio entre resolução e velocidade.
   3. Modo 'SR 4 Y': Modo super-resolução mais rápido (até ~25 fps de taxa de linha, teoricamente), otimizado para imagem de células vivas para minimizar a dose de luz.
   4. Modo 'Co 2 Y': Oferece velocidade de imagem semelhante à confocal com relação sinal-ruído aprimorada, quando não é necessária super-resolução.
      NOTA: Os valores de resolução (por exemplo, 120 nm) são especificações do sistema sob condições^{ideais 12}. A resolução real depende da preparação da amostra, da relação sinal-ruído e do processamento correto.
3. Configure parâmetros de imagem (potência do laser, ganho do detector).
   1. Para imagens livecell, comece com potência do laser menor do que no modo confocal para reduzir o dano ao foto.
   2. Para amostras fixas e tenues, pode ser necessário maior potência e/ou ganho do laser para alcançar uma relação sinal-ruído suficiente.
   3. Encontre a potência mínima do laser que produza uma imagem limpa e de alto contraste no modo 'Live'.
4. Defina o tamanho do pixel e o tempo de permanência.
   1. Para capturar a resolução aprimorada, defina o tamanho do pixel para satisfazer o critério de Nyquist: tamanho do pixel ≤(resolução desejada / 2,3). Para o modo SR (alvo 120 nm), defina o tamanho do pixel ≤~52 nm.
   2. Use o botão 'Optimal' ou 'Nyquist' do software para calcular isso automaticamente, se disponível.
5. Adquira a imagem. Os dados brutos contêm sinais multiplexados e ainda não são superresolvidos.
6. Processe os dados adquiridos para alcançar a superresolução:
   1. Navegue até o módulo de processamento do software.
   2. Selecione o conjunto de dados e escolha a função 'SuperResolution Processing'.
   3. Comece pelas configurações 'Auto'. Para dados lowSNR, ajuste manualmente 'Força' e 'Filtro de Ruído' para aumentar a nitidez sem introduzir artefatos.
   4. (Opcional) Para maior fidelidade, especialmente em pilhas 3D, aplique um passo adicional de deconvolução conjunta (jDCV).
   5. Executar o processamento. Compare visualizações processadas e não processadas para verificar o aprimoramento dos detalhes reais.
7. (Opcional) Para comparação quantitativa da relação sinal-ruído (SNR) entre modos:
   1. Adquira imagens da mesma amostra em modos diferentes.
   2. Em softwares de análise, defina uma região de interesse (ROI) em uma estrutura uniforme e meça a intensidade média do sinal.
   3. Defina um ROI de fundo e meça o desvio padrão da intensidade de fundo.
   4. Calcule SNR = (Sinal Médio) / (Desvio Padrão do Contexto).
8. (Opcional) Para medição empírica de resolução do sistema usando esferas fluorescentes:
   1. Prepare uma amostra de esferas fluorescentes de 100 nm.
   2. Adquira um Zstack de uma conta isolada no modo SR com amostragem Nyquist.
   3. Processe a pilha com superresolução e (opcionalmente) jDCV.
   4. Use a ferramenta 'PSF Measurement' do software para ajustar uma Gaussiana 3D e registre a largura total aos valores de metade do máximo (FWHM).

Results

Imagem de fluorescência multicolorida
A imagem de fluorescência multicolorida das células fixas de COS7 foi realizada conforme descrito na Seção 3. Anticorpos contra α-tubulina (microtúbulos) e TOMM20 (mitocôndrias) foram usados com contra-coloração nuclear DAPI. Como mostrado na Figura 1, núcleos (azul), mitocôndrias (verde, Alexa Fluor 488) e microtúbulos (vermelho, Alexa Fluor 568) foram claramente delineados com alta especificidade e ...

Discussion

O protocolo integrado apresentado aqui fornece um roteiro abrangente para implementar as capacidades avançadas de imagem de um sistema moderno de microscópio confocal equipado com um detector de matriz multiplexada de super-resolução, dentro de um quadro sustentável de recursos compartilhados. Esta seção sintetiza os aspectos críticos do método, sua implementação prática e sua posição no campo da bioimagem. A execução bem-sucedida desse protocolo depende de várias etapas fundamentais. Pr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Células COS7	ATCC (ou similar)	CRL-1651	Linha celular de fibroblastos renais do macaco verde africano. Usado para preparação de amostras de célula fixa para imagens multicoloridas de superresolução
IgG anti-rato Donkey, conjugado Alexa Fluor 568	Invitrogen (ou similar)	A10037	Anticorpo secundário para coloração de microtúbulos. Usado com diluição 1:500
Dulbecco' s Meio Eagle Modificado (DMEM), glicose alta	Gibco (ou similar)	11965092	Meio de cultivo padrão para células COS7, suplementado com FBS de 10%.
Soro Fetal Bovino (FBS), inativado por calor	Gibco (ou similar)	10082147	Suplemento sérico usado a 10% (v/v) em todos os meios de cultura celular.
Prato de imagem com fundo de vidro (35 mm, µ-Dish, #1.5 capa de polímero, 0,17 mm de espessura)	ibidi (ou similar)	81156	Substrato para placagem celular e imagem. Crítico para compatibilidade com objetivos de imersão em óleo de alto NA.
Processamento de imagem e software de análise (módulos ZEN)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (azul)	Usado para reconstrução 3D, processamento de superresolução (por exemplo, Processamento Airyscan), medição de PSF e análise SNR.
ImageJ / Fiji	Código Aberto	N/A	Usado para reconstrução 3D adicional, geração de vistas ortogonais e análise geral de imagens.
Óleo de imersão (Índice de refração = 1,518)	Carl Zeiss (ou similar)	444960-0000-000	Para uso com objetivos de imersão em óleo (por exemplo, 63x/1,4 NA).
Sistema de microscópio confocal de varredura a laser com detector de matriz multiplex (por exemplo, ZEISS LSM 900 com Airyscan 2)	Carl Zeiss AG	LSM 900 (Airyscan 2)	A principal plataforma de imagem usada para todos os modos confocais e super-resolução descritos no protocolo.
Médio Essencial Mínimo (MEM) com Earle' s Salts	Gibco (ou similar)	11095080	Meio de cultivo padrão para células Hep3B, suplementado com 10% de FBS.
Anticorpo monoclonal anti-alfa-tubulina de camundongo (Clone DM1A)	Sigma-Aldrich (ou similar)	T6199	Anticorpo primário para marcar microtúbulos. Usado com diluição 1:500
Paraformaldeído (PFA), 4% no PBS	Jinpan  (ou similar)	TBS5083	Fixador para células. Use em temperatura ambiente por 15 minutos. Manuse-se com as precauções adequadas.
Meio de Imagem Livre de Fenol Vermelho	Gibco (ou similar)	21063029	Meio de baixa autofluorescência usado para imagem de células vivas. Pré-equilibrado com 5% de CO2 a 37° C antes do uso.
Soro salino tamponado com fosfato (PBS), 1X, pH 7,4	CellWorld (ou similar)	C0162-311	Usado como buffer de lavagem e diluição durante todo o protocolo.
Montagem antifade dourada ProLong	Invitrogen (ou similar)	P36930	Meio de montagem endurecido para preservar a fluorescência em amostras fixas.
Triton X-100	Sigma-Aldrich (ou similar)	T8787	Usado a 0,1% (v/v) para permeabilização celular
Pré-adolescente-20	Sigma-Aldrich (ou similar)	P9416	Usado a 0,05% (v/v) no PBS (PBST) para etapas de lavagem após incubações de anticorpos.
Albumina sérica bovina (BSA), Fração V	Sigma-Aldrich (ou similar)	A7906	Usado a 1% (p/v) no PBS para bloqueio e como componente do buffer de diluição de anticorpos.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma-Aldrich (ou similar)	D9542	Contra-tinção nuclear. Usado em concentração final de 1 & micro; g/mL.
IgG anti-coelho do burro, conjugado Alexa Fluor 488	Invitrogen (ou similar)	A21206	Anticorpo secundário para coloração mitocondrial. Usado com diluição 1:500
Microsferas fluorescentes (Beads), 100 nm de diâmetro	Invitrogen (por exemplo, TetraSpeck™) ou similares	T7279	Usado para medição empírica do sistema' função de espalhamento de pontos (PSF) e resolução.
Células Hep3B expressando de forma estável EGFP-mitocôndrias	IMMOCELL	IM-H367	Linha celular de hepatoma humana projetada para expressar estabilidade EGFP direcionada à matriz mitocondrial. Usado para imagens time-lapse de células vivas.
Solução tampão HEPES, 1 M	Gibco (ou similar)	15630080	Usado em concentração final de 25 mM em meio de imagem para estabilização do pH durante imagens ao vivo fora de uma incubadora de CO2.
Vidro de cobertura de alta precisão (#1,5, 0,17 mm de espessura)	Marienfeld (ou similar)	107052	Usado para montar amostras fixas.
Software operacional para microscópio (por exemplo, edição azul ZEN)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (azul)	Usado para controle do sistema, aquisição de imagens e processamento básico.
Lente objetiva: Plan-apochromat 63x/1.40 NA Oil DIC	Carl Zeiss AG	421462-9900-000	Objetivo principal usado para imagens de alta resolução.
Anticorpo policlonal anti-TOMM20 do coelho	Abcam (ou similar)	ab186735	Anticorpo primário para marcar mitocôndrias. Usado com diluição 1:1000