In Vitro Avaliação dos Efeitos Potenciadores de Moléculas Derivadas de Plantas sobre Biocidas Convencionais

Resumo

Este protocolo fornece uma estrutura sistemática para avaliar como os fitoquímicos podem potencializar os efeitos bactericidas dos biocidas tradicionais usando modelagem de atividade bactericida e ensaios de interação combinatória, que visam identificar misturas sinérgicas que melhorem o controle microbiano e reduzam o uso geral de biocidas.

Resumo

Desenvolver abordagens inovadoras e eficientes para aumentar a atividade antimicrobiana dos biocidas convencionais é uma estratégia promissora para melhorar o controle microbiano para fins de desinfecção em cuidados de saúde. Nesse contexto, descrevemos um protocolo detalhado para avaliar os efeitos potenciadores de fitoquímicos de origem vegetal sobre biocidas sintéticos. Esses produtos de origem vegetal são candidatos atraentes como adjuvantes biocidas devido à sua diversidade estrutural, bioatividade e frequentemente menor toxicidade. O fluxo de trabalho aqui descrito permite a determinação das concentrações bacteriacidas mínimas (MBCs) e a geração sistemática tanto das curvas dose-resposta quanto tempo-resposta para cada produto testado individualmente (biocidas e fitoquímicos) e para suas combinações duplas ou triplas. Os dados resultantes permitem modelagens matemáticas avançadas, incluindo a determinação do índice fracionário de concentração bactericida (FBCI) e a avaliação das interações entre os produtos testados em relação a efeitos sinérgicos, aditivos ou antagônicos usando o software Combenefit. Nesse sentido, é possível identificar produtos naturais promissores como potenciadores de biocidas, otimizar a eficácia antimicrobiana e desenhar estratégias de desinfecção mais sustentáveis e seguras que possam reduzir as concentrações exigidas de biocidas sintéticos. Isso melhora o controle microbiano e minimiza os riscos ambientais e de saúde pública associados ao uso excessivo de biocidas.

Introdução

As infecções associadas à saúde (IAAs) estão entre os desafios de saúde pública mais críticos e preocupantes em^{todo o mundo.} Alarmantemente, eles estão fortemente associados à disseminação de microrganismos multirresistentes (MDR) e à persistência de biocarga bacteriana nas superfícies hospitalares, frequentemente devido a práticas de desinfecção inadequadas ou^{ineficazes 2,3}. Além disso, a contaminação cruzada entre pacientes, equipe de saúde e equipamentos médicos amplifica ainda mais essa^{questão 4,5}. Na Europa, por exemplo, estima-se que quase 80.000 pacientes hospitalizados sofram de pelo menos uma HAI em um dado dia, representando aproximadamente 16 milhões de dias hospitalares adicionais a cada^ano. A pandemia de COVID-19 complicou ainda mais essa questão, contribuindo para o aumento das infecções bacterianas por MDR devido ao alto uso de agentes antimicrobianos/desinfetantes e ao aumento das internações ^6,7. O aumento das bactérias resistentes a antibióticos, incluindo Escherichia coli produtora de β-lactamase de espectro estendido (ESBL) e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), levou a um aumento da carga de saúde e econômica em todo o mundo. Na verdade, essas cepas ressaltam a urgência de desenvolver soluções inovadoras para prevenção e controle de^{infecções 1,8,9}.

Com isso em mente, os biocidas tornaram-se ferramentas cruciais para controlar a disseminação de bactérias resistentes e infecções bacterianas, sendo amplamente aplicados para desinfetar superfícies hospitalares, esterilizar equipamentos, tratar sistemas de água e prevenir a contaminação de dispositivos^{médicos 10,11}. Ao contrário dos antibióticos, que atuam sobre alvos microbianos^{específicos 12}, os biocidas perturbam múltiplas estruturas celulares simultaneamente, incluindo membranas, enzimas, RNA ribossomal e vias metabólicas 13,14,15. Inicialmente, acreditava-se que essa ação de amplo espectro reduziria o risco de resistência. No entanto, evidências mostram que microrganismos podem se adaptar à exposição ao biocida, levando à tolerância, persistência e até resistência cruzada a^{antibióticos 10,16}. Por exemplo, a exposição de Pseudomonas aeruginosa ao cloreto de benzalcônio selecionou variantes resistentes à ciprofloxacina e novobiocina por meio da superexpressão de bombas de efluxo¹⁷. De forma semelhante, foi demonstrado que o triclosano ativa bombas de efluxo em Stenotrophomonas maltophilia, enquanto a exposição à clorexidina esteve associada ao aumento da resistência a antibióticos em S. aureus¹⁸.

Além disso, compostos amônio quaternários (QACs), clorexidina, diamidinas, acridinas e triclosano foram implicados como possíveis causas para a seleção e persistência da resistência bacteriana a vários^{antibióticos 19,20}. Genes de resistência como qacA/B e SMR são conhecidos por conferir tolerância a QACs, e falhas clínicas como bacteriemia ligada a cateteres armazenados em soluções contaminadas de QAC e contaminação microbiana intrínseca de iodóforos também^{foram relatadas 16,17,21}. Esses achados destacam a necessidade urgente de um uso otimizado do biocida, apoiado por estudos mecanicistas e estratégias racionais de desinfecção.

Biofilmes, que são comunidades bacterianas de alta densidade celular e bem estruturadas embutidas em uma matriz extracelular de polissacarídeos, proteínas e ácidos nucleicos, representam um obstáculo adicional e significativo ao controle da^{infecção 22,23}. Eles apresentam tolerância notável a antibióticos e biocidas, contribuindo para a persistência das infecções nos pacientes. Além disso, biofilmes também são frequentemente associados à contaminação persistente de dispositivos médicos, instrumentos cirúrgicos e superfícies^{hospitalares.} Apesar de sua importância clínica, os biofilmes só foram reconhecidos como grandes contribuintes para infecções crônicas e resistência antimicrobiana nas últimas décadas. Sua resiliência é tal que até mesmo agentes desinfetantes agressivos frequentemente falham em erradicá-los, deixando para trás células persistentes capazes de resemear a infecção^{20, 25, 26}. Portanto, encontrar estratégias eficazes de antibiofilmes é crucial para controlar as IAA e reduzir a carga de saúde pública e econômica dos patógenos^{MDR 27,28}.

Como solução promissora, fitoquímicos, que são metabólitos secundários produzidos e extraídos das plantas, representam um recurso amplamente inexplorado para novos agentes antimicrobianos e^{antibiofilmes.} No entanto, nenhum fitoquímico é usado como antibiótico, devido à sua modesta atividade antimicrobiana em comparação com os antibióticos convencionais. Fitoquímicos são rotineiramente classificados como antimicrobianos com base em testes de suscetibilidade que produzem a concentração mínima inibitória (CMI) na faixa de 100 a 1000 μg/mL, valores muito maiores do que os dos antibióticos^{convencionais 30,31}. Importante destacar que os fitoquímicos já demonstraram atividade antibiofilme quando usados isoladamente ou como potenciadores de biocidas convencionais. Por exemplo, a quercetina pode inibir a produção de alginato, levando à diminuição da adesão durante o desenvolvimento do biofilme 32,33,34. A emodina inibiu o desenvolvimento de biofilmes por P. aeruginosa, E. coli e S. aureus por meio da diminuição da expressão de genes-chave envolvidos na formação^{de biofilmes 35}. Combinar fitoquímicos com biocidas convencionalmente usados, porém cada vez mais ineficazes, como agentes modificadores da resistência, representa uma estratégia promissora para aumentar a eficácia^{antimicrobiana 36}. Tais interações sinérgicas podem interferir nos mecanismos de resistência microbiana, reduzindo as concentrações mínimas efetivas de biocidas necessárias para alcançar uma desinfecção satisfatória³⁷. Essa abordagem otimiza o desempenho biocida, reduz a pressão seletiva para o desenvolvimento de resistência e diminui os impactos ecológicos e toxicológicos associados à aplicação excessiva de^{biocidas 15,20}. Os fitoquímicos são estruturalmente diversos 38,39,40, amplamente disponíveis 38,39,41, ^baratos 38,39,42, e frequentemente menos tóxicos para humanos e para o meio ambiente do que os biocidas ^{sintéticos 38,39}. São produtos naturais frequentemente derivados de fontes vegetais renováveis e, em alguns casos, relatados como apresentando menor persistência ambiental e perfis de toxicidade reduzidos em comparação com certos biocidas^sintéticos 43,44,45. Embora seus perfis de custo, disponibilidade e toxicidade variem dependendo do composto e do processo de extração, vários fitoquímicos demonstraram características favoráveis de segurança e ambientais em comparação com certos biocidas^{convencionais 46,47}.

Esse protocolo visa avaliar o potencial dos fitoquímicos, individualmente e em combinação com biocidas convencionais, para a desinfecção em cuidados de saúde. Em resumo, o protocolo avalia as interações biocida-fitoquímica em amplas faixas de concentração. Biocidas foram inicialmente testados entre 0,1–500 mg/L e fitoquímicos entre 50–10.000 mg/L para determinar as concentrações mínimas de bactericidas (MBCs) (Tabela 1). Para combinações duplas, as concentrações subbactericidas foram selecionadas da seguinte forma: cloreto de benzalcônio (BAC) em 0,1, 0,5 e 0,75 mg/L; ácido peracético (PAA) em 0,1, 0,3 e 0,5 mg/L; ácido salicílico (SAL) em 50, 100 e 250 mg/L; e eugenol (EUG) em 100, 250 e 750 mg/L (Tabela 1). Combinações triplas foram realizadas usando BAC (0,75 mg/L) ou PAA (0,5 mg/L) combinadas com SAL (100 ou 250 mg/L) e EUG (250 ou 750 mg/L) (Tabela 1). Testes de resposta temporal foram realizados em 1–90 minutos, seguidos por uma avaliação de recrescimento bacteriano em 24 horas. As interações antimicrobianas são quantificadas usando o índice fracionário de concentração bactericida (FBCI) e analisadas com o software Combenefit, enquanto a cinética de desinfecção é modelada usando os modelos Chick-Watson e Weibull para caracterizar a dependência de concentração e a dinâmica da inativação.

A inovação está no design racional de interações duplas e triplas estáveis entre fitoquímicos e biocidas, otimizando a atividade de desinfecção enquanto minimiza a toxicidade e o impacto ambiental devido à diminuição do uso de biocidas convencionais. Abordagens matemáticas como cálculo do FBCI e avaliação de sinergia também foram usadas para quantificar interações fitoquímico-biocida no controle microbiano. Enquanto o FBCI oferece uma interpretação categórica da interação (sinergia, antagonismo ou indiferença) em combinações específicas de concentração, o Combenefit permite uma avaliação mais abrangente, baseada em superfície de resposta, dos padrões de interação em uma faixa mais ampla de concentração. Isso permite a visualização e quantificação de efeitos de interação dependentes da concentração que podem não ser capturados pelos índices de ponto^{único 48,49}. Além disso, a cinética de desinfecção é modelada usando^{os modelos} 50 de Chick-Watson (para dose-resposta) e Weibull (para resposta temporal). Esses modelos fornecem modelagem cinética da inativação microbiana, oferecendo parâmetros quantitativos que descrevem taxas de desinfecção e comportamento da curva de^{sobrevivência 50}. Eles ajudam a caracterizar se matar segue dinâmicas logarítmicas ou não lineares e permitem uma interpretação mais mecanicista dos efeitos do tratamento, que vai além da descrição do^{FBCI 51,52}.

Esse protocolo garante a identificação sistemática de combinações promissoras de fitoquímicos-biocidas e o desenvolvimento de uma estratégia eficiente e sustentável para a desinfecção em cuidados de saúde. Ao contrário dos ensaios clássicos de CIM ou tabuleiro de xadrez, que fornecem medições estáticas de desfechos, este protocolo integra modelagem bactericida dinâmica e análises de interação para capturar a magnitude e a cinética da potenciação. Embora os ensaios clássicos em tabuleiro de xadrez forneçam informações valiosas sobre interações inibitórias baseadas nos desfechos da CIM, eles são limitados a medições de crescimento e índices de interação únicos. O protocolo descrito aqui avança além desse quadro ao quantificar a atividade bactericida em vez da inibição do crescimento, avaliar o crescimento pós-tratamento para avaliar efeitos antimicrobianos sustentados, avaliar combinações biocidas e fitoquímicas duplas e triplas, modelar a cinética de desinfecção por meio das abordagens Chick-Watson e Weibull, e aplicar análise de superfície concentração-resposta usando Combenefit. Essa estratégia multidimensional permite uma avaliação mais robusta e preditiva da potenciação biocida-fitoquímico.

Protocolo

NOTA: A metodologia proposta foi adaptada da Norma Europeia EN 1276⁵³.

1. Preparação da cultura

1. Criopreserve as cepas bacterianas testadas, Escherichia coli CECT 434 e Staphylococcus aureus CECT 976, armazenando-as em crioviais com glicerol 30% (v/v) a -80 °C.
2. Para a recuperação, cultive bactérias em placas de ágar de contagem de placas (PCA) e permita que elas cresçam, por 24 horas a 25 °C, incubando as placas.
3. Prepare culturas cultivadas durante a noite das cepas em estudo, inoculando uma colônia bacteriana de uma placa riscada em caldo de soja tríptico (TSB) para alcançar a fase de crescimento exponencial (de acordo com a curva de calibração obtida nos próximos passos), e incubando em uma incubadora agitada a 100 rpm e 25 °C.
4. Usando um espectrofotômetro, obtenha uma curva de calibração das unidades formadoras de colônias (CFU)/mL em função da densidade óptica a 600 nm (OD₆₀₀) para cada cepa bacteriana sob as condições de cultivo mencionadas anteriormente.
   1. Cultive uma cultura bacteriana durante a noite em TSB a 25 °C com agitação (100 rpm).
   2. Prepare diluições seriadas 10 vezes da cultura em solução sorinária estéril (0,85% w/v de NaCl).
   3. Meça o OD₆₀₀ de cada diluição usando um espectrofotômetro.
   4. Diluições apropriadas na placa no PCA. Incube as placas a 25 °C por 24 horas.
   5. Selecione placas com entre 10 e 100 colônias e determine os valores correspondentes de CFU/mL.
   6. Plote os valores de CFU/mL com as leituras correspondentes de OD₆₀₀ dentro da faixa linear (0,04–0,8).
   7. Realize pelo menos dois ensaios independentes com pelo menos duas réplicas. Realize uma análise de regressão linear para obter a equação de calibração.
   8. Use a equação resultante para estimar as concentrações bacterianas em experimentos subsequentes.
5. Centrifuge o inócula a 3772 x g por 10 minutos e lave uma vez com soro tampão de fosfato (PBS) (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L de Na₂HPO₄ e 0,24 g/L de_{KH 2}PO₄).
6. Usando um espectrofotômetro, ajuste o OD₆₀₀ do inócula no PBS para 1 x^{10 unidades formadoras de 8} colônias (CFU)/mL.

2. Preparação e controles de soluções moleculares

1. Considere a seleção, estudo e preparação das moléculas testadas da seguinte forma: use dois biocidas – BAC e PAA (15% (p/v) – e dois fitoquímicos – SAL e EUG 99%.
   NOTA: O BAC foi escolhido neste estudo porque é um QAC amplamente utilizado, eficaz contra bactérias por meio da ruptura de^{membranas 54,55}. O ácido peracético é um desinfetante oxidante de amplo espectro, cada vez mais utilizado para esterilização de instrumentos médicos^56,57. O ácido salicílico é um composto fenólico de interesse porque apresenta atividade antibacteriana e antibiofilme e influencia a virulência bacteriana e os mecanismos de resistência a antibióticos, sugerindo papéis potenciais na desinfecção e controle^{microbiano 58,59}. Eugenol é um composto aromático terpenoide/fenólico natural com propriedades antimicrobianas reconhecidas que pode atuar como uma alternativa mais segura e ecológica aos desinfetantes^{sintéticos 60,61}.
2. Prepare o BAC e o PAA frescos em água ultrapura.
3. EUG e SAL dissolvidos foram dissolvidos em dimetil sulfóxido (DMSO), garantindo que as células nunca fossem expostas a uma concentração de DMSO superior a 5%.
4. Prepare as concentrações testadas de BAC, PAA, EUG e SAL, de acordo com a Tabela 1.
5. Prepare as concentrações testadas em tubos centrífugos de 15 mL ajustando os volumes de solução original e suspensão celular para obter a concentração final desejada de moléculas e densidade celular.
6. Para todos os ensaios subsequentes, inclua dois controles negativos: (i) bactérias sem tratamento e (ii) bactérias expostas a 5% de DMSO (pois essa é a concentração máxima de DMSO à qual as células estão sendo expostas durante os ensaios).

3. Exposição bacteriana a biocidas ou fitoquímicos

1. Adicione 1 mL de suspensão de célula a 1 mL de água ultrapura e espere 2 minutos.
2. Depois, adicione 8 mL de biocida ou solução fitoquímica (em água ultrapura ou DMSO a 5%) e incube em uma incubadora agitada a 100 rpm e 25 °C, por 30 minutos.
3. Misture os compostos com as células por meio de vórtice.

4. Neutralização, diluição serial e placagem

1. Realize a neutralização de cada biocida ou fitoquímico em cada concentração testada usando o método de diluição-neutralização e o neutralizador universal: 30 g/L de polissorbato 80, 30 g/L de saponina, 1 g/L de L-histidina, 3 g/L de lecitina e 5 g/L de tiosulfato de sódio em tampão fosfato 0,0025 M.
2. Adicione 1 mL da amostra a ser neutralizada a 8 mL de neutralizador universal e 1 mL de água^{ultrapura 53}.
3. Realize diluição serial dez vezes adicionando 100 μL de uma diluição específica a 900 μL de solução salina estéril para obter a diluição subsequente (repita isso da diluição ^10-1 para a diluição ^10-7), e determine as células sobreviventes nas amostras neutralizadas colocando 10 μL de cada diluição sobre PCA, conforme o método da placa^{de queda 62}.
4. Incube as placas a 25 °C sem agitação por 24 horas para a contagem celular.
5. As UFC foram contabilizadas visualmente para placas contendo mais de 10 e menos de 100 colônias, e a concentração na qual ocorre uma redução completa da culturabilidade é registrada como o MBC. De acordo com a Equação (1), calcule a CFU/mL, onde n é o número de CFU contadas, SV é o volume de amostragem placada (0,01 mL) e Dil é a diluição onde as CFU foram contadas.
   CFU/mL = n/(SV Dil) (1)
6. Avalie a redução logarítmica, redução logarítmica, de acordo com a Equação (2), onde X₀ e X são a CFU/mL para as bactérias não tratadas (controle) e as bactérias tratadas, respectivamente.
   Redução logarítmica = log (X₀) - log (X) = log (X₀/X) (2)

5. Avaliação de combinações duplas e triplas

1. Aplique a metodologia descrita acima para avaliar a atividade de todas as possíveis combinações duais e triplas de um biocida e um fitoquímico (para combinações duplas) ou dois fitoquímicos (para combinações triplas) para buscar possíveis efeitos de potenciação/sinergia.
2. Considere a seguinte escolha de concentrações: para as combinações duplas, as concentrações testadas para BAC foram 0,1, 0,5 e 0,75 mg/L; para a PAA foram 0,1, 0,3 e 0,5 mg/L; para SAL eram 50, 100 e 250 mg/L; e para EUG foram 100, 250 e 750 mg/L (Tabela 1). Quanto à combinação tripla, a concentração testada para BAC foi de 0,75 mg/L; para a PAA era 0,5 mg/L; para SAL eram 100 e 250 mg/L; e para EUG foram 250 e 750 mg/L (Tabela 1).
3. Selecione as concentrações, escolhendo as avaliadas no ensaio dose-resposta para moléculas individuais que resultaram em efeitos não bactericidas.

6. Avaliação do crescimento bacteriano

1. Para avaliar a capacidade de regeneração bacteriana, permita que as células microbianas cresçam em meio líquido por mais de 24 horas, a 25 °C e 100 rpm, após o tratamento e neutralização.
2. Realize diluição serial dez vezes maior, placagem, incubação das placas PCA e quantificação da CFU/mL usando as mesmas técnicas e condições.

7. Interpretação de resultados combinatórios – Índice Fracionário de Concentração Bactericida (FBCI)

1. Interprete os resultados da análise combinatória da seguinte forma:
   1. Para combinações duais, FBCI = FBC(A) + FBC(B), onde a concentração bactericida fracionária de A, FBC(A), é a razão entre o MBC de A em combinação dual e o MBC de A sozinho (^combinação _{MBC A}/MBC_A ^sozinha), e FBC(B) é a razão entre o MBC de B em combinação dual e o MBC de B sozinho (^combinação MBC B/^{MBC B sozinho}) (Equação 3).
   2. Para combinações triplas, FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C), onde FBC(A) é a razão entre o MBC de A em combinação tripla e o MBC de A sozinho (^combinação _{MBC A}/MBC_A ^sozinho), FBC(B) é a razão entre o MBC de B em combinação tripla e o MBC de B sozinho (^combinação MBC B/^{MBC B sozinha}), e FBC(C) é a razão entre o MBC de C em combinação tripla e o MBC de C sozinho (^combinação MBC C/^{MBC C sozinho}) (Equação 4).
   3. Aplicando a classificação proposta por Fernandes et ^al.50, FBCI ≤ 0,5 corresponde a sinergismo, 0,5 < FBCI ≤ 1 indica aditividade, 1 < FBCI ≤ 4 é classificado como indiferença, e FBCI > 4,00 é considerado antagonismo.
      FBC(A) + FBC(B) = (^{combinação dual} MBC/MBC ^{A sozinho}) + (combinação dual MBC_B/^{MBC B sozinho}) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (combinação_{tripla MBC A}/^{MBC A sozinho}) + (^{combinação tripla} MBC_B/^{MBC B sozinho}) + (^{combinação tripla} MBC_C/^{MBC C sozinho}) (4)

8. Procedimento para ensaio de resposta no tempo

1. Prepare as culturas durante a noite de E. coli CECT 434 e S. aureus CECT 976 de acordo com as condições de crescimento descritas anteriormente (seção 1).
2. Adicione 1 mL de suspensão de célula a 1 mL de água ultrapura e espere 2 minutos. Neste ponto, adicione 8 mL de solução biocida/fitoquímica (em água ultrapura ou DMSO a 5%) para atingir as concentrações desejadas para cada molécula: 1/4 x MBC e MBC, e para a suspensão bacteriana (ajustando o OD), a 100 rpm e 25 °C. Misture as moléculas com as células por meio de vórtice.
3. Avalie os seguintes tempos de exposição: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 e 90 min.
4. Como descrito na seção 4, avalie a atividade antimicrobiana calculando a redução logarítmica (CFU/mL) como logarítmica (X/X₀).
5. Realize o biocida ou neutralização fitoquímica para cada par de concentração/tempo testado usando o método de diluição-neutralização e o neutralizador universal, a diluição e o revestimento em série, conforme descrito anteriormente na seção 4.

9. Análise de dados combinatórios com o software Combenefit

1. Abra o arquivo fornecido 'REPLICATE_TEMPLATE.xls', às https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ , para garantir a estrutura e formatação adequadas.
2. Organize seus dados em uma matriz, de acordo com a Tabela Suplementar 1, onde:
   1. Aumente as concentrações do produto A de cima para baixo (da menor para a linha mais alta numerada). Inclua pelo menos três concentrações diferentes para o produto A.
   2. Aumente as concentrações do produto B da esquerda para a direita (da coluna numerada mais baixa para a mais alta): Inclua pelo menos três concentrações diferentes para o produto B.
   3. Represente a linha superior (produto A) de agente único B.
   4. Represente a primeira coluna (0 mg/L produto B) produto monoagente A.
   5. Represente a célula (0,0) como o controle não tratado.
   6. Normalize, para cada caso, os valores utilizados, usando a Equação (5), onde o treat_0h é o logarítmic (CFU/mL) de um tratamento específico, imediatamente após a exposição (0h); treat_24h é o logaritmo (CFU/mL) de um tratamento específico, 24h após a exposição (regeneração); control_0h é o logaritmo (CFU/mL) para o controle correspondente (apenas células ou células expostas a 5% de DMSO), imediatamente após a exposição (0 h); e control_24h é o logaritmo (CFU/mL) para o controle correspondente (apenas células ou células expostas a 5% de DMSO), 24 horas após a exposição (regeneração).
   7. Realize, em todos os casos, a enumeração de CFU após 24 horas de incubação de amostras placadas na PCA.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      NOTA: Inclua controles/condições não tratadas que definam 100% de viabilidade e um controle positivo que define inibição máxima (opcional); Use apenas valores numéricos, sem fórmulas; Use o mesmo número de linhas e colunas entre as réplicas; Use '.' para decimais.
3. Salve como .xls ou .xlsx.
4. Crie um arquivo Excel para cada replicação, conforme descrito anteriormente e como na Tabela Suplementar 1, e adicione todos os arquivos na mesma pasta.
5. Abra o software Combenefit (Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, versão 2.021, disponível em https://sourceforge.net/projects/combenefit/).
6. Envie essa pasta para o Combenefit.
   1. Abra o software Combenefit
   2. Pressione Selecionar a pasta do projeto e escolha a pasta correta.
   3. Seleção do modelo de referência: aditividade de Loewe que assume o mecanismo exato para ambos os produtos; Bliss independência que assume ação independente, ou HAS, que é um modelo conservador (compara a combinação com o melhor agente único). A melhor prática consiste em rodar pelo menos dois modelos e escolher o melhor.
   4. Neste caso, o modelo Bliss foi selecionado, dado o modo de ação das moléculas testadas.
   5. Selecione as saídas gráficas desejadas, sabendo que deve selecionar pelo menos mais uma para a distribuição Synergy.
   6. Análise de Press Run (Figura Suplementar 1). Dica: Na janela Escolher Salvar durante a análise, selecione Tudo para salvar todas as saídas gráficas resultantes na pasta original.

10. Aplicação dos Modelos Chick-Watson e Weibull a dados de dosagem e resposta no tempo

1. Prepare seus dados formatando o conjunto de dados no Excel ou CSV antes de importar: Para dose-resposta, a Coluna A corresponde à dose (concentração, mg/L) e a Coluna B corresponde ao logaritarítmic (X/X₀); Para os dados de resposta no tempo, a Coluna A corresponde ao tempo (minutos) e a Coluna B corresponde ao logarítmic (X/X₀).
2. Salve seu arquivo em '.csv' ou copie e cole diretamente no Prism.
3. Open GraphPad Prism (versão utilizada: 9.0 para Windows 11; La Jolla, Califórnia, EUA).
4. Em Nova tabela e gráfico, selecione XY e, em tabela de dados, selecione Inserir ou importar dados para uma nova tabela (Figura Suplementar 2).
5. Nas Opções, para X, selecione Número, para Y selecione Inserir valores replicados em subcolunas lado a lado e pressione Criar (Figura Suplementar 2).
6. Insira dados de dose/tempo em X e registre dados de sobrevivência em Y.
7. Vá em Analisar, Regressão não linear (ajuste de curva), selecione os conjuntos de dados que deseja analisar e pressione OK (Figura Suplementar 2).
8. Selecione Novo e depois Criar nova equação.
9. Em Equação, para Tipo de Equação, escolha Equação Explícita: Y = uma função de X e parâmetros; para o Nome, escreva Modelo Chick-Watson/Modelo Weibull; e na definição escreva Y = -a*x^(n)*30 Modelo de Chick-Watson (Figura Suplementar 3) e Y = -1/(2,303)*(x/a)^(b) para o Modelo de Weibull (Figura Suplementar 4).
   NOTA: O modelo de Chick-Watson é expresso pela Equação 6, onde X₀ e X são a CFU/mL para as bactérias não tratadas (controle) e as bactérias tratadas, C é a concentração (dose), k_dis é o coeficiente da taxa de inativação, C é a concentração (dose), n é o expoente de concentração e t é o tempo de exposição (neste caso, 30 min)⁵⁰. O modelo Chick-Watson foi aplicado para observar a dose-resposta e caracterizar a relação entre concentração de desinfetante e redução microbiana.
   log (X/X₀) = -_{k dis} · Cⁿ · t (6)
   NOTA: O modelo de Weibull é expresso pela Equação 7, onde X₀ e X são a CFU/mL para as bactérias não tratadas (controle) e as bactérias tratadas, t é o tempo, α é o parâmetro de escala (tempo característico) e β é o parâmetro^{de forma 50}. O modelo de Weibull foi aplicado para observar a resposta no tempo e caracterizar a forma das curvas de sobrevivência. O parâmetro de escala representa o tempo característico de inativação, enquanto o parâmetro de forma descreve desvios do comportamento log-linear (β = 1 log-linear; β < 1 cauda; β > 1 ombro).
   logarítmic (X/_{X 0}) = -1/2,303 (t/α)^β (7)
10. Em Roles para Valores Iniciais, escolha 0 como Valor Inicial para cada parâmetro e (Valor Inicial, a ser ajustado) como Regra (Figura Suplementar 5).
11. Mantenha o resto das configurações como padrão e aperte OK.
12. Execute o ajuste e inspecione os parâmetros estimados.

11. Replicação biológica

1. Realize, para todos os ensaios, pelo menos dois experimentos independentes com pelo menos duas réplicas.

Resultados

Este estudo avaliou a atividade bactericida dos quatro compostos testados — BAC, PAA, SAL e EUG — contra E. coli CECT 434 e S. aureus CECT 976. Como mostrado nas Figuras 1 e 2, BAC, PAA, SAL e EUG apresentaram um aparente efeito dependente da concentração sobre a culturabilidade. A Tabela 2 apresenta os valores de MBC para as moléculas testadas após a exposição e 24h após a exposição (avaliação...

Discussão

O protocolo apresentado neste estudo fornece uma estrutura integrada para avaliar a atividade bactericida de dois biocidas comumente usados – BAC e PAA – e dois fitoquímicos promissores – EUG e SAL – individualmente e em combinação (combinações duplas e triplas), contra E. coli e S. aureus. Várias etapas dentro deste protocolo são particularmente críticas para garantir a reprodutibilidade e a interpretação precisa das interações antimicrobianas. Esses incluem a padronização do inoculo ba...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de benzalcônio	Merck, Espanha	8.14363.0100	Biocídio
Mega Star 600R Centrifugada	VWR, EUA	VWR Mega Star 600R	-
Combenefit - Versão 2.021	Pesquisa do Câncer do Reino Unido Cambridge Institute, Cambridge, Reino Unido	-	Software para avaliação de sinergismo
Cuvetas	VWR, Alemanha	VWRI634-0678	Cuvetas de 1,5 mL para ajuste óptico de densidade
Água destilada	-	-	Para preparação de mídia
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	VWR, França	23500.322	Solvente orgânico
Anéis de inoculação descartáveis	VWR, Itália	VWRI612-9357	10 & mu; Laços de inoculação em L
Tubos Eppendorf	VWR, China	VWRI525-1164	Tubos de trava segura eppendorf de 1,5 mL
Escherichia coli	Coleção de Cultura Tipo Espanhola (CECT)	434	Cepa de referência utilizada neste estudo
Etanol	VWR, França	83813.36	Para desisfecção de pobo, material e mãos de trabalho
Eugenol 99%	Sigma-Aldrich, EUA	163333	Fitoquímico
Tubos Falcon	VWR, EUA	VWRI525-1085	Tubos Falcon de 15 mL
Tubos Falcon	VWR, Bélgica	VWRI525-1109	Tubos Falcon de 50 mL
GraphPad Prism 9.0 para Windows 11	La Jolla, Califórnia, EUA	-	Software para análise matemática e estatística
Lecitina	Alfa Aesar, Alemanha	Q04A010	-
L-histidina	Merck, EUA	1.04351.0025	-
Incubadora Orbital	VWR, EUA	VWR 5000I Shaker incubador 230V	-
Ácido peracético 15%	AppliChem, Alemanha	143495-1211	Biocídio
Placas de Petri	VWR, Itália	VWRI391-0582	-
Pipeta 1 - 10 mL	VWR, EUA		-
Pipeta 100 - 1000 & mu; L	VWR, EUA		-
Pontas de pipeta de 100 a 1000 e mu; L	Frilabo, Portugal	1-202-50-0	-
Pippette 20 - 200 & mu; L	VWR, EUA		-
Ponteiras de pipette 1 - 10 mL	VWR, Bélgica	VWRI613-7094	-
Ponteiras de Pippette 2 - 200 & mu; L	VWR, México	VWRI613-6418	-
Ágar de contagem de placas	VWR, Bélgica	84608-0500	Isolamento e cultivo de microrganismos
Polissorbato 80	VWR, EUA	20E2756726	-
Cloreto de potássio - KCl	VWR, Bélgica	11D110008	-
Fosfato de Dihidrogênio de Potássio - KH2PO4	VWR, Alemanha	26931.263	-
Ácido sacílico	Sigma-Aldrich, EUA	84210-500G	Fitoquímico
Saponina	VWR, Alemanha	21A124103	-
Cloreto de Sódio - NaCl	VWR, Bélgica	27788.297	-
Fosfato de Hidrogênio de Sódio - Na2HPO4	VWR, Bélgica	28026.26	-
Tiosulfato de Sódio - Na2S2O3	VWR, EUA	18D2056589	-
Espectrofotômetro	VWR, EUA	Espectrofotômetro UV-1600PC	Ajuste de densidade óptica
Staphylococcus aureus	Coleção de Cultura Tipo Espanhola (CECT)	976	Cepa de referência utilizada neste estudo
Caldo de Soja Trippto	Merck, Alemanha	1.05459.0500	Isolamento e cultivo de microrganismos
Água ultrapura	-	-	Para preparação de amostras