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Artigo de método

Miografia de fios para artérias de resistência dorsal e mesentérica de camundongos e ratos

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DOI:

10.3791/70186

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27 de fevereiro de 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Fornecemos um protocolo detalhado para miografia por fio lado a lado para avaliar a reatividade vascular em artérias de conduto versus resistência isoladas de camundongos e ratos.

Resumo

A miografia por fio é uma técnica ex vivo amplamente utilizada para a avaliação quantitativa da função vascular em artérias isoladas. Como as artérias de grande conduto e pequenas de resistência diferem fundamentalmente em estrutura e papel fisiológico, analisar ambas as classes de vasos em paralelo usando artérias colhidas do mesmo camundongo ou rato possibilita comparações pareadas que reduzem a variabilidade entre animais e revelam mudanças funcionais específicas de cada vaso. Este artigo apresenta um protocolo passo a passo para avaliar a reatividade vascular em artérias isoladas de condutos e resistência murinas usando miografia isométrica por fio. Descrevemos a preparação de um tampão fisiológico fresco e oxigenado; dissecação, limpeza e montagem cuidadosas dos segmentos arteriais; e normalização para ajustar embarcações próximas ao comprimento ideal para geração ativa de força. Um guia de solução de problemas e uma sequência experimental de exemplo para gerar curvas cumulativas de concentração-resposta para vasoconstritores e vasodilatadores padrão são fornecidos. Esse protocolo permite a medição quantitativa tanto da função endotelial quanto da função muscular lisa e facilita a detecção de alterações específicas de vasos na reatividade vascular associadas a doenças vasculares, como hipertensão.

Introdução

A hipertensão é caracterizada por reatividade vascular alterada, como disfunção endotelial e hiperreatividade do músculo liso vascular avasoconstritores. Essas mudanças funcionais, juntamente com a remodelação microvascular e rarefação, contribuem para a perfusão tecidar comprometida e para a pressão arterialdesregulada 2,3,4. Ensaios ex vivo de vasos isolados são ferramentas poderosas para dissecar os mecanismos celulares e moleculares que controlam o tônus vascular em saúde e doença, pois permitem o controle preciso do microambiente vascular e a manipulação farmacológica seletiva das vias de sinalização do músculo liso e endotelial.

A reatividade vascular em artérias isoladas é comumente avaliada usando duas técnicas complementares ex vivo: miografia por fio e miografia por pressão 5,6. Na miografia de fios, anéis ou segmentos de vaso são montados em pinos ou fios, e a força isométrica é registrada 7,8. Na miografia de pressão, segmentos intactos do vaso são canulados e pressurizados a uma pressão intraluminal definida, e o diâmetro do vaso é acompanhado por microscopiade vídeo 9. Ao contrário da miografia por fio, a miografia por pressão permite o controle da pressão transmural e do fluxo intraluminal. Assim, ele recapitula de forma mais próxima o ambiente hemodinâmico in vivo das artérias de resistência e é comumente usado para estudar o tônus miogênico, respostas mediadas pelo fluxo e propriedades estruturais ou mecânicasvasculares 9,10. Por outro lado, a miografia por fio é tecnicamente mais fácil de implementar (sem canulação ou microscopia de vídeo), suporta maior capacidade de transferência usando sistemas comerciais multicâmara e é bem adequada para gerar curvas farmacológicas de concentração-resposta reprodutíveis em artérias pequenas a médias com diâmetros na ordem de dezenas a várias centenas demicrômetros 5,6. Assim, a miografia por fio é frequentemente preferida para perfilamento farmacológico lado a lado da reatividade vascular em artérias de conduto e resistência isoladas de camundongos ou ratos.

As artérias conduídas (grandes elásticos) e de resistência (pequenas artérias musculares) diferem fundamentalmente em estrutura e função, e essas diferenças determinam considerações experimentais distintas e desfechos. As artérias conduítas (por exemplo, aorta torácica descendente) contêm grandes quantidades de tecido elástico e uma massa muscular lisa considerável; Artérias de resistência (por exemplo, artérias mesentéricas) possuem razões músculo liso para lúmen relativamente maiores e são determinantes principais da resistência periférica e da autorregulaçãolocal 11,12. Como o mesmo agonista pode ativar diferentes respostas moleculares nesses leitos vasculares, a comparação lado a lado dos conduítos e dos vasos de resistência do mesmo animal fornece informações complementares úteis. Por exemplo, nas artérias conduídas, a liberação de óxido nítrico derivada do endotélio é a via relaxante predominante pela qual a acetilcolina (ACh) induzvasorelaxação 13,14. Em contraste, em pequenas artérias resistentes, a ACh induz relaxamento por meio de óxido nítrico, prostaciclina e, importante, fatores hiperpolarizantes derivados do endotélio (EDHF)15,16. Assim, a miografia por fios lado a lado das artérias de conduto e resistência colhidas do mesmo camundongo ou rato permite comparações pareadas que facilitam a detecção de mudanças funcionais específicas do vaso, ao mesmo tempo em que reduzem a variabilidade entre animais.

A interpretação precisa dos dados da miografia em fio depende de uma atenção cuidadosa a um conjunto de variáveis técnicas: composição e oxigenação da solução fisiológica salina (PSS), manuseio e dissecação de tecidos, técnica de montagem, pretensão de repouso ótima (normalização), temperatura do banho e seleção de controles farmacológicosapropriados 6. Normalização refere-se ao procedimento técnico de ajustar o ponto mecânico de operação do vaso para que o desenvolvimento da força ativa seja otimizado e aproxime as condições fisiológicasoperacionais 5. Na prática, para anéis aórticos, é prática comum usar uma pretensão fixa, frequentemente determinada empiricamente para evitar sobredistensão enquanto proporciona respostas estáveis. Para pequenas artérias de resistência, a normalização é realizada primeiro determinando a circunferência interna correspondente a uma pressão transmural equivalente de 100 mmHg (IC100). O recipiente é então ajustado para uma fração definida desse valor para estabelecer a circunferência interna normalizada (IC1). Na prática, muitos protocolos estabelecem IC1 próximo de 0,9 × IC100 para ARM de ratos e cerca de 1,0 × IC100 para ARM de camundongos, embora esses valores possam ser ajustados com base no tipo de vaso, espécie e objetivosexperimentais 5,17.

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Protocolo

O protocolo a seguir segue as diretrizes estabelecidas e foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso Animal do Campus de Ciências da Saúde da Universidade de Toledo.

ATENÇÃO Antes de começar, por favor, siga as diretrizes do Comitê de Cuidado e Uso Institucional de Animais (IACUC) e do Comitê de Biossegurança Institucional (IBC) o tempo todo; usar equipamentos de proteção individual (EPI) adequados; Tenha cuidado ao usar instrumentos cirúrgicos ou outros instrumentos afiados; consultar e cumprir as Fichas de Dados de Segurança (SDS) relevantes ao manusear produtos químicos e tecidos biológicos; manusear o carbogênio como um cilindro de gás pressurizado usando reguladores aprovados e armazenamento seguro; e descartar resíduos biológicos e químicos conforme os procedimentos institucionais.

1. Preparação do tampão de bicarbonato Krebs modificado PSS/modificado (Krebs)

NOTA: Composição do tampão de Krebs (concentrações finais, pH 7,4): 130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mM KH2PO4, 1,6 mMCaCl 2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glicose e 0,03 mM EDTA.

  1. Prepare o estoque de grande volume: dissolva todos os constituintes, excetoNaHCO 3, glicose eCaCl 2 , em água duplamente destilada para formar um caldo. Armazene esse caldo a 4 °C.
  2. No dia do experimento, aliquota o volume necessário de estoque (por exemplo, 1 L), adicione sequencialmente NaHCO3, glicose e CaCl2, e oxigene continuamente com carbogênio (95%O 2/5% CO2).
    NOTA: Para minimizar a precipitação de sal de cálcio, prepare e armazene um estoque deCaCl 2 de 1 M a 4 °C e adicione lentamente o volume necessário ao tampão somente após a dissolução completa do NaHCO3 , mexendo continuamente. Mantenha o carbonato borbulhando durante a adição deCaCl 2 (veja passo 1.3) para reduzir a formação de carbonato de cálcio. Se houver precipitação visível, descarte e prepare um novo tampão.
  3. Para equilíbrio de pH, faça bolhas no tampão com carbogênio por pelo menos 20 minutos, depois meça o pH e ajuste para pH 7,4 se necessário.
    NOTA: pH típico pré-borbulhamento ≈ 7,7; o borbulhamento contínuo reduz o pH para ≈7,4 fisiológicos.
  4. Prepare as câmaras de miógrafo preenchendo-as com tampão Krebs recém-preparado e comece a borbulhar suavemente com carbogênio. Ajuste a taxa de borbulhas para garantir uma troca de gás adequada sem agitação vigorosa.
  5. Reserve um alíquota de Krebs buffer recém-preparado e oxigenado e resfrie no gelo para dissecação de tecido. Aqueça o tampão oxigenado restante a 37 °C (com bolhas contínuas de carbogênio) para uso durante experimentos.

2. Dissecação da aorta torácica descendente e do arco mesentérico

  1. Eutanasie o animal de acordo com as diretrizes da IACUC. Padronize o momento da eutanásia animal e da colheita de tecidos dentro de uma janela de 2 horas para minimizar os possíveis efeitos circadianos.
  2. Abra imediatamente as cavidades torácica e abdominal por meio de uma incisão na linha média e reflita a parede torácica lateralmente para expor o coração e os grandes vasos.
    NOTA: Não realize perfusão sistêmica em condições padrão, pois isso pode causar danos endotelianos inadvertidamente. Além disso, o sangue retido nos vasos mesentéricos aumenta a discriminação visual entre artérias e veias e facilita a avaliação da integridade arterial. No entanto, em alguns modelos patológicos (por exemplo, distúrbios trombóticos), uma perfusão suave e de baixa pressão com um tampão fisiológico heparinizado e gelado pode ser recomendada para eliminar trombos obstruidores enquanto minimiza a lesão endotelial.
  3. Retirar a aorta torácica descendente. Para facilitar a dissecação, remova os pulmões e o esôfago para melhorar a visualização. Não agarre diretamente a aorta torácica descendente; em vez disso, segure suavemente o arco aórtico ou a gordura periadvential, levante levemente e corte cuidadosamente os vasos ramificados intercostais abaixo da aorta. Retirar a aorta torácica descendente cortando pouco antes de passar pelo diafragma e coloque-a em uma placa de Petri revestida a Sylgard contendo um tampão Krebs oxigenado e gelado.
    NOTA: Mantenha a temperatura baixa para minimizar o tom espontâneo e preservar a viabilidade. O Sylgard preto aumenta o contraste para dissecação de vasos.
  4. Elimine toda a arcada mesentérica. Levante delicadamente o arco mesentérico para localizar a artéria mesentérica superior que se ramifica da aorta caudal abdominal até o diafragma. Corte a artéria mesentérica superior proximalmente e libere o arco mesentérico do tecido conjuntivo ao redor sem manipulação direta dos vasos. Coloque a arcada mesentérica em uma placa de Petri separada revestida com Sylgard, contendo um tampão Krebs oxigenado e gelado.

3. Isolamento e montagem de anéis aórticos em miógrafos de pinos

  1. Prenda as extremidades proximal e distal da aorta torácica descendente com pinos de dissecação para endireitar o vaso. Evite esticar demais para evitar danos mecânicos.
    NOTA: Coloque pinos na gordura periadventícia em vez de atravessar a parede do vaso para minimizar os danos.
  2. Sob um estereomicroscópio com fonte de luz externa, remova cuidadosamente a gordura periadventícia e o tecido conjuntivo usando tesouras Vannas finas e pinças. Evite danos à parede do recipiente.
    NOTA: É prática comum remover a gordura periadvential, a menos que o objetivo seja estudar o papel dos tecidos perivasculares adventícios na regulação do tônus vascular.
  3. Corte anéis aórticos de 2 mm, fazendo cortes limpos e perpendiculares. Descarte anéis que estejam perfurados ou visivelmente danificados. Sempre que possível, amostre locais comparáveis entre os animais para minimizar a variabilidade.
  4. Desconecte uma câmara contendo o buffer Krebs oxigenado da máquina de miografia e transporte-a cuidadosamente para o estereomicroscópio.
    NOTA: Agitar a câmara pode afetar o transdutor e alterar os resultados, então segure a câmara com cuidado e coloque-a suavemente.
  5. Sob o estereomicroscópio, use o micrômetro para unir os pinos do miógrafo e deslize o anel aórtico sobre os pinos, minimizando a manipulação da superfície luminal.
  6. Note a leitura do micrômetro com o anel totalmente relaxado; Aplique um leve alongamento para fixar o tecido para o transporte.
  7. Conecte a câmara ao instrumento e restaure o vaso à leitura original do micrômetro.
  8. Depois que todos os anéis são montados, aqueça as câmaras a 37 °C e monitore a temperatura com a sonda fornecida (tipicamente 20-30 minutos para atingir 37 °C).
  9. Zero as leituras de força na interface do usuário, inicie o software de aquisição de dados e comece a gravar.
  10. Aplicar progressivamente pretensão aos anéis aórticos a um valor fixo apropriado para o vaso usando o micrômetro.
    NOTA: Um valor típico de pretensão para anéis aórticos de camundongos é 5 miliNewtons (mN)5. Embora os valores de pretensão relatados para anéis aórticos de rato variem entre os estudos, a otimização prévia suporta uma pretensão de 10 mN neste protocolo18.
  11. Equilibrar os anéis aórticos por 45-60 minutos na pretensão selecionada, com trocas repetidas de tampão usando Krebs de 37 °C.
    NOTA: É comum que anéis aórticos percam parcialmente a tensão e, portanto, exijam ajustes finos da pretensão várias vezes usando o micrômetro antes que a tensão se estabilize.
  12. Zere as leituras de força na interface do usuário antes de iniciar protocolos experimentais.

4. Isolamento e montagem de MRA em miógrafos de fio

  1. Prenda o arco mesentérico em um padrão no sentido horário para endireitar os ramos mesentéricos. Comece fixando o ceco, depois prenda sucessivos trechos do intestino delgado no sentido horário para tensionar suavemente a vasculatura mesentérica sem esticar demais. Substitua o buffer por Krebs novo conforme necessário para remover sangue ou detritos.
  2. Identifique a artéria mesentérica superior no centro do prato, onde os arcadas irradiam.
  3. Selecionar um ARM apropriado para isolamento; Alvos típicos: diâmetro interno de 200-250 μm (determinado posteriormente durante a normalização).
    NOTA: Em animais adultos experimentais, isso geralmente corresponde a ramos desegunda ordem em camundongos e de3 a 4 ramos de ordem em ratos. A ordem dos ramos é definida por bifurcações sequenciais a partir da artéria mesentérica superior. ramos de1ª ordem surgem diretamente da artéria mesentérica superior, ramos de segunda ordem surgem de ramos de 1ª ordem, e assim por diante.
  4. Sob um estereoscópio, disseque a veia acompanhante e remova a gordura periadventícia e o tecido conjuntivo usando tesoura Vannas e pinças finas.
    NOTA: As ARM podem ser diferenciadas das veias por suas paredes mais grossas e lúmenes menores, que são facilmente visualizados pela presença de sangue intraluminal residual.
  5. Relaxe o(s) pino intestinal(es) próximos que esticam a parede intestinal adjacente ao vaso selecionado antes de excisar a artéria para evitar o recuo do vaso.
  6. Retire todo o comprimento do ARM selecionado (deve ter >2 mm de comprimento), fazendo cortes limpos e perpendiculares. Usando pinças finas, segure uma extremidade da artéria e transfira-a para uma placa de Petri limpa contendo um tampão Krebs gelado (pratos comuns, não revestidos com Sylgard, facilitam a montagem posterior). Inspecionar a artéria em busca de danos; A presença de sangue intraluminal facilita a avaliação visual da integridade.
  7. Retirar um segmento de aproximadamente 2 mm de uma região intacta. Descarte quaisquer áreas que tenham sido manuseadas durante o transporte ou que mostrem danos visíveis.
    NOTA: O uso de pratos transparentes, sem revestimento Sylgard, permite a colocação de uma régua sob o prato para medir com precisão o comprimento do recipiente.
  8. Prepare dois comprimentos de 2,5 cm de fio de aço inoxidável de 40 μm para montagem.
  9. Usando pinças finas, passe cuidadosamente os fios, um de cada vez, pelo lúmen para que fio suficiente saia de ambas as extremidades para a montagem. Minimize traumas endoteliais. Após inserir ambos os fios, registre o comprimento exato com uma régua para uso no procedimento de normalização (veja o passo 5.2).
    NOTA: Esta é uma das etapas mais tecnicamente desafiadoras e demoradas do protocolo, exigindo paciência e prática repetida para minimizar os danos endoteliais. Após inserir o primeiro fio, geralmente é mais fácil prender ambos os fios juntos e avançá-los pelo recipiente.
  10. Desconecte uma câmara contendo o buffer Krebs oxigenado da máquina de miografia e transporte-a cuidadosamente para o estereomicroscópio.
  11. Sob o estereoscópio, transfira o MRA (fios de contenção em ambas as extremidades) para a câmara do miógrafo. Usando o micrômetro, junte as mandíbulas do miógrafo para prender as extremidades dos fios entre elas, de modo que a artéria fique suspensa livremente entre elas.
    NOTA: Nesta fase, é recomendável prender os fios de modo que fiquem um sobre o outro. Isso fixa os fios no lugar e evita que eles torçam.
  12. Fixe o fio superior sob os parafusos de fixação no lado próximo do micrômetro, enrolando as extremidades no sentido horário; Repita para o segundo fio do lado do transduttor.
    NOTA: Aperte os parafusos com delicadeza, mas firmeza. Se os parafusos estiverem muito frouxos, o recipiente pode escorregar; Se apertado demais, o fio ou transdutor pode ser danificado. Após prender a primeira extremidade, abra levemente o espaço entre as mandíbulas do miógrafo antes de fixar a outra extremidade para garantir tensão uniforme do fio.
  13. Afaste levemente as mandíbulas e alinhe os fios para ficarem paralelos e coplanares, quase se tocant.
    NOTA: Realize todos os ajustes dos fios afastados do recipiente montado para minimizar os danos.
  14. Repetir a montagem para todos os MRAs.
  15. Aqueça as câmaras a 37 °C e monitore a temperatura (20-30 min típico).
  16. Zere as leituras de força na interface do usuário antes de iniciar o procedimento de normalização.

5. Procedimento de normalização para a ARM

NOTA: Anéis aórticos são montados em uma pretensão fixa e pré-definida. Portanto, não é realizada uma etapa separada de normalização.

  1. Defina parâmetros de normalização no software de aquisição de dados: calibração ocular = 1; pressão alvo = 13,3 kPa (≈ 100 mmHg); circunferência interna normalizada (IC1) = 0,9 para MRAs de ratos e 1,0 para MRAs de camundongos; tempo de média = 2 s; atraso = 60 s.
  2. Insira os parâmetros específicos do vaso no módulo de normalização da seguinte forma:
    1. Para extremidades teciduais (mm): defina a1 = 0 e a2 = o comprimento medido da ARM em milímetros (o comprimento exato registrado durante a excisão).
    2. Diâmetro do fio de entrada: 40 μm.
    3. Leitura do micrômetro: insira o valor de base do micrômetro registrado com o vaso montado e totalmente relaxado.
  3. Inicie o procedimento de normalização esticando passo a passo o MRA montado em incrementos de 50 μm. Após cada alongamento, insira a nova leitura do micrômetro no módulo de normalização e espere 60 s entre os incrementos.
    NOTA: Quedas súbitas de tensão após um ajuste do micrômetro geralmente indicam deslizamento do vaso. Os parafusos de fixação devem ser apertados suavemente, porém firmemente.
  4. Espere o módulo de normalização para representar a tensão da parede em repouso (mN/mm) versus a circunferência interna (μm) e ajuste uma curva exponencial. Usando o micrômetro, continue alongando passo a passo até que a curva de circunferência de tensão intersecte a isóbara de 100 mmHg. Quando próximo à interseção, reduza o tamanho do passo para 10-30 μm para evitar esticar demais o vaso.
  5. Quando a curva intersecta a isobarra de 100 mmHg, observe a circunferência interna calculada por software e ajuste o micrômetro para o valor correspondente calculado pelo módulo para que a preparação fique na circunferência interna normalizada alvo (IC₁).
    NOTA: Ajuste deficiente da curva geralmente indica parâmetros incorretos inseridos no software, como comprimento do tecido, diâmetro do fio ou leituras de micrômetros.
  6. Repita o procedimento de normalização para todos os MRAs montados, depois permita que os vasos se equilibrem por 30-45 minutos com trocas repetidas de tampão usando Krebs de 37 °C.
  7. Zere as leituras de força na interface do usuário imediatamente antes de iniciar os experimentos.
    NOTA: As diferenças de parâmetros chave entre camundongos e ratos são resumidas na Tabela 1.
ParâmetroRatoRato
Valor de Pretensão para anéis aórticos5 mN10 mN
Razão IC1 do alvo para ARM10.9
Ordem típica de ramo MRA para diâmetro interno de 200-250 μm2º3ºao 4º

Tabela 1: Diferenças de parâmetros chave entre camundongos e ratos.

6. Protocolo experimental (sequência de exemplo)

  1. Verificação de viabilidade: Provocar uma resposta contrátil com um desafio despolarizador de alto K⁺ (por exemplo, 120 mM KCl).
    NOTA: O tampão de alto K⁺ (KPSS) é preparado por substituição equimolar de NaCl por KCl do tampão padrão de Krebs para manter a osmolaridade e é continuamente oxigenado com 95% de O2/5% de CO2. Para evitar choque de frio, aqueça o KPSS a 37 °C antes do uso. Composição do tampão KPSS (concentrações finais, pH 7,4): 120 mM KCl, 14,7 mM NaCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mMKH 2PO₄, 1,6 mMCaCl 2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glicose e 0,03 mM EDTA.
  2. Realize pelo menos três lavagens consecutivas com um novo tampão Krebs oxigenado a 37 °C até que uma tensão basal passiva estável seja restaurada.
    NOTA: Todas as etapas de lavagem são realizadas removendo completamente a solução de banho e substituindo-a por um novo tampão Krebs oxigenado a 37 °C. Miógrafos comerciais geralmente possuem uma função de lavagem embutida que drena as câmaras de miografia.
  3. Gerar uma curva concentração-resposta (CRC) cumulativa para a fenilefrina (PE), adicionando concentrações crescentes (exemplo faixa de 10⁻9 a 10⁻4 M). Permita que cada concentração se estabilize antes de adicionar a próxima concentração até que um platô máximo estável seja alcançado.
  4. Realize pelo menos três lavagens consecutivas com um novo tampão Krebs oxigenado a 37 °C até que uma tensão basal passiva estável seja restaurada.
  5. Avaliar a função endotelial: Pré-contrair com uma concentração submáxima de PE, permitir que a resposta se estabilize e então avaliar relaxamento dependente do endotélio com ACh (exemplo de intervalo 10⁻⁹ a 10⁻⁵ M). Permita que cada concentração se estabilize antes de adicionar a próxima concentração até que um relaxamento máximo estável seja alcançado. Registre a relaxação percentual em relação ao tom pré-constrita (veja o passo 7.4). Preparações que apresentem <70% de relaxamento são excluídas.
    NOTA: Doenças da parede vascular, como hipertensão, são comumente associadas à disfunção endotelial, que frequentemente leva a uma resposta de vasorelaxamento dependente do endotélio comprometida àACh 19. Nessas condições, preparações que apresentem <70% de relaxamento não devem ser excluídas automaticamente, pois isso pode representar verdadeira disfunção endotelial relacionada à doença, e não falha técnica.
  6. Realize pelo menos três lavagens consecutivas com um novo tampão Krebs oxigenado a 37 °C até que uma tensão basal passiva estável seja restaurada.
  7. Teste outros agentes vasoativos, com e sem inibidores específicos de vias específicas, conforme exigido pela questão experimental.
  8. Ao final do experimento, remova todos os recipientes montados, limpe todas as câmaras com ácido acético a 8%, seguido por três lavagens de água e, finalmente, desligue o tanque de gás e a máquina.
  9. Descartar resíduos biológicos e químicos de acordo com os procedimentos institucionais.

7. Análise e relatórios de dados

  1. Definição e registro base. Registre a tensão de base imediatamente antes do início de qualquer desafio vasoconstritor (ou seja, desafio de alto K⁺, CRC vasoconstritor ou pré-constrição antes de um CRC vasodilatador).
    NOTA: Para análises subsequentes, é praticamente mais fácil zerar as leituras de força na interface do usuário após lavagem adequada de qualquer estimulação anterior, imediatamente antes do início de qualquer desafio vasoconstritor (ou seja, tensão de base exibida = 0).
  2. Desafio High-K⁺. Calcule a força ativa como: Força ativa = Tom máximo após KCl - Tensão de base (unidades: mN). Expresse a força ativa normalizada para comprimento unitário (mN/mm) ou área da seção transversal (mN/mm2) do segmento arterial montado. A medição da área da seção transversal requer uma análise histológica subsequente dos segmentos da artéria montada para determinar a espessura da parede.
    NOTA: Como os anéis aórticos frequentemente produzem uma resposta não platô, meça a resposta máxima de alto K⁺ dentro de um tempo pré-especificado (por exemplo, 10 minutos) em todas as preparações, para minimizar a variabilidade. Nas ARMs, a resposta máxima de alta K⁺ geralmente é alcançada em segundos após a estimulação.
  3. CRCs contráteis. Para cada concentração em um CRC cumulativo contrátil (por exemplo, PE), calcule a força ativa da seguinte forma. Expresse a força ativa em cada concentração como uma porcentagem da resposta provocada pelo desafio de alto K⁺. Use esses valores percentuais para ajustar CRCs contráteis (veja o passo 7.5).
    Força ativa = Tónus máximo após a aplicação do medicamento - Tensão de base (unidades: mN)
    NOTA: Certas condições podem causar variabilidade nas respostas máximas de alto K⁺ entre preparações (por exemplo, mudanças na massa muscular lisa ou estado de diferenciação resultantes da patologia). Nessas circunstâncias, expresse a força ativa em cada concentração normalizada para comprimento unitário (mN/mm) ou área da seção transversal (mN/mm2) do segmento arterial montado.
  4. CRCs relaxantes. Para CRCs de relaxamento após uma pré-constrição submáxima (tom de pré-constrição), calcule o percentual de relaxamento em cada concentração da seguinte forma. Use esses valores percentuais para ajustar CRCs de relaxamento (veja o passo 7.5).
    Relaxamento = (Tom de pré-constrição - Tom após a aplicação do medicamento) / (Tom de pré-constrição - Tensão de base) × 100.
  5. Ajuste de curva. Para CRCs cumulativos contráteis ou relaxantes, plote o log [concentração do agonista] no eixo x versus a resposta normalizada no eixo y. Ajuste a curva plotada com um modelo logístico de quatro parâmetros usando regressão não linear. Extraia Emax (efeito máximo) e pEC50 (−logEC50) para comparações estatísticas, onde EC50 é a concentração do agonista que produz 50% do Emax.
  6. Apresentação dos dados: Apresente os CRCs normalizados. Para cada um dos pontos de dados na curva, use a média do grupo ± erro padrão da média (SEM) ou desvio padrão (SD). Inclua trilhas originais representativas e forneça uma tabela de parâmetros resumindo os valores Emax e pEC50 (média ± SEM ou SD).
  7. Análise estatística:
    1. Compare as CRCs entre grupos experimentais usando análise de variância por medidas repetidas bidirecionais (ANOVA) com um teste pós-hoc apropriado (por exemplo, Bonferroni). No entanto, verifique as suposições (esfericidade, normalidade) e use abordagens alternativas (por exemplo, modelos de efeitos mistos) quando os dados estiverem ausentes ou desbalanceados.
    2. Compare pEC50 e Emax entre dois grupos experimentais usando um teste t desparelado, ou ANOVA unidirecional se comparar mais de dois grupos experimentais. Alternativamente, utilize testes não paramétricos quando as suposições de homogeneidade e normalidade de variância forem violadas. Defina significância estatística em p < 0,05.

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Resultados

Um esquema que representa o fluxo geral de trabalho da miografia por fio em artérias de conduíte e resistência isoladas de camundongos ou ratos é mostrado na Figura 1. Imagens representativas do isolamento e montagem de um anel aórtico torácico de camundongo e de uma ARM de segunda ordem são mostradas na Figura 2 e na Figura 3, respectivamente. Capturas de tela de software que mostram pro...

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Discussão

A miografia por fio continua sendo uma abordagem poderosa e de alta resolução para interrogar a função vascular ex vivo. Quando executado com cuidado, esse método fornece critérios quantitativos confiáveis que abordam questões biológicas distintas, permitindo uma comparação rigorosa de camas macrovasculares e microvasculares dentro do mesmo animal. Estudos de artérias conduídas revelam mudanças na mecânica arterial global e na reatividade de grandes vasos relevantes para pressão...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

O trabalho foi apoiado por um prêmio do NHLBI (R00 HL153896 a I.O.) e fundos iniciais da Universidade de Toledo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos Centrífugos Cônicos de 15 mLThermo Fisher Scientific14-959-70C
Tubos Centrífugas Cônicas de 50 mLThermo Fisher Scientific14-959-49A
Ácido acéticoThermo Fisher ScientificA490-212
AcetilcolinaMillipore SigmaA6625-100G
Balanço AnalíticoMettler ToledoMX304
CaCl2Thermo Fisher ScientificC79-500
Carbogênio (95% O2/5% CO2)AirgasCD USP50
Microscópio de Dissecação ZEISSZEISS Stemi 305
Placa de Petri de dissecaçãoInstrumentação de Sistemas VivosDD-90-S-BLK
Pinos de dissecaçãoTecnologia Myo dinamarquesa400626
Kit de ferramentas para dissecaçãoTecnologia Myo dinamarquesa101017O kit consiste em tesoura de dissecação (1), tesoura multiuso (1), placas de Petri (5), pinças (3) e pinos de dissecação.
Dumont #5 - Pinça FinaFerramentas Científicas Finas11254-20
EDTAThermo Fisher ScientificBP2482-500
Freezer (-20 ° C)Thermo Fisher ScientificTSG2325FA
Caixas articuladas para freezerUSA Scientific2310-5848
Luvas (Grande)Thermo Fisher Scientific19-041-171D
Luvas (Média)Thermo Fisher Scientific19-041-171C
Luvas (Pequeno)Thermo Fisher Scientific19-041-171B
GlicoseThermo Fisher ScientificD16-500
Cilindro graduadoThermo Fisher Scientific08-572G
GraphPad PrismaGraphPad SoftwareN/AAnálise de dados e apresentação gráfica
Solução de ácido clorídricoThermo Fisher ScientificSA48-1
Balde de GeloThermo Fisher Scientific03-395-156
KClThermo Fisher ScientificP217-500
KH2PO4Thermo Fisher ScientificP380-500
LabChart 8 SoftwareAD InstrumentsN/ASoftware de captura de dados
Refrigeração de LaboratórioThermo Fisher ScientificFBG49RPGA
Fonte de Luz LEDThermo Fisher ScientificAMPSILED21
Agitador magnéticoThermo Fisher ScientificFB30786159
Barras Magnéticas de Agitação (Grandes)Thermo Fisher Scientific14-513-68
Barras Magnéticas de Agitação (Médio)Thermo Fisher Scientific14-513-61
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63-500
Conjunto de Amostragem Micro Colher e EspátulaThermo Fisher ScientificS43322
Tubos MicrocentrífugasUSA Scientific1615-5510
Mini MicrocentrífugaThermo Fisher Scientific07-203-954
Mini-chave de fendaThermo Fisher ScientificNC1349489
Sistema de miógrafo multi-fioTecnologia Myo dinamarquesaDMT 620M
NaCl Thermo Fisher ScientificS271-3
NaHCO3Thermo Fisher ScientificS233-500
Medidor de pHThermo Fisher Scientific01-912-351Inclui medidor de pH, sensor LE420, QuickGuide de instalação e pacote inicial de buffer de pH
Fenilefrina Millipore SigmaP6126-5G
Controlador de PipetaThermo Fisher Scientific01-001-023
Ponteiras de Pipeta em Prateleiras (10 & micro; L)USA Scientific1111-3810
Pontas de Pipeta em Prateleiras (1000 & micro; L)USA Scientific1111-2830
Ponteiras de Pipeta em Racks (200 & micro; L)USA Scientific1111-1810
Garrafas de Armazenamento de Mídia Reutilizável PYREXThermo Fisher Scientific06-414-1D
Pipetas Serológicas (10 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-204
Pipetas Serológicas (25 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-205
Micropipeta de Canal Único Multi-PackThermo Fisher Scientific13-684-2503 pipetas (0,5-10 & mu; L, 10-100 e mu; L, 100-1000 μ L)
Fio de aço inoxidável (40 & mu; m)Tecnologia Myo dinamarquesa400447
TemporizadorThermo Fisher Scientific02-261-840
Sistema de Água Ultra PuraSartoriusH2O-MM-UV-SET-US
Tesoura de Mola VannasFerramentas Científicas Finas15000-00
Frasco volumétricoThermo Fisher Scientific13-756-400
Misturador de vórticesThermo Fisher Scientific10-320-807
Banho-mariaThermo Fisher Scientific07-202-155
Pesando PratosThermo Fisher Scientific02-202-101

Referências

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