Artigo de método

Fluxo de trabalho de criotomografia eletrônica para tecidos espessos demonstrado em hipocampo de camundongos

DOI:

10.3791/70192

⸱

27 de março de 2026

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo padroniza a criotomografia eletrônica (crio-ET) para tecidos espessos, integrando congelamento de alta pressão (HPF) com o método waffle, levantamento por feixe de íons de foco criogênico (crio-FIB) e aquisição paralela e dose-simétrica, resultando em lamelas uniformemente finas e amostras vitrificadas para análise in situ reprodutível no hipocampo do camundongo.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A criotomografia eletrônica (crio-ET) permite visualização 3D da ultraestrutura celular nativa, mas sua aplicação em tecidos espessos é limitada pela falta de vitrificação confiável e preparação de lamelas de baixo rendimento. Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho de ponta a ponta que integra congelamento em alta pressão (HPF; ~2100 bar; tempo de dissecação até congelamento ≤90 s) usando um conjunto "waffle" com folha de cobre em tecido pré-fino, crio-FIB levantamento e afinamento controlado para lamelas de 120–200 nm com compensação por sobreinclinação. O revestimento condutor é padronizado (sputter-Pt 30 mA/15 s; Tampa GIS 0,5–1,0 μm) para minimizar a cortina. Aquisição automatizada de dados dose-simétrica (0°, ±3°, ±6°... até ±60–66°; tamanho de passo de 2–3°; dose total 100–150 e⁻/Å2) é implementada via scripts PACEtomo, com o ângulo inicial de inclinação derivado do ângulo de fresagem e da orientação da amostra. O processamento com o AreTomo 3 fornece funções para correção de movimento, estimativa de CTF, alinhamento e reconstrução de WBP quase em tempo real; O IsoNet pode, opcionalmente, reduzir a anisotropia da cunha faltante. A média subtomográfica (RELION 4.0) segue uma estratégia de pseudo-subtomograma com relatório de resolução baseado em um corte de FSC de 0,143. Demonstrado em hipocampo de camundongos, o fluxo de trabalho produz rotineiramente amostras bem vitrificadas e lamelas uniformes (espessura alvo 150 ± 40 nm) e alcança coleta em série inclinada de alta taxa (tipicamente 5–8 min/tilt series). Esse protocolo oferece uma rota reprodutível para estudar biologia estrutural in situ diretamente a partir de ambientes teciduais complexos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A criotomografia eletrônica (crio-ET) surgiu como uma técnica fundamental para visualizar complexos macromoleculares e arquiteturas celulares em seu estado nativo hidratado 1,2,3,4,5. Ao reconstruir volumes tridimensionais a partir de séries de projeção por inclinação, o crio-ET faz a ponte entre o contexto celular e a resolução quase atômica, oferecendo insights sem precedentes sobre biologia estrutural in situ6. Embora os fluxos de trabalho de criotomografia eletrônica para amostrascelulares 7 (incluindo células diluídas por crio-FIB em suspensões e células aderentes) estejam agora bem estabelecidos, sua extensão direta para tecidos espessos e arquitetonicamente intactos continua sendo altamentedesafiadora 8,9,10. Isso é especialmente verdadeiro para tecidos com alto teor de água, como o cérebro11, onde a vitrificação confiável e a preparação de lamelas transparentes ao elétron (tipicamente <200 nm) continuam a causar gargalospersistentes 12.

Alcançar a vitrificação nos tecidos é desafiador devido ao alto teor de água e à transferência de calor limitada. Embora o congelamento por imersão seja eficaz para amostras finas (≤20 μm)13, ele falha na maioria dos tecidos. O congelamento de alta pressão (HPF) suprime a nucleação do gelo aplicando alta pressão, permitindo a vitrificação de amostras de até ~200 μm em teoria. No entanto, a eficiência da HPF convencional é frequentemente subótima para vitrificar tecidos. Para melhorar os resultados, esforços recentes empregaram estratégias como adicionar crioprotetores14 e realizar pré-secção15,16 (por exemplo, usando um vibratome) para reduzir mecanicamente a espessura da amostra antes docongelamento 11,17. Embora essas abordagens possam melhorar a qualidade da vitrificação, geralmente envolvem manuseio prolongado ex vivo e o uso de aditivos químicos que correm risco de alterar as estruturas nativas. Para abordar essas limitações, este estudo modificou a estratégia de transportadores "waffle" originalmente desenvolvida por Kelley et al.18 ao incorporar uma otimização crítica: o tecido cerebral é fisicamente comprimido usando dois suportes de cobre polido antes do congelamento, o que pré-dilui a amostra enquanto simultaneamente a fixa entre uma grade filmada e uma folha de cobre. Esse design não apenas promove uma vitrificação rápida e uniforme, mas também aumenta significativamente a estabilidade mecânica, prevenindo assim efetivamente a quebra da grade e a perda de amostras durante o manuseio subsequente, estabelecendo uma base sólida para obter amostras de tecido congelado intactas e de alta qualidade.

Após a vitrificação, o desfinamento continua sendo uma grande barreira tanto para o rendimento quanto para a qualidade. Como uma técnica precoce e amplamente adotada, a crio-ultramicrotomia possibilita inúmeros estudos estruturais fundamentais in situ. No entanto, frequentemente introduz artefatos de compressão e corte 19,20 que comprometem a integridade estrutural. Em contraste, a fresagem por feixe de íons criofocalizada (crio-FIB) 21 oferece precisão superior e distorçãomínima 7,22. Inicialmente, a moagem crio-FIB foi aplicada diretamente em amostras vitrificadas em grades para produzirlamelas 23; No entanto, essa abordagem in situ é principalmente eficaz para amostrasfinas 24,25 (por exemplo, células cultivadas ou regiões de tecido periférico) e não podem acessar estruturas mais profundas dentro de tecidos espessos e volumosos. Para superar essa limitação de profundidade, foram desenvolvidas26 estratégias de elevação, permitindo a extração específica do local das regiões de interesse (ROIs) do interior das amostras. Avanços metodológicos subsequentes, incluindo o levantamento serial27 e a seção serializada na grade (SOLIST)28, aprimoraram ainda mais o rendimento, a estabilidade lamelar e a precisão do direcionamento correlativo 3D em tecidos complexos. Mais recentemente, inovações continuaram a avançar o campo, incluindo o método de fixação de seis lados de Tang et al.29, que melhora a estabilização mecânica durante o levantamento e afinamento, bem como abordagens inovadoras de fresagem on-grid de Benjamin C. Creekmore et al.11 que permitem o acesso a estruturas profundas preservando o contexto do tecido nativo. Apesar desses avanços, os protocolos ainda variam em eficiência, reprodutibilidade e adaptabilidade entre diferentes tipos de tecidos. Persiste uma lacuna crítica no estabelecimento de um fluxo de trabalho padronizado, facilmente replicável e amplamente aplicável que integre essas otimizações em um pipeline coerente para diversos tecidos espessos.

Essa lacuna é abordada aqui sintetizando detalhes técnicos chave de metodologias estabelecidas e refinando-os em um pipeline generalizado de ponta a ponta. Esse protocolo não apenas emprega o método HPF-waffle aprimorado para vitrificação robusta, mas também incorpora uma série de etapas otimizadas na crio-FIB de levantamento e afinamento, como compensação sistemática de sobreinclinação, revestimento condutor padronizado e sequências de fresagem calibradas, que coletivamente melhoram a uniformidade das lamelas, reduzem artefatos (por exemplo, cortinas) e melhoram o rendimento. Diferentemente de protocolos adaptados a tipos celulares específicos ou organismos modelo, esse fluxo de trabalho é projetado com generalizabilidade em seu núcleo, fornecendo uma estrutura versátil adaptável a uma ampla gama de tecidos espessos e complexos, incluindo aqueles relativamente macios e propensos à compressão, além do hipocampo de camundongos demonstrado.

Demonstrado no modelo desafiador do hipocampo de camundongo, notável por sua suscetibilidade a danos por gelo e complexidade estrutural, esse fluxo de trabalho integrado e generalizado produz de forma confiável lamelas de alta qualidade (120–200 nm) e suporta a aquisição eficiente por série inclinada (5–8 min/série). Essa consolidação das melhores práticas em um protocolo coerente, acessível e amplamente aplicável fornece uma estrutura reprodutível que reduz a barreira técnica para a implementação do crio-ET em pesquisas de tecidos espessos em diversos contextos biológicos e biomédicos.

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Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo tecido animal estavam em conformidade com o SUSTech IACUC (Protocolo SUSTech-JY202501019). Os regentes e os equipamentos utilizados estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de suporte de amostras

  1. Preparação do transportador HPF (ver Figura 1A)
    1. Obtenha um par de suportes HPF de cobre de 6 mm (tipo B). Certifique-se de que um dos transportadores tenha uma superfície plana.
    2. Molhar a superfície plana do transportador e depois moer. Primeiro, use lixa de grão 8000 até que as marcas originais de usinagem sejam completamente removidas. Depois, troque para lixa de grão 12000 e continue lixando até que os riscos da etapa anterior sejam praticamente eliminados, resultando em um acabamento uniformemente liso. A Figura 2 mostra imagens típicas da superfície do suporte durante o processo de moagem e polimento.
    3. Polir a superfície desmontada usando um pano metalográfico macio e pasta de diamante W0.5: primeiro, aplique a pasta no pano, depois polia a superfície em movimento circular por 1–2 minutos até obter um acabamento liso e altamente polido. Enxágue bem o suporte com etanol, seguido de água destilada para remover todos os resíduos abrasivos.
    4. Submerga os portadores polidos em 1-hexadeno por pelo menos 4 horas (ou durante a noite) antes do uso.
      NOTA: Transportadores polidos e tratados podem ser armazenados submersos em 1-hexadeceno.
      ATENÇÃO: O 1-hexadeceno é inflamável e prejudicial se inalado; funcione em uma exaustão com EPI.
  2. Preparação da grade de suporte TEM (ver Figura 1B)
    1. Use grades de cobre de 100 malhas com um filme contínuo de suporte Formvar/carbono.
    2. Repasse com dourado em ambos os lados das grades usando um revestimento por pulverização: ajuste a corrente para 50 mA e cubra cada lado por 120 s para obter uma camada de aproximadamente 6 nm por lado.
  3. Preparação de folha de cobre (ver Figura 1C)
    1. Obtenha folha de cobre de alta pureza com espessura de 1 μm.
      NOTA: A condutividade térmica do cobre varia com a pureza, e uma pureza menor resulta em menor condutividade térmica. Portanto, é necessário folha de cobre de alta pureza (≥ 99,9%).
    2. Perfure a folha de cobre em discos com diâmetro de 3 mm usando um furador circular.

2. Congelamento em alta pressão

  1. Coloque uma gota de 10 μL de solução de sacarose a 10% sobre uma superfície de vidro limpa.
  2. Dissecar rapidamente o hipocampo de um rato recém-eutanasiado. Extire pequenos pedaços de tecido de aproximadamente 0,5–1mm 3 usando uma lâmina afiada (ver Figura 1D).
  3. Transfira o tecido para as grades TEM de suporte de cobre (100 malhas) dentro do suporte HPF usando um palito de dente ou escova fina. Use 2-metilbutano (isopentano) para manobrar suavemente o tecido no lugar, minimizando o estresse mecânico na grade.
    ATENÇÃO: O 2-Metilbutano (isopentano) é extremamente inflamável. Manuseie em uma exaustão sem fontes de ignição.
  4. Cubra o tecido e a grade com um disco de folha de cobre de 3 mm de diâmetro. Complete a montagem colocando o segundo suporte HPF (plano para baixo) em cima para formar o sanduíche "waffle" selado ( veja a Figura 1E).
    NOTA: A folha de cobre desempenha uma função mecânica crítica no conjunto do waffle. Ele encaixa o tecido entre a grade TEM e a própria folha metálica. Durante a montagem, essa configuração aplica uma pressão suave, ajudando a formar uma fatia de tecido mais fina e uniforme, ideal para vitrificação. Além disso, a folha previne a perda de tecido durante o manuseio e ajuda a distribuir a pressão durante congelamento sob alta pressão, reduzindo o risco de quebra da grade. Após o congelamento, a folha também facilita a separação dos portadores da grade da amostra vitrificada. No entanto, esse método de preparação pode causar danos por compressão mecânica e pode não ser adequado para amostras sensíveis a artefatos induzidos por pressão. Para essas amostras, técnicas alternativas de corte que alcancem espessura adequada sem compressão, como a seção por vibrátomo ou a perfuração da amostra, devem ser consideradas.
  5. Inicie imediatamente o procedimento de congelamento em alta pressão de acordo com o protocolo operacional do fabricante. Defina a pressão alvo para ~2100 bar e garanta que o tempo total desde a dissecação do tecido até o congelamento não exceda 90 s.
    NOTA: Todo o procedimento, desde a dissecação até o congelamento, deve ser concluído em até 90 segundos para minimizar alterações estruturais associadas ao tempo prolongado ex vivo . A faixa de espessura do tecido para cérebros é de cerca de 20–40 μm.

3. Freinagem e levantamento da FIB

NOTA: Realize os seguintes passos usando um microscópio de feixe duplo equipado com um estágio criogênico. Mantenha a temperatura da amostra abaixo de -170 °C durante todo o tempo.

  1. Preparação da grade do receptor
    1. Obter uma nova grade dourada de 300 malhas para servir como a grade receptora final para o procedimento de levantamento.
    2. Sob um estereomicroscópio em temperatura ambiente, prenda suavemente a grade em um anel AutoGrid crio-FIB compatível.
    3. Armazene o AutoGrid montado diretamente em um forno seco mantido a aproximadamente 40 °C para minimizar o acúmulo de geada antes do uso.
      NOTA: Durante o clipping, certifique-se de que a grade fique plana e centralizada para evitar curvatura ou desalinhamento.
  2. Recolha e montagem da grade de tecido vitrificado
    1. Enquanto imersos continuamente o conjunto em nitrogênio líquido (LN₂), separe cuidadosamente a grade TEM vitrificada (contendo o tecido e a folha de cobre) dos componentes do conjunto "waffle" ao redor.
      NOTA: O espaçador de folha de cobre normalmente facilita a separação da grade dos suportes.
    2. Em uma estação de trabalho pré-refrigerada com carregamento criogénico, monte a grade de tecido isolado em um segundo anel AutoGrid crio-FIB sob proteção LN₂.
  3. Grades de co-carga no ônibus auxiliar crio-transferido
    1. Carregue ambos os AutoGrids nos slots designados do ônibus crio-transferente.
    2. Oriente cada AutoGrade de modo que a entalhe de fresagem fique voltada para fora e fique vertical.
    3. Mantenha o shuttle carregado sob imersão LN₂ ou pré-resfriado até a transferência para o microscópio FIB/SEM.
  4. Localização e revestimento condutor na FIB/SEM
    1. Após a criotransferência para o microscópio, navegue até a grade de tecido com baixa ampliação de SEM.
    2. Aplique um revestimento condutor e protetor em toda a superfície da grade.
      1. Recubra a superfície da grade com platina (Pt) a 30 mA durante 15 s.
      2. Deposite uma cápsula organometálica de Pt com 0,5–1,0 μm de espessura usando o Sistema de Injeção de Gás (SIG).
      3. Aplique uma camada final de Pt revestida por sputter na superfície da grade a 30 mA por 15 s.
        NOTA: A tampa GIS é fundamental para reduzir artefatos de cortina.
  5. Isolamento e levantamento de blocos de tecido (veja Figura 3)
    1. Seleção e orientação do local
      1. Navegue até a região selecionada de interesse (ROI) na grade de tecido usando a imagem do feixe de elétrons SEM.
      2. Oriente a amostra para fresagem frontal. Uma posição típica do estágio é ajustada para 110° de rotação e inclinação de 7°, e essa posição apresenta a superfície da amostra em um ângulo adequado para acesso ao feixe de íons.
        NOTA: Na ausência de marcadores fluorescentes, pode ser empregada uma estratégia de pré-triagem. Essa estratégia visa localizar a região tecidular-alvo e excluir áreas contendo crioprotetores ou outros componentes não tecidulares. Após selecionar uma região aparentemente livre de gelo superficial, moer uma pequena vala de teste usando uma corrente de feixe maior (por exemplo, 15 nA a 30 kV) na orientação padrão do lado frontal e polir usando uma corrente de feixe menor (por exemplo, 1 nA a 30 kV). Mude para o feixe de elétrons para examinar a seção eficaz: o tecido apresenta excelente contraste sob o feixe de elétrons, uma característica particularmente pronunciada em estruturas membranosas e regiões ricas em elementos pesados; Em contraste, o crioprotetor normalmente apresenta contraste uniforme sob o feixe de elétrons. Isso permite uma verificação rápida antes de prosseguir com o procedimento completo de levantamento.
    2. Fresagem de vala para isolar o bloco (Figura 3A)
      1. Defina uma trincheira retangular ao redor do bloco de tecido alvo usando o feixe de íons operado a 30 kV.
      2. Comece a fresar a certa distância do bloco usando uma corrente relativamente alta de 15 nA para alcançar a rápida remoção do material.
      3. À medida que as paredes da trincheira se aproximam do bloco com uma precisão de poucos micrômetros, reduza a corrente do feixe de íons para 7 nA. Reduzir a corrente alcança um controle mais preciso e minimiza os danos causados pelo feixe de íons e o aquecimento do material biológico na região de interesse.
      4. Deixe um lado do bloco preso ao material a granel como uma "aba" para mantê-lo no lugar temporariamente.
    3. Fresagem opcional por baixo para blocos grossos (Figura 3B)
      1. Para blocos de tecido com espessura estimada superior a 20 μm, execute uma etapa de fresagem por baixo pelo lado reverso para facilitar o levantamento final.
      2. Gire o palco (por exemplo, até -70°) e ajuste a inclinação do palco (por exemplo, para 23°) para acessar a parte inferior do bloco.
      3. Frese a conexão inferior usando a FIB a 30 kV e corrente de 3 nA.
    4. Fixação na agulha do micromanipulador (Figura 3C)
      1. Para fixar a amostra na agulha, execute padrões sequenciais de fresagem em seção transversal.
        NOTA: O bloco de ouro pode ser extraído da barra de uma grade de ouro de 300 malhas.
    5. Levantamento do bloco de tecido (Figura 3D)
      1. Corte a "tabla" restante que conecta o bloco à amostra a granel usando a FIB (30 kV, 1 nA).
      2. Manobre cuidadosamente a agulha do micromanipulador para levantar o bloco de tecido agora isolado, de modo que fique completamente livre da trincheira e da grade original ao redor. Depois, retrai a agulha e transporte o bloco até a grade do receptor.
    6. Transferência de blocos, soldagem e re-revestimento
      1. Navegue a agulha até uma grade de receptor dourada pré-resfriada de 300 malhas.
      2. Baixe o bloco em um quadrado escolhido na grade. Coloque o bloco de tecido em contato com o filme na grade e levante o bloco verticalmente para quebrar o contato. Frese uma fatia de ~3–4 μm de espessura do bloco para o filme da grade usando o feixe de íons (30 kV, 1 nA) (Figura 3E).
        NOTA: Se houver detritos de gelo, pré-limpe o local de fixação com um padrão retangular (30 kV, 50 pA). Certifique-se de que o bloco entre em contato com o filme da grade para reduzir a carga eletrostática, que pode deslocar aleatoriamente a fatia.
      3. Soldar a fatia de forma segura usinando padrões de seção transversal de limpeza em ambos os lados da junção (30 kV, 30 pA) (Figura 3F).
      4. Reaplique o revestimento condutor/protetor conforme descrito no Passo 3.4.2 (Figura 3G).
        NOTA: Para esta etapa de revestimento GIS, a duração pode ser reduzida dependendo do tamanho do bloco.
    7. Afinamento por lamela
      1. Gire o estágio (por exemplo, até -70°) e ajuste uma inclinação inicial do estágio (por exemplo, 15°) (Figura 3H).
        NOTA: O suporte da amostra apresenta uma pré-inclinação de 45°.
      2. Defina a posição final da lamela dentro de uma área lisa do bloco de tecido.
        NOTA: Confirme que a área selecionada está livre de contaminação por gelo.
      3. Realize fresagem sistemática usando as correntes do feixe de íons especificadas na Tabela 1. O progresso é feito de correntes maiores para menores à medida que o plano-alvo é aproximado (Figura 3I,J). Opcionalmente, quando a menos de 1–2 μm da lamela, uma vala de alívio de tensão pode ser fresada aproximadamente 1,5 μm para evitar a dobra ou o enrolamento dalamela 30,31.
        NOTA: Quando o material restante está dentro de ~1 μm do plano alvo, limite a espessura removida a cada passada.

4. Coleta de dados crio-ET

  1. Após a preparação bem-sucedida da lamela, carregue cuidadosamente a grade em um microscópio eletrônico de transmissão (TEM) equipado com um suporte criogênico, um filtro de energia e software de tomografia (por exemplo, SerialEM).
  2. Adquira um mapa atlas de toda a grade (por exemplo, Figura 4A; ampliação típica é 155×).
  3. Navegue até a posição da lamela e adquira um mapa de montagem (por exemplo, Figura 4B; ampliação típica é 3600× com desfoco de -100 μm).
  4. Definir a ampliação nominal da gravação e verificar se o tamanho do pixel é adequado para a resolução pretendida; no presente estudo, foi usado um tamanho de pixel de 2,109 Å. Ajuste os parâmetros correspondentes de iluminação, incluindo tamanho do ponto, diâmetro da abertura C2 e área de iluminação, para alcançar uma taxa de dose otimizada para o detector direto de elétrons.
  5. Configure as condições de foco e de iluminação de teste para corresponder às definidas para o parâmetro Record.
  6. Realize a coleta de dados usando os scripts32 do PaceTomo, seguindo os passos abaixo:
    1. Pré-selecione alvos no mapa de montagem usando a função "adicionar pontos" no navegador, garantindo que a primeira característica apresente contraste suficiente.
    2. Selecione alvos usando o PACEtomo_selectTargets.py script32, ajustando a área em destaque na ampliação de prévia, se necessário. Regiões típicas de interesse são apresentadas na Figura 4C.
    3. Adquira séries de inclinação usando um esquema dose-simétrico (por exemplo, 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... até ±60°–66°) com um incremento de 2° ou 3°. Defina os parâmetros de aquisição no script PACEtomo.py: o ângulo inicial de inclinação é determinado pelo ângulo de fresagem especificado no Passo 3.7.1 (ou seja, 8°), com seu sinal dependendo da orientação da carga da amostra no crio-EM; os ângulos mínimo e máximo de inclinação referem-se a valores absolutos; e o tamanho do passo corresponde ao incremento de inclinação (por exemplo, 3°).
      NOTA: Esse ângulo inicial de inclinação foi projetado para posicionar a lamela horizontal e perpendicular ao feixe de elétrons. Se o ângulo de fresagem for desconhecido, incline a imagem para exibir a lamela em sua maior altura aparente; isso fornece um alinhamento suficientemente preciso.
    4. Mantenha uma dose acumulada de elétrons de 100–150 e⁻/Å 2 distribuída por todas as inclinações. Se disponível, use um filtro de energia com largura de fenda de 10 eV.
    5. Inicie a aquisição de dados. Focalização e rastreamento automatizados são implementados em cada ângulo de inclinação. O tempo típico de aquisição para uma série de inclinação única é de 5 a 8 minutos.
      NOTA: Um guia de solução de problemas é fornecido na Tabela 2.

5. Processamento de dados

  1. Processo de Correção de Movimento por Inclinação, Estimativa CTF, Alinhamento e Reconstrução de Tomograma 3D usando o AreTomo3 33 para realizar três etapas principais: (1) correção de movimento dos quadros brutos, (2) estimativa da função de transferência de contraste (CTF) para cada imagem inclinada e (3) alinhamento da série completa de inclinação.
    1. Após o alinhamento, reconstrua tomogramas tridimensionais (3D ) por meio do algoritmo de retroprojeção ponderada. As entradas necessárias para essa etapa incluíam: quadros de imagem brutos, arquivos de metadados mdoc (que documentam parâmetros de aquisição da série de inclinação) e o eixo de rotação pré-determinado da amostra.
  2. Correção de cunha ausente
    1. Após a reconstrução, submetam os tomogramas gerados à correção de cunha ausente usando IsoNet34.
  3. Seleção e curadoria de partículas
    1. Realize a seleção de partículas em EMAN 2.935 usando o método de correspondência de templates. Após a seleção automática, falsos positivos (ou seja, regiões não-alvo ou regiões selecionadas erroneamente) foram excluídos manualmente para garantir a qualidade do conjunto de partículas selecionado.
  4. Média subtomográfica
    1. Importe a série de inclinação e suas coordenadas correspondentes de partículas para o RELION 4.0. Realize a média de subtomogramas seguindo o fluxo de trabalho padrão descrito na documentação RELION 4.0 (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html), que garante a adesão às melhores práticas estabelecidas para reprodutibilidade.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A aplicação bem-sucedida desse protocolo permite a produção de lamelas teciduais vitrificadas de alta qualidade e a subsequente reconstrução de tomogramas que revelam a ultraestrutura celular nativa. Os seguintes resultados, demonstrados usando tecido hipocampal de camundongo, são representativos de um experimento bem-sucedido.

Blocos de tecido processados por congelamento de alta pressão com o método "waffle" apresentavam uma aparência uniforme e transparente...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O fluxo de trabalho aqui apresentado estabelece um pipeline generalizado, otimizado e reproduzível para tomografia crioeletrônica in situ de tecidos nativos e espessos. Sua principal contribuição não está na invenção de técnicas singulares, mas na integração sistemática, refinamento e padronização detalhada de todo o processo, desde a vitrificação robusta usando um método modificado de waffle-HPF até um protocolo de crio-FIB de levantamento e afinamento calibrado com precisão. E...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem à equipe do Centro de Crio-EM da Southern University of Science and Technology pelo apoio técnico. Este projeto foi apoiado pela National Science and Technology Innovation (Brain Science and Brain-like Intelligence Technology – National Science and Technology Major Project, Grant No. 2022ZD0211905) e pela National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32200998 e No. 32161133022).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1-HexadecenoSigma-AldrichH2131Produtos químicos e Reagentes
2-MetilpentanoSigma-AldrichM65807Produtos químicos e Reagentes
Anel de clipeThermo Fisher Scientific1131750; 1188953Consumíveis
Folha de cobreMateriais Metálicos Fengcheng1 & micro; M espessuraConsumíveis
Suporte de cobre TEM Grids (100 malhas)Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., LtdBZ10021bConsumíveis
Cryo-EMThermo Fisher ScientificKrios G4Equipamentos 
Crio-FIBThermo Fisher ScientificAquilos 2Equipamentos 
Autograde Crio-FIBThermo Fisher Scientific1205101Consumíveis
Grades (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 mesh)QuantifoilAltrAufoilConsumíveis
Freezer de Alta PressãoLeica MicrosystemsEM ICEEquipamentos 
Transportadora HPF, cobreLeica Microsystemstipo B (6 mm)Consumíveis
Revestimento de Íon SputterQuórumQ150RS plusEquipamentos 
Pasta de polimento metalográficaLab-testecW0.5Consumíveis
Polimento de tecidoGORALB00809Consumíveis
LixaLixa da Marca Eagle8000 grão, 12000Consumíveis
EstereoscópioLeica MicrosystemsS9iEquipamentos 
SacaroseSigma-Aldrich200-334-9Produtos químicos e Reagentes
Software de Aquisição da Série Tilthttps://bio3d.colorado.edu/SerialEM/SerialEM 4.0.9Software
Alinhamento e Alinhamento da Série Tilt Software de Reconstruçãohttps://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 AreTomo 3Software
Software de Aquisição da Série Tilthttps://github.com/eisfabian/PACEtomoPaceTomoSoftware
Alinhamento e Alinhamento da Série Tilt Software de Reconstruçãohttps://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNetIsoNetSoftware
Alinhamento e Alinhamento da Série Tilt Software de Reconstruçãohttps://github.com/cryoem/eman2EMAN2Software
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Referências

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