Quantificação das Alterações em Bifidobactérias e Unidades Formadoras de Colônias de Lactobacilos Durante o Tratamento com Rifaximina e Gel Sintbiótico em Voluntários Saudáveis

Summary

Este ensaio clínico avaliou as contagens de bifidobactérias e lactobacilos após 1 semana de tratamento com rifaximina e um gel sinbiótico composto por Lactobacillus acidophilus NCFM e Bifidobacterium lactis Bi07, com inulina de agave, durante o tratamento com rifaximina e 4 semanas depois, em comparação com um gel placebo, mostrando que o gel sinbiótico pode ajudar a manter lactobacilos e bifidobactérias.

Abstract

Embora a microbiota intestinal seja geralmente estável, ela pode ser influenciada pelo tratamento antibiótico. A rifaximina, usada para tratar distúrbios gastrointestinais, é frequentemente administrada junto com probióticos para reduzir o risco de disbiose. Lactobacillus acidophilus interage com células intestinais e utiliza compostos prebióticos. Bifidobacteria, particularmente Bifidobacterium infantis ssp. lactis Bi07, é um probiótico associado a efeitos benéficos no intestino. Estudos in vitro demonstraram a superioridade dos frutanos de agave sobre a inulina da chicória. Nenhum estudo documentou alterações nas contagens fecais de lactobacilos e bifidobactérias após a administração concomitante de rifaximina e sintióticos. Nosso objetivo foi avaliar alterações na contagem de UFC de bifidobactérias intestinais e lactobacilos em voluntários saudáveis após o consumo do Gel Sintbiótico, que contém Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 e inulina de agave como prebiótico, durante 1 semana de tratamento com rifaximina e por 4 semanas depois. Em um ensaio clínico randomizado, controlado com placebo e duplo cego, participantes saudáveis sem tratamento antimicrobiano no mês anterior foram randomizados 1:1 em dois grupos (10 participantes por grupo). O grupo Gel Sinbiótico recebeu 10,32 g de inulina de agave como prebiótico e 4 × 10 CFU^/g de Lactobacillus acidophilus NCFM e 4 ×^{10 UFC/g} de Bifidobacterium lactis Bi07 por dia, durante 5 semanas, e 200 mg de rifaximina duas vezes ao dia durante a primeira semana. O grupo do Gel Placebo recebeu gel placebo por 5 semanas e 200 mg de rifaximina duas vezes ao dia durante a primeira semana. As alterações bacterianas foram estimadas quantificando a CFU por meio de avaliação microbiológica das fezes. Cinco semanas depois, as populações de lactobacilos e bifidobactérias não mudaram. A detecção de Lactobacillus acidophilus NCFM e Bifidobacterium lactis Bi07 em algumas amostras de fezes sugere colonização transitória e parcial, destacando a necessidade de estudos dose-resposta com esse produto sinbiótico.

Introduction

A microbiota intestinal humana é uma comunidade densamente povoada que inclui espécies nativas permanentemente presentes e outros microrganismos transitórios. Embora sua composição possa variar entre indivíduos, geralmente é considerada estável. No entanto, pode ser influenciado pela idade, infecção e tratamento com^{antibióticos 1,2,3}. A rifaximina, um antibiótico de amplo espectro com baixa absorção intestinal, é usada para tratar distúrbios intestinais e pode alterar a microbiota. Bactérias probióticas dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium são usadas para mitigar esses^{efeitos 2}.

Cepas de Bifidobacterium spp. foram relatadas como resistentes à^{rifaximina 2}, o que tem um efeito interessante de promover uma biota intestinal contendo populações de Bifidobacterium spp. em número suficiente para efeitos probióticos benéficos.

Além disso, Lactobacillus acidophilus é amplamente reconhecido por sua capacidade de interagir com o epitélio^{gastrointestinal 4} e sua capacidade de utilizar prebióticos, como polissacarídeos, oligossacarídeos e frutooligossacarídeos. No entanto, apenas algumas cepas probióticas, como a cepa Lactobacillus acidophilus North Carolina Food Microbiology (NCFM), foram identificadas. Portanto, estudar seus efeitos in vivo é importante, assim como a presença de Bifidobacterium lactis Bi07 no trato gastrointestinal, que tem sido associada a vários benefícios para a saúde ^2,5. Esses probióticos requerem um prebiótico para crescerem de forma ideal, por isso um bibiótico contendo tanto um probiótico quanto um prebiótico funciona de forma sinérgica; ou seja, seu efeito favorável é maior do que o do probiótico sozinho. Juntamente com os prebióticos, que servem como substratos para probióticos, espera-se que essa simbiose aumente a sobrevivência dos microrganismos probióticos no trato gastrointestinal, levando a uma maior restauração da^{microbiota 6}.

Uma fonte importante de prebióticos são os frutanos de agave, que têm relatos de efeitos in vitro superiores na microbiota do que os da raiz de chicória (Cichorium intybus L.)⁷. Estudos relataram os efeitos do consumo de probióticos; por exemplo, Engelbrektson et al. avaliaram se o consumo de probióticos durante e após a administração do antibiótico poderia reduzir as alterações na microbiota causadas pelos^{antibióticos 8}. Eles descobriram que o grupo que recebeu a mistura probiótica apresentou uma recuperação mais rápida da microbiota normal do que aqueles sem a^{microbiota 8}. Além disso, Koning et al. estudaram a disbiose na microbiota intestinal de 40 voluntários saudáveis tratados com 500 mg de amoxicilina duas vezes ao dia durante 7 dias e a possível recuperação da microbiota após o consumo de uma mistura probiótica. Os resultados mostraram que o tratamento com amoxicilina afetou a composição da microbiota nativa. Quando uma mistura probiótica foi administrada, a microbiota se recuperou significativamente após dois meses de consumo⁹.

No entanto, a literatura relata que nenhum estudo investigou o efeito do consumo de sinbióticos (com frutanos de agave como prebiótico) na microbiota intestinal durante e após a administração de antibióticos, como rifaximina; Encontramos apenas estudos com probióticos. Portanto, este estudo avaliou alterações na contagem de UFC de bifidobactérias intestinais e lactobacilos em voluntários saudáveis após o consumo de Gel Sinbiótico, que contém Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 e inulina de agave como prebiótico, durante 1 semana de tratamento com rifaximina e por 4 semanas depois.

Protocol

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional para Pesquisa Biomédica em Humanos (CIIBH) do Instituto Nacional de Ciências Médicas e Nutrição Salvador Zubiran (INCMNSZ) (REFERÊNCIA 1734). Todos os participantes forneceram consentimento informado antes de serem incluídos neste estudo.

Desenho do estudo e população

Este foi um ensaio clínico randomizado, controlado por placebo, duplo-cego, com um período de acompanhamento de 5 semanas. Trabalhadores do INCMNSZ foram convidados a participar do estudo, e voluntários saudáveis de 20 a 50 anos sem tratamento antimicrobiano no mês anterior, que aceitaram e assinaram o formulário de consentimento informado, foram incluídos entre 2011 e 2012. Os participantes do estudo foram randomizados 1:1 para o grupo Gel Sinbiótico com 10,32 g de inulina de agave como prebiótico e 4 ×^{10 9} UFC/ g de Lactobacillus acidophilus NCFM e 4 ×^{10 9} UFC/g de Bifidobacterium lactis Bi07 por dia, contidos em 4 sachês por 5 semanas, e 200 mg de rifaximina duas vezes ao dia durante a primeira semana. O grupo do Gel Placebo recebeu 4 embalagens de 15 g de gel placebo, com a mesma apresentação e características sensoriais do Gel Sinbiótico, por 5 semanas, e 200 mg de rifaximina duas vezes ao dia durante a primeira semana (Figura 1).

Avaliação clínica

Em ambos os grupos de estudo, os sintomas e a aparência das fezes foram avaliados usando a Escala de Bristol. Peso, altura e índice de massa corporal (IMC) também foram medidos. Um diário foi utilizado para avaliar o consumo de gel sinbiótico, gel placebo e rifaximina, além de registrar a presença ou ausência de efeitos colaterais relacionados à ingestão de gel.

Consumo de fibra

A ingestão de fibras foi avaliada usando um diário alimentar e uma chamada de 24 horas por semana em ambos os grupos.

Adesão ao Tratamento

A adesão ao consumo de rifaximina e gel foi avaliada contando o número de doses de rifaximina e o número de sachês de géis sintbióticos e placebo consumidos por participante. A presença de Lactobacillus acidophilus e Bifidobacterium lactis foi detectada por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).

Avaliação Microbiológica das Fezes

Na consulta 0 e semanalmente em 5 consultas (6 consultas) em cada grupo, os números de Lactobacilos, Bifidobactérias e Enterobactérias foram avaliados em 120 amostras fecais pelo método de contagem de placas. Este método mede as unidades formadoras de colônias (UFC) colocando amostras diluídas sobre meios sólidos^{especializados 10}. Amostras de fezes eram coletadas no início de cada visita.

Para identificar microrganismos, amostras fecais foram coletadas e armazenadas em tubos BBL. O frasco de PBG era usado para bactérias anaeróbias, e amostras fecais eram transportadas em um resfriador de isopor contendo pacotes de gel congelados para manter uma temperatura baixa antes do processamento no laboratório. A tampa do frasco de PBG para coprocultura foi removida, e a amostra de fezes foi coletada usando um swab, garantindo que o swab fosse impregnado com a amostra. O aplicador era então colocado em um tubo contendo um meio sólido de cultura.

Para bactérias anaeróbias, os frascos eram pesados e 5–10 g de fezes eram coletados usando uma colher. As fezes foram então misturadas com o conteúdo do frasco e bem secradas. Para o processamento da amostra, os frascos contendo as amostras e os sacos Stomacher estéreis eram pesados. A amostra foi esvaziada em um saco, centrifugada por 60 s, e então 4,5 mL de água peptona a 0,1% foram adicionados. Posteriormente, 500 μL da amostra foram transferidos para um frasco e vórtices para homogeneizar a mistura. Após 100 μL da amostra foram inoculados em duplicado em cada placa do meio seletivo específico, meio Man Rogosa Sharpe (MRS) para lactobacilos e meio DP Beerens com cisteína + cicloheximida (para eliminar flora indesejada) para bifidobactérias, até diluição 8 (fator de diluição 0,1 mL). Para enterobactérias, o meio MacConkey foi usado nas diluções 5–8 (fator de diluição 0,1 mL), onde as colônias bacterianas foram separadas e^{quantificadas 11}. Cada pó do meio era dissolvido em água destilada purificada, a solução era aquecida até ferver para garantir a dissolução completa, e era esterilizada em um autoclave a 121 °C por 15 minutos. A mistura foi resfriada a 46,5 °C para realizar a técnica de despejamento da placa, despejando 1 mL por placa em duplicado em placas de Petri estéreis contendo 15–20 mL de meio de cultura, permitindo que as placas solidificassem. As amostras inoculadas foram incubadas a 37 °C em uma atmosfera enriquecida com CO₂ em sistemas anaeróbicos GasPak para manter condições anaeróbicas por 24–48 horas. As unidades formadoras de colônias (CFU) foram marcadas com uma caneta e contadas¹². A seguinte fórmula foi aplicada:

CFU/mL = (número de colônias × fator total de diluição)/volume de cultura revestida (mL)

Identificação das características morfológicas de lactobacilos e bifidobactérias

A mancha de Gram foi usada para identificar as características morfológicas do espécime. Uma amostra das colônias bacterianas de cada cepa era colocada em uma lâmina de microscópio, tingida com violeta cristalina por 1 minuto e depois enxaguada com água destilada. Uma solução de iodo foi aplicada por 1 minuto e depois enxaguada com água destilada. Uma solução de álcool e acetona foi usada por 10 segundos como descolorante e enxaguada com água destilada. Por fim, a safranina foi aplicada como contra-tingimento por 1 minuto e enxaguada com água destilada. As lâminas do microscópio foram observadas sob um microscópio óptico usando óleo de imersão com um objetivo de 100x.

A quantificação total foi realizada usando reação em cadeia da polimerase convencional (PCR) em amostras fecais selecionadas aleatoriamente de cinco participantes por grupo, obtendo um total de 60 amostras ao longo de 5 semanas. Isolados de meios de cultura foram processados para extração de material genético. A PCR foi realizada usando primers bacterianos universais para amplificar um fragmento do gene 13 do rRNA^16S. Os produtos PCR eram purificados e sequenciados. As sequências foram verificadas e enviadas ao banco de dados GenBank para confirmar a presença de cepas lactobacilus e bifidobacterianas isoladas das amostras fecais.

Análise estatística

Os dados são apresentados como frequências absolutas e relativas ou mediana (p25-P75). A gravidade acumulada dos sintomas foi determinada usando o escore de Likert (leve, 1; moderado, 2; grave, 3) em cada acompanhamento. Comparações entre grupos foram realizadas usando o teste de soma de ranks de Wilcoxon e o qui-quadrado ou teste exato de Fisher. Comparações intra-grupos entre as semanas 0 e 5 foram realizadas usando o teste de Friedman e comparações múltiplas com Durbin-Conover. A significância estatística foi definida em P < 0,05.

Results

Vinte voluntários saudáveis foram divididos aleatoriamente no grupo do Gel Sinbiótico (n = 10) e no grupo do Gel Placebo (n = 10) (Figura 2 e Tabela 1). No grupo do Gel Sinbiótico, sete eram homens e três mulheres, com idade mediana de 31 anos (faixa de 27–35 anos); no grupo do Gel Placebo, três eram homens e sete mulheres, com idade mediana de 33 anos (faixa de 28–38 anos). Os grupos eram semelhantes em idade, sexo, peso e ...

Discussion

No presente estudo, encontramos uma redução significativa nas contagens de enterobactérias nas amostras fecais de participantes do grupo placebo a partir da primeira semana de intervenção e nos participantes do grupo Gel Sinbiótico na primeira e segunda semanas. Essa mudança pode ser explicada usando rifaximina, que tem sido descrita como mitigação do crescimento bacteriano^{patogênico 14}. Em nosso estudo, o grupo do Gel Sinbiótico após a rifaximina mostrou efeito p...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo BBL	NA	NA	Qualquer marca pode ser usada
Médio DP	NA	NA	Qualquer marca pode ser usada
Pacotes de gel congelados
Meio MacConkey	NA	NA
MRS médio	NA	NA	Qualquer marca pode ser usada
Frasco de PBG			Tamponador de fosfato, gelatina, sais 0,05% cisteína como agente redutor para 02
Placas de Petri
Mistura de Placebo	KuragoBiotek-Bebê Gato.	NA	Mesmas propriedades físicas e sensoriais do gel symiotic, mas sem os ingredientes ativos
Contener de isopor
Mistura simbiótica	KuragoBiotek-Bebê Gato.	NA	Produto não lácteo composto por Lactobacillus acidophilus NCMF e Bifidobacterium infantis Bi-07 (2 x 109  CFU/g), e 17,2 g de inulina de agave como prebiótico em um pacote de 15 g