Um Protocolo para Enriquecimento Baseado em Tamanho de Gotejos Lipídicos de Células Epiteliais Mamárias Bovinas e Tecidos Mamários

Resumo

Esse protocolo visa alcançar a separação e o enriquecimento das gotículas lipídicas com base em tamanho, por meio de centrifugação sequencial, permitindo uma investigação precisa e reprodutível dos mecanismos do metabolismo lipídico e dos processos biológicos associados a gotículas.

Resumo

Este protocolo descreve uma abordagem sequencial de centrifugação diferencial para enriquecer gotículas lipídicas (LDs) de diferentes tamanhos a partir de células epiteliais mamárias bovinas (BMECs) e tecidos mamários, permitindo análise resolvida por tamanho além dos métodos convencionais de isolamento de LD em massa. Como centros reguladores dinamicamente do metabolismo lipídico intracelular, os LDs cumprem funções críticas ao armazenar lipídios neutros (como triglicerídeos e ésteres de colesteril) e coordenar sua síntese, hidrólise e transporte. Eles desempenham um papel central na manutenção da homeostase energética, no suporte à biogênese da membrana e na facilitação da transdução celular do sinal. A extração de LD é essencial para investigar os mecanismos regulatórios do metabolismo lipídico. Estudar o metabolismo lipídico das glândulas mamárias tem implicações significativas para o desenvolvimento infantil, saúde humana, economia agrícola e biologia celular fundamental. Portanto, descrevemos um método diferencial de centrifugação para extrair LDs de BMECs e tecido das glândulas mamárias. Em contraste com as abordagens convencionais de isolamento de LD em massa, esse protocolo permite o enriquecimento baseado em tamanho das subpopulações de LD ajustando sequencialmente as forças centrífugas. A integridade e o enriquecimento relativo das frações de LD são avaliados preliminarmente usando coloração BODIPY493/503, fornecendo uma abordagem prática e reprodutível para análises posteriores do metabolismo lipídico e processos associados a LD.

Introdução

Gotículas lipídicas (LDs) são organelos dinâmicos dentro das células que servem como locais primários de armazenamento para lipídios^{neutros 1}. O acúmulo anormal de LDs está associado a uma ampla gama de doenças, indo além da obesidade e incluindo condições como doença hepática^{gordurosa 2}, doenças^{cardiovasculares 3}, diabetes⁴ e câncer⁵. Por outro lado, um número insuficiente de LDs também pode ter consequências graves, levando à perda de reservas de energia celular e consequentes comprometimentos^{funcionais 6}. No contexto da economia agrícola, LDs insuficientes em ruminantes podem resultar em secreção inadequada de gordura do leite, levando à depressão da gordura do leite, o que, por sua vez, compromete o valor nutricional e a comercialização dos produtos^{lácteos 7}. Atualmente, a regulação do metabolismo do LD emergiu como uma área significativa de pesquisa.

O desenvolvimento de técnicas de extração para LDs desde o século XX tem visado consistentemente extrair LDs em maiores quantidades, com maior pureza e melhor preservação da atividade biológica. Isso envolve o estabelecimento e otimização contínua de metodologias. Atualmente, várias empresas desenvolveram kits comerciais para LD^{separation 8}. Embora esses kits reduzam muito o tempo de separação e exijam apenas o uso de centrífugas convencionais, para amostras difíceis de dissociar, o reagente não pode ser ajustado, e é difícil otimizar as etapas do teste. Além disso, a extração de LDs desempenha um papel indispensável na elucidação dos mecanismos das doenças, incluindo os de doenças metabólicas como fígado^{gorduroso 9}, câncer¹⁰ e doenças neurodegenerativas¹¹, servindo como uma sonda multidimensional para decifrar vias patológicas. As composições de proteínas e lipídios também podem ser dissecadas extraindo LDs para revelar a diversidade das funções biológicas das^{LDs 12}.

A formação de gordura do leite não é apenas um processo de degradação do substrato; ao contrário, representa um processo altamente orquestrado de síntese e embalagem lipídica realizado por células epiteliais mamárias. ¹³. A geração de gordura leiteira em vacas leiteiras depende do mecanismo de secreção da membrana apical dessas células: os triglicerídeos sintetizados no retículo endoplasmático formam LDs citoplasmáticas, que são então transportados para a membrana apical e secretados por meio da gemação. Durante esse processo, os LDs são envolvidos por uma membrana de glóbulos de gordura do leite derivada da membrana apical, resultando na formação de glóbulos de gordura do leite estruturalmente^{estáveis 14}. A glândula mamária bovina serve como um modelo clássico para estudar a lactação em mamíferos, e os mecanismos centrais que regem a síntese e secreção de LD são altamente conservados^{em humanos 15}. Estabelecer métodos para extrair LDs tanto de BMECs quanto de tecido mamário pode fazer a ponte entre a produção pecuária e a saúde humana. Análises proteômicas e lipidômicas dos LDs extraídos podem ser posteriormente aproveitadas para melhorar a produção e a qualidade do leite, garantindo segurança e proteção.

O método atual baseia-se principalmente na característica de baixa densidade das LDs, que faz com que elas flutuem até o topo do gradiente durante a^{centrifugação 16}. O procedimento de extração consiste em três etapas principais: coleta da amostra, ultracentrifugação para flutuação por LD e lavagem por LD. Sacarose (2,5 M) é adicionada ao buffer para proteger os LDs, a velocidade de centrifugação é então ajustada de acordo com os requisitos experimentais; normalmente, LDs grandes podem ser enriquecidos em forças abaixo de 10.000 x g, enquanto velocidades maiores (acima de 10.000 x g) são empregadas para extrair LDs pequenos, pois LDs maiores podem romper nessas condições. Por fim, os LDs extraídos passam por múltiplas lavagens para evitar contaminação, e a pureza da extração é avaliada preliminarmente usando coloração BODIPY493/503.

Métodos convencionais de isolamento de LD alcançam principalmente a recuperação em massa de populações heterogêneas de LD, limitando a análise de diferenças estruturais e funcionais dependentes do tamanho. O protocolo atual estende as abordagens padrão ao permitir o enriquecimento baseado em tamanho das subpopulações de LD por meio de centrifugação diferencial sequencial, facilitando a investigação do crescimento da LD, renovação, tráfico intracelular e utilização diferencial por vias lipolíticas ou autofágicas. Essa abordagem alcança enriquecimento em vez de purificação absoluta, e pode ocorrer sobreposição parcial entre frações de tamanho devido a distribuições contínuas de tamanho e propriedades físicas compartilhadas.

Protocolo

Determine o tamanho da gotícula lipídica alvo para enriquecimento (Figura 1).

1. Configuração do reagente

1. PBS: Peso 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 3,58 g de Na₂HPO₄·12H₂O e 0,24 g KH₂PO₄ em 800 mL ddH₂O. Ajuste o pH para 7,4 com HCl, misture bem e leve o volume para 1 L. Armazene a 4 °C por até 1 ano após o autoclav.
2. Sacarose (2,5 M): Pese 856 g de sacarose e dissolva-a em 400 mL de ddH₂O. Mexa bem até que a sacarose esteja completamente dissolvida, depois ajuste o volume para 1 L. Autoclave a solução e armazene a 4 °C por até 3 meses.
3. Tampão A: Pese 1,79 g de Tricine e dissolva em 400 mL de ddH₂O. Ajuste o pH para 7,8 com KOH. Após o ajuste do pH, adicione 50 mL de solução pré-preparada de sacarose de 2,5 M. Misture bem e ajuste o volume para 500 mL. Após o autoclav, o buffer pode ser armazenado a 4 °C por até 3 meses.
4. Buffer B: Pesa 0,95 g HEPES, 1,49 g KCl e 0,038 g MgCl₂·6H₂O separadamente em 180 mL ddH₂O. Ajuste o pH para 7,4 com KOH, misture bem e leve o volume para 200 mL. Após o autoclave, armazene a 4 °C por até 3 meses.
5. PMSF (1.000x, 0,2 M): Pese 0,175 g de PMSF e dissolva em 5 mL de DMSO. Armazene protegido da luz a -20 °C por até um ano.
   NOTA: A PMSF é altamente tóxica; Medidas de proteção adequadas devem ser tomadas. Durante a preparação, certifique-se de proteção completa contra luz; O PMSF é difícil de dissolver e pode ser aliquotado em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.

2. Extração de LDs das células

1. Cultura do BMEC
   1. Retire cinco tubos de células BMEC congeladas da geladeira de -80 °C e descongele-as rapidamente em um banho-maria a 37 °C. Centrifuge os tubos a 250 x g por 4 min 30 s após o descongelamento completo.
   2. Descarte o meio de criopreservação com um pipetista, adicione 1 mL de FBS a 10% para ressuspender as células, misture e adicione delicadamente as células a um prato de cultura celular de 100 mm contendo 6 mL de FBS a 10%. Embale suavemente o recipiente para garantir uma distribuição celular uniforme e incube a 37 °C com 5% de CO₂.
   3. Monitore a morfologia celular ao microscópio e realize a subcultura quando as células atingem 80%–90% de confluência.
      NOTA: Garanta a condição ideal das células e número suficiente de células antes da extração do LD para melhorar o rendimento e a reprodutibilidade.
   4. Descarte o meio de cultura original na placa de Petri com uma pipeta e adicione 1 mL PBS ao longo da parede de cada placa. Depois de lavar duas vezes, adicione 1 mL de tripsina a cada recipiente e incube a 37 °C por 3 min 30 s.
   5. Observe se as células estão completamente digeridas ao microscópio, adicione 1 mL de FBS a 10% para interromper a digestão após a conclusão da digestão. Resspense suavemente as células pipetando, transfira-as para um tubo de microcentrífuga de 2 mL e centrifuge a 250 x g por 4 min 30 s.
   6. Descarte o sobrenadante e repita os procedimentos descritos no Passo 1.2.
   7. Expanda as células usando aproximadamente 30 recipientes de cultura ou vasos de cultura maiores, ou use placas de cultura maiores para cultura celular. Adicione 150 μmol/L de t10,c12-CLA (diluído em DMEM) para tratar as células na noite anterior à extração. Use 7 mL de meio de cultivo por recipiente de cultura de 100 mm. O tempo de cultura depende do tamanho dos LDs que precisam ser separados.
      NOTA: Com base na otimização prévia, trate BMECs com t10,c12-CLA por 6 horas para enriquecer grandes LDs ou por 12–24 horas para enriquecer LDs pequenos. Como as células contêm poucos LDs, ácidos graxos exógenos geralmente são adicionados para induzir o acúmulo de LDs. Neste estudo, adicione t10,c12-CLA às células cultivadas para induzir o acúmulo de LDs.
2. Coleta de amostras
   1. Descarte o meio original, adicione 1 mL de PBS gelado e lave 3 vezes. Não descarte PBS durante a lavagem final. Usando 30 pratos de células de 100 mm como exemplo, coletar células de cada 10 placas em um tubo centrífugo de 15 mL, cada tubo contém aproximadamente 1x108, resultando em um total de 3 tubos centrífugas.
      NOTA: Mantenha todas as amostras a ≤4 °C durante todo o processo de extração para evitar a degradação das proteínas em LDs.
   2. Após o balanceamento, centrifuge a 1.000 x g, 4 °C por 10 minutos.
   3. Descarte o PBS. Adicione 10 mL de Buffer A pré-preparado e 10 μL de PMSF (1.000x, 0,2 M) ao tubo da centrífuga. Misture bem e incube no gelo por 20 minutos.
3. Lise celular e fracionamento inicial
   1. Células disruptivas usando um homogeneizador ultrassônico do tipo sonda operavam em ciclos pulsados de 5 s LIGADO e 10 segundos DESLIGADO, resultando em um tempo total efetivo de sonicação de 10 minutos ao longo de um período de 30 minutos. Ajuste o instrumento para 40% de potência (correspondendo a uma amplitude da sonda de aproximadamente 76 μm) usando uma sonda de 3 mm de diâmetro.
      NOTA: Mantenha as amostras no gelo durante todo o procedimento para evitar superaquecimento.
   2. Centrifuge o homogenado a 3.000 x g e 4 °C por 10 minutos para remover núcleos e detritos celulares. Colete o sobrenadante como o sobrenadante pós-nuclear (PNS).
4. Ultracentrifugação de LDs flutuantes
   1. Filtre o sobrenadante por um filtro de célula de 100 μm.
   2. Pipete 10 mL de PNS em um tubo centrífugo de 15 mL. Adicione 2 mL de sacarose (2,5 M) e 2 mL de Buffer B sequencialmente ao topo do PNS (o volume de sacarose pode ser reduzido adequadamente enquanto aumenta o volume do Buffer B para aumentar a pureza do LD), e então centrifuge pela primeira vez (5.000 x g, 4 °C, 20 min).
   3. Após a centrifugação, recolha a camada leitosa e cremosa de LD no topo do tubo. Para coletar LDs, primeiro adicione 100 μL de Buffer B a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, depois use uma pipeta de 20 μL para aspirar suavemente a camada flutuante de LD várias vezes, coletando o máximo possível de LDs.
      NOTA: Os LDs formam uma camada flutuante de creme no topo; Evite aspirar a solução subjacente o máximo possível para evitar contaminação.
   4. Realize uma segunda centrifugação (10.000 x g, 4 °C, 30 min) e colete os LDs.
   5. Transfira a solução para um tubo ultracentrífuga compatível com um rotor de balde oscilante, tape-o e balanceie os tubos. Realize a terceira centrifugação em uma ultracentrífuga (50.000 x g, 4 °C, 40 min) e colete os LDs.
      NOTA: Balancear tubos com precisão (até 0,0001 g) para garantir a operação segura da ultracentrífuga.
   6. Após o balanceamento, realize a quarta centrifugação (150.000 x g, 4 °C, 50 min) para continuar coletando LDs. Otimize velocidade e duração de acordo com o tamanho alvo de LD.
      NOTA: Centrifugações prolongadas ou repetidas em alta velocidade podem interromper as LDs. Em contraste, a centrifugação de curta duração a 10.000 x g durante a lavagem remove principalmente impurezas e tem impacto mínimo na integridade do LD. Esse método é adaptável; Otimização pode ser necessária para diferentes tipos celulares ou tecidos.
5. Lavar LDs
   1. Resuspenda os LDs coletados no Buffer B frio e centrifuge a 10.000 x g e 4 °C por 5 minutos.
   2. Remova cuidadosamente o sobrenadante e repita a etapa de lavagem pelo menos quatro vezes usando o mesmo volume de tampão, força centrífuga e tempo de centrifugação. Para LDs pequenos, aumente a força centrífuga conforme necessário para garantir uma separação eficiente.
   3. Após a lavagem final, acumule as frações de LD, misture delicadamente e armazene a −80 °C.
      NOTA: Não omita as etapas de lavagem, mesmo que alguma perda de lúcido lúcido seja inevitável. Continue lavando até não restar mais resíduos visíveis da membrana.

3. Extração de LDs do tecido

1. Coleta de amostras
   1. Recolha amostras de tecido mamário bovino a partir de nitrogênio líquido. Pese 5 g de papel e descongele no gelo até não restar cristais de gelo.
   2. Enxague o tecido com PBS ou soro fisiológico.
   3. Pique o tecido em pedaços de 1 a 2 mm usando tesoura cirúrgica.
   4. Transfira o tecido picado para um argamassa pré-resfriado contendo 12 mL de Buffer A e 10 μL de PMSF (1.000x, 0,2 M). Moa a mistura no gelo por aproximadamente 10 minutos.
   5. Incube o homogeneado no gelo por 20 minutos.
   6. Após uma moagem minuciosa, recolha o homogenado em um tubo centrífugo de 15 mL.
   7. Centrifuge a 2.500 x g, 4 °C por 10 minutos. O sobrenadante resultante é a PNS.
2. Ultracentrifugação de LDs flutuantes
   1. Filtre o sobrenadante por um filtro de célula de 100 μm.
   2. Pipete 10 mL de PNS em um tubo centrífugo de 15 mL. Adicione 2 mL de sacarose e 2 mL de Buffer B sequencialmente. Realize a primeira centrifugação (4.000 x g, 4 °C, 20 min). Colete o material leitoso, parecido com creme.
   3. Realize uma segunda centrifugação (7.000 x g, 4 °C, 30 min) e colete os LDs.
   4. Realize uma terceira centrifugação (10.000 x g, 4 °C, 40 min) e colete os LDs.
   5. Transfira o sobrenadante para um tubo SW40 e realize a ultracentrifugação (50.000 x g, 4 °C, 50 min). Colete os LDs.
   6. Realize uma quinta centrifugação (100.000 x g, 4 °C, 60 min). Colete os LDs.
3. Lavar LDs
   Consulte o método de lavagem para LDs extraídos por células.

4. Validação preliminar da pureza do DS por coloração

1. Prepare 10 μg/mL solução de corante fluorescente lipídico neutro com antecedência sob condições de proteção à luz (BODIPY: Buffer B = 1:100, V/V).
2. Adicione uma quantidade apropriada de LDs mistos e o Buffer B em um tubo de microcentrífuga. Em condições de proteção à luz, adicione uma quantidade adequada de solução fluorescente lipídica neutra. Misture bem e incube por 10 minutos.
3. Prepare uma lâmina limpa para microscópio. Dispense 2,5 μL da mistura sobre o coverslip. Coloque delicadamente a lâmina sobre a mistura, evitando bolhas de ar. Observe sob um microscópio de fluorescência invertida.

5. Validação da pureza do LD por Western blot

1. A concentração de proteínas das frações de LD foi medida usando um kit de ensaio de proteínas BCA.
2. Para análise Western blot, misture 20 μg de proteína de cada amostra com 5x SDS carregando o tampão e aqueça a 99 °C por 10 minutos para garantir a desnaturação completa.
3. Em seguida, separe as proteínas por SDS–PAGE em géis de poliacrilamida com gradiente de 10% de acordo com seus pesos moleculares.
4. Após a eletroforese, transfira as proteínas para membranas PVDF pré-ativadas e depois bloqueie com 5% de BSA em temperatura ambiente por 1,5 h. Subsequentemente, incubo as membranas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários, incluindo anti-Perilipina 2 (1:500) e anti-β-actina (1:5000).
5. Lave as membranas três vezes com 1x TBST por 10 minutos cada, depois incube com anticorpo secundário anti-coelho conjugado com HRP (1:5000) por 1,5 h em temperatura ambiente.
6. Após três lavagens adicionais com TBST, detecte bandas proteicas usando um kit de quimioluminescência (ECL) aprimorada e visualize com um sistema de imagem em gel.

6. Pontos de pausa e diretrizes de armazenamento

1. Mantenha a PNS no gelo por até 1–2 horas antes da ultracentrifugação.
2. Mantenha os LDs coletados no gelo por até 1–2 horas antes de lavar. Para armazenamento de curto prazo, armazene os LDs a 4 °C por até 24 horas. Para armazenamento de longo prazo, armazene as LDs a −80 °C e limite os ciclos de congelamento-descongelamento a no máximo um para preservar a integridade da LD.
3. Durante todas as pausas experimentais, mantenha as amostras no gelo com tampas de tubo fechadas para minimizar a contaminação.

7. Solução de problemas

1. Camada flutuante fina: ajuste o volume do buffer ou a força de centrifugação.
2. Flutuação ruim: aumente a velocidade de centrifugação ou estenda o tempo.
3. Contaminação: garanta manuseio estéril e tampões filtrados.
4. Ruptura do LD: mantenha as amostras no gelo, reduza a força de centrifugação ou resspense suavemente.

Resultados

Fluxo de trabalho e estrutura metodológica
Um esquema de árvore de decisão (Figura 1) foi estabelecido para guiar a seleção das condições de centrifugação de acordo com os objetivos experimentais. Especificamente, forças centrífugas ≤10.000 x g foram usadas para enriquecer grandes LDs (≥2 μm), enquanto forças >10.000 x g foram aplicadas para enriquecer LDs pequenos (<1 μm). Esse arcabouço fornece uma base prática para al...

Discussão

Os LDs são organelos únicos caracterizados por um núcleo lipídico neutro cercado por uma monocamada de fosfolipídios. Eles brotam a partir do retículo endoplasmático e mudam dinamicamente de tamanho e número, facilitando o transporte intracelular e a comunicação extensa com outras estruturas subcelulares para coordenar a homeostase lipídica^celular 17,18,19. Esse comportamento dinâmico é ainda ma...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,25% tripsina-EDTA	Gibco	25200072	reagente
Kits de Preparação Rápida em Gel 10% PAGE	Beijing BIOMAN	PG112	reagente
100 & mu; Filtro de células M	Beyotime	FSTR100	reagente
Prato de cultura celular de 100 mm	Corning	490167	reagente
Amersham Imager 600	GE Ciências da Vida em Saúde	600	Equipamento
Autoclave	Panasonic	MLS-3751L	Equipamento
Kit de ensaio proteico BCA	Beijing Dingguo.	BCA01	reagente
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	reagente
Centrífuga	Eppendorf		Equipamento
DMEM	HyClone	SH30022.01	reagente
DMSO	Solarbio	D8370	reagente
Soro fetal bovino	Gibco	2492319	reagente
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	reagente
Anticorpo secundário anti-coelho conjugado com HRP AffiniPure	Proteintech	SA00001-2	reagente
KCl	HUSHI	20030666	reagente
KH2PO4	HUSHI	10017608	reagente
MgCl2	HUSHI	20059028	reagente
Na2HPO4· 12H2O	HUSHI	S112623	reagente
NaCl	HUSHI	10019328	reagente
Buffer de Carregamento Instantâneo de Proteína Omni-Easy	Tecnologia Biomédica da Epizima de Xangai	LT101S	reagente
Kit de Detecção de Quimioluminescência Ultra-Sensível Omni-ECL	Tecnologia Biomédica da Epizima de Xangai	SQ201	reagente
PBS	HyClone	SH30256.01	reagente
Penicilina & Estreptomicina 100 e mais vezes;	NCM Biotech	CLOOC5	reagente
Medidor de pH	METTLER TOLEDO	S220K	Equipamento
Pipeta	Eppendorf		Equipamento
PMSF	Coolaber	CP8651	reagente
Kit de Transferência de Membrana PVDF	GenScript	eBlot L1	reagente
Coelho anti-Perilipina 2	Abcam	15294-1-AP	reagente
Coelho anti-β-actina	Proteintech	20536-1-AP	reagente
Microscópio de fluorescência invertida de grau de pesquisa	Olympus	IX73	Equipamento
Sacarose	Solarbio	S8271	reagente
SW 40 Ti Rotor	BECKMAN COULTER	331301	Equipamento
Ácido linoleico conjugado Trans-10, cis-12	CAYMAN	90145	reagente
Tricine	Coolaber	CT11331	reagente
Ultracentrífuga	BECKMAN COULTER	Optima XE-100	Equipamento
Britador de células ultrassônicas	SCIENTZ	JY92-11N	Equipamento