Artigo de método

Lactilação de Lisina Específica para Local via Expansão do Código Genético em E. coli e Células de Mamíferos

DOI:

10.3791/70209

⸱

24 de fevereiro de 2026

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology Center for Chinese Medicine, School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo estabeleceu um método que utiliza a expansão do código genético para incorporar com sucesso a lactil-lisina (Klac) em locais específicos da enolase-1 humana (hENO1) e da GFP superfolder (sfGFP) em Escherichia coli e células de mamíferos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A lactilação é uma modificação pós-translacional (PTM) recentemente descoberta com diversas funções biológicas. Desde sua identificação inicial em 2019 como regulador da polarização dos macrófagos, a lactilação de histonas emergiu como um elo fundamental que conecta o metabolismo celular à regulação funcional. Bioquimicamente, envolve a transferência covalente de um grupo lactil para resíduos de lisina, mediada seja por lactiltransferases usando lactil-CoA como doador de acila ou por aminoacil-tRNA sintetases (AARSs) via um intermediário lactil-AMP. Por meio desses mecanismos, os níveis intracelulares de lactato estão diretamente acoplados à modificação e função das proteínas. A lactilação mede uma série de processos celulares críticos, desde funções fisiológicas como regulação gênica, reparo de DNA, reprogramação metabólica e modulação imunológica até processos patológicos como progressão tumoral e metástase. Apesar da identificação de inúmeros sítios de lactilação pela proteômica, alcançar a lactilação de lisina específica por mutagênese continua sendo desafiador. Para resolver isso, empregamos tecnologia de expansão do código genético, utilizando uma aminoacil-litina tRNA sintetase específica para lactil-lisina (KlacRS) e seu tRNA cognato para incorporar precisamente a lactillisina (Klac) em resíduos designados. Essa estratégia permite a geração de variantes proteicas homogeneamente lactiladas para estudos funcionais diretos. Aqui, descrevemos um protocolo simplificado para a lactilação proteica específica do local, validado tanto em Escherichia coli (E. coli) quanto em células de mamíferos, usando enolase-1 humana (hENO1) e GFP superfolder (sfGFP) como sistemas modelo.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A lacetilação da lisina (Klac), originalmente identificada nas histonas, emergiu como um nó chave que liga o metabolismo tumoral aberrante à regulaçãoepigenética 1. O acúmulo de lactato resultante do aumento da glicólise aeróbica nas células tumorais fornece uma base metabólica para a lactilação, permitindo que o lactato atue não apenas como um subproduto metabólico, mas como uma molécula sinalizadora que modula diretamente a função das proteínas. Evidências crescentes indicam que a lactilação participa amplamente da iniciação e progressão tumoral ao coordenar a proliferação de célulascancerígenas 2,3,4,5, metástase6, reprogramação metabólica7 e resistência terapêutica 8,9.

No nível fenotípico, a lactilação elevada está intimamente associada ao aumento da agressividade tumoral. Por exemplo, no carcinoma de células renais de células claras (CCRC), a lactilação do H3K18 promove a proliferação e a metástase ao aumentar o receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas β (PDGFRβ), estabelecendo um ciclo de retroalimentação positiva entre o acúmulo de lactato e a sinalizaçãooncogênica 10. De forma semelhante, no câncer colorretal (CRC), a lactilação elevada do H3K18 impulsiona a progressão tumoral por meio da transcrição aprimorada do potenciador de autofagia do tipo Rubicão (RUBCNL), promovendo assim a maturação do autofagossomo e apoiando a sobrevivência das célulascancerígenas 11.

Além dos efeitos diretos sobre a agressividade tumoral, a lactilação também meda a reprogramação metabólica tumoral ao modular a expressão e atividade de genes relacionados aometabolismo 7. No câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), a lactilação de histonas regula a baixa enzimas relacionadas à glicólise enquanto aumenta as enzimas do ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), aumentando a captação de glicose nas células tumorais e agravando a desregulaçãometabólica 12. Consistentemente, o perfil global de lactiloma revela que a lactilação direciona preferencialmente enzimas envolvidas nas vias metabólicas centrais, incluindo metabolismo da glicose, ciclo da TCA, metabolismo de aminoácidos/ácidos graxos, e essas modificações se correlacionam fortemente com fenótipostumorais agressivos 7.

Importante destacar que as consequências biológicas da lactilação são altamente dependentes do local, e essa modificação se tornou um determinante-chave da resistência terapêutica tumoral. Na CRC, a lactilação por K673 da recombinação meiótica 11 (MRE11) potencializa a reparação da recombinação homóloga (HR), conferindo assim resistência à quimioterapia e aos inibidores da poli(ADP-ribose) polimerase (PARP) 13. No glioblastoma (GBM), a interação entre o membro da família aldeído desidrogenase-1 A3 (ALDH1A3) e a piruvato quinase M2 (PKM2) eleva a produção de lactato, induzindo subsequentemente a lactilação K247 da proteína complementar cruzada de reparação de raios X (XRCC1) para potencializar a reparação de danos ao DNA, promovendo assim a radioresistência e a quimioresistência à temozolomida (TMZ) 14. Esses estudos destacam coletivamente que o controle preciso da lactilação em resíduos definidos de lisina é essencial para a dissecação mecanicista e o direcionamento terapêutico.

Avanços em espectrometria de massa de alta resolução revelaram ampla lactilação em enzimas metabólicas, fatores de transcrição e transdutores de sinalização, ressaltando seu amplo papel no controle do metabolismo, transdução de sinais e fisiologiacelular 15,16,17,18. Até o momento, várias enzimas escritoras que catalisam a lactilação foram relatadas – por exemplo, AARS1 media a lactilação p53 para promover atumorogênese 19, e AARS1/2 regula a lactilação do cGAS para suprimir a imunidade inata – mas essas enzimas são seletivas em relação ao substrato e atualmente não conseguem alcançar a lactilação totalmente específica do local em proteínasarbitrárias 20. Assim, o campo continua desafiado quanto a como manipular Klac de forma direcionada para fins de pesquisa ou terapêuticos.

Estudos funcionais ainda dependem predominantemente da mutagênese dirigida ao local — tipicamente substituindo uma lisina (K) por glutamina (Q) para imitar o estado não carregado das modificações acil-lisina como acetilação oulactilação 21,22,23,24. No entanto, essa abordagem apresenta limitações significativas para recapitular fielmente a lactilação nativa: a estrutura química e a geometria da cadeia lateral da glutamina diferem das de uma lisina lactilada e, importante, uma substituição K por Q não pode distinguir entre estados acetilados e lactilados quando ambas as modificações podem ocorrer no mesmo local.

A expansão do código genético (ECG) oferece uma solução poderosa para essas limitações ao permitir a incorporação direta de aminoácidos não canônicos em proteínas em locais definidos. Por meio de triagem positiva de uma biblioteca mutante Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthetase (MmPylRS), identificamos anteriormente uma variante que apresentava crescimento dependente de Klac. Este mutante, com mutações L301M, Y306L, L309A e C348F, foi designado KlacRS125,26. KlacRS1 aminoacila seu tRNA ortogonal cognato com Klac, suprime o codon oclusivo âmbar e permite a incorporação eficiente e específica do local de Klac nas proteínas-alvo. Além do KlacRS1, várias outras variantes de aaRS capazes de incorporação de Klac foram relatadas, incluindo o LacKRS derivado do MbPylRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) e o LacKRS3 (Y271M/C313S)19,27, além de um LacKRS derivado do MmPylRS (C348T/Y384F)28. Juntas, essas ferramentas estabelecem um conjunto genético versátil para produzir variantes de proteína lactilada específicas para local, a fim de entender as consequências biológicas dos eventos individuais de lactilação.

Em nossos estudos anteriores, aplicamos esse sistema baseado em GCE para expressar proteínas ALDOA portadoras de lactilação específica do sítio em Lys147 tanto em células de E. coli quanto em células de mamíferos. Análises funcionais demonstraram que a lactilação em Lys147 exerce um efeito de retroalimentação negativa sobre a glicólise, aumenta a estabilidade térmica e química do ALDOA e promove sua translocação do citoplasma para o núcleo. Esses resultados não apenas revelaram um mecanismo regulatório anteriormente não reconhecido da ALDOA, mas também validaram a robustez, versatilidade e utilidade prática desta plataforma de lactilaçãosite-specific 25,26. Com base nessa base, aqui usamos enolase-1 humana (hENO1) e superfolder GFP (sfGFP) como exemplos representativos para descrever uma estratégia simplificada para incorporação precisa de Klac usando nosso sistema ortogonal KlacRS/tRNA.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mutagênese do códon âmbar para codificação genética da lactilisina no gene alvo

  1. Introduza um códon de parada âmbar TAG na posição 89 do gene hENO1 e na posição 149 do genes fGFP via mutagênese dirigida ao sítio seguindo o protocolo do fabricante, purifique o produto PCR e realize recombinação homóloga. Use os seguintes primers:
    ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGAAACTGATGATCGAG
    ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTGTGTGTGACGTTCAGTTTCTTG
    sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATCACCGCCGACAAGC
    sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTATACTCCAGC
    NOTA: Para a incorporação específica do local de lisina lactilada, o local alvo deve ser mutado em um códon oclusivo âmbar (TAG), ou outros códons sem sentido, e TAA ou TGA devem ser usados como o codon de parada genuíno.
  2. Descongele as células competentes DH5α no gelo, misture 5 μL do produto de recombinação com 50 μL de células e incube no gelo por 30 minutos. Submeta a mistura a um choque térmico de 45 s a 42 °C, depois coloque no gelo por 2-3 minutos. Adicione 350 μL de LB de meio e incube a 37 °C com agitação (220 rpm) por 1 hora.
  3. Espalhe as células sobre uma placa LB pré-aquecida contendo ampicilina e incube a 37 °C por 12-16 horas. Escolha duas colônias individuais para sequenciamento Sanger e confirme a mutação.

2. Expressão de proteína lactilada em células de E. coli

  1. Co-transformar 50 μL de células quimicamente competentes de E. coli DH10B com aproximadamente 100 ng de cada pBad-ENO1-K89TAG, que codifica o gene alvo, e pEvol-MmKlacRS1 (plasmídeo Addgene # 232157), que codifica o par KlacRS e tRNA.
  2. Incube a mistura no gelo por 25 minutos, faça choque térmico a 42 °C por 45 segundos e volte ao gelo por 3 minutos. Adicione 350 μL de LB medium em temperatura ambiente, agite vigorosamente a 220 rpm por 1 hora a 37 °C.
  3. Espalhe a cultura celular em uma LB/placa suplementada com 100 μg/mL de Ampicilina (Amp100) e 50 μg/mL de Cloranfenicol (Cm50). Incube as placas a 37 °C por 12-16 horas.
  4. Escolha uma única colônia para inocular uma cultura inicial de 4 mL e incube durante a noite. No dia seguinte, expanda a cultura durante a noite para 400 mL de LB/Amp 100Cm50 e depois agite vigorosamente a 220 rpm, 37 °C, até que o OD 600 atinja 0,6-0,8.
  5. Induzir com 0,2% de L-arabinose e 1 mM Klac; incubar a 30 °C, 220 rpm por mais 16 horas.

3. Codificação genética da lactillisina em células HEK 293T

  1. Células semente em placas de 12 poços com densidade de 1 x 105 células por poço com 1 mL de meio DMEM. Após 24 horas de incubação, quando a confluência celular atinge 70%-80%, realize a transfecção.
    NOTA: Recomenda-se uma confluência de 70%-80% para transfecção, enquanto ensaios de formação de colônias exigem densidades de semeadura menores, que devem ser determinadas empiricamente.
  2. Para preparar uma solução de DNA diluído, adicione 0,75 μg de pcDNA-sfGFP-N149TAG e pNeu-KlacRS (plasmídeo Addgene # 232155) em proporção 1:1 em 38 μL de DMEM sem soro com glicose alta. Pipete suavemente para cima e para baixo ou faça um vórtice breve para misturar.
  3. Para preparar reagente de transfecção diluído, adicione 2,25 μL de reagente de transfecção em 38 μL de DMEM sem soro com glicose alta. Pipete suavemente para cima e para baixo 3x-4x para misturar.
    NOTA: Se o Opti-MEM pode ser usado depende das instruções do fabricante, pois seu teor sérico pode interferir na eficiência da transfecção.
  4. Adicione imediatamente o reagente de transfecção diluído à solução de DNA diluído de uma vez só.
    NOTA: Não misture as soluções na ordem inversa.
  5. Imediatamente pipete para cima e para baixo 3x-4x ou faça um vórtice breve para misturar. Incube por 10-15 minutos em temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de transfecção/DNA.
    NOTA: O complexo de transfecção/DNA deve ser usado em até 20 minutos após a preparação.
  6. Adicione a mistura de 50 μL de transfecção/DNA gota a gota sobre o meio em cada poço e homogeneize a mistura girando suavemente a placa.
  7. Às 6 horas após a transfecção, substitua o meio por DMEM novo contendo 1 mM Klac. Cultura para 24-48 horas.
    NOTA: Com base em nossos dados anteriores, Klac em concentrações de 1-5 mM não mostrou efeitos citotóxicos nas células26. A concentração de trabalho de Klac deve ser otimizada com base no nível de expressão proteica. Se a proteína-alvo for propensa à perda da modificação da lactilação, recomenda-se a administração de inibidores de HDAC (por exemplo, Trichostatina A) ou o inibidor de sirtuina NAM (nicotinamida).

4. Purificação por His-tag de proteína lactilada em células de E. coli

  1. Colhe as células por centrifugação a 6.900 x g por 10 minutos a 4 °C. Ressuspenda em 50 mL de tampão de lise (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl). Lisar por ultrasonicação em gelo durante pulso de 3 s, intervalo de 8 s a 200 W por 30 minutos. Centrifuge a 13.800 x g, 4 °C por 30 minutos e depois colete o sobrenadante.
    NOTA: Se a proteína alvo for suscetível ao cisalhamento mecânico, a etapa de ultrassonação pode ser substituída por lise celular suave usando um reagente de extração proteico formulado adequado para E. coli.
  2. Filtre o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 μm para coletar as frações solúveis. Carregue os lisados clarificados em uma coluna gravitacional Ni-NTA de 1 mL. Lave com aproximadamente 5 mL de Buffer A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl,
    5 mM imidazol) até que nenhuma proteína detectável seja encontrada no eluato. Elute a proteína com 1 mL de Buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 200 mM imidazol) por 5 vezes. Guarde todas as frações. Verifique se há proteína eluída com um ensaio rápido de Bradford.
  3. Combine as frações de proteína purificadas e realize a troca de tampão para o tampão de armazenamento (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Aliquota as proteínas concentradas em 50 μL em cada tubo, congele rapidamente e armazene a -80 °C para a análise seguinte.

5. Caracterização bioquímica da proteína lactilada

  1. SDS-PAGE e Western Blotting
    1. Separe a proteína por SDS-PAGE (90 V por 20 min, depois 150 V por 50 min). Tinga o gel com Coomassie Blue, aqueça por 15 s em micro-ondas e destine com solução descolorante (40% etanol absoluto, 10% ácido acético glacial e 50% água desionizada) em um shaker (50 rpm, 15 min). Repita a etapa de decoloração até que as bandas proteicas fiquem claramente visíveis.
    2. Ative uma membrana PVDF em metanol por 1 minuto. Monte a pilha de transferência na ordem: esponja, papel de filtro, gel, membrana, papel de filtro e esponja. Realize a transferência a 250 mA por 1 hora em um tampão pré-resfriado. Bloqueie a membrana com leite desnatado a 5% por 1,5 hora, depois lave 3 vezes com TBST (10 min cada).
    3. Incubar com anticorpos primários (Anti-His 1:10.000; Anti-L-Lactil Lisina 1:1.000) a 4 °C durante a noite. Lave 3 vezes com TBST.
      NOTA: As razões ótimas de diluição devem ser determinadas empiricamente para anticorpos obtidos de diferentes fontes comerciais.
    4. Incube com anticorpo secundário de coelho (1:10.000) por 1,5 h em temperatura ambiente. Lave 3 vezes com TBST. Imagem usando quimioluminescência e salvar dados no Image Lab.
  2. Análises de espectrometria de massa
    1. Para análise de massa intacta, dilua as proteínas até uma concentração final de 0,1 μg/μL com água contendo 0,1% de ácido fórmico (FA) e então submeta-as a um sistema de cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (UPLC). A fase móvel consistia no solvente A (0,1% de FA na água) e solvente B (acetonitrila, ACN) a uma vazão de 0,3 mL/min.
    2. Meça os pesos moleculares do hENO1-89Klac usando um espectrômetro de massa de tempo de voo quadrupola (Q-TOF) de alta resolução com a faixa m/z ajustada para 300-2000. Colete e processe todos os dados usando o software MassLynx.
    3. Para análise proteômica, analise os lisados celulares digeridos conforme descrito anteriormente, utilizando um sistema de cromatografia líquida de nanofluxo acoplado a um espectrômetro de massa tribrido de alta resolução equipado com um analisador. A fase móvel consistia no solvente A (0,1% de FA na água) e solvente B (ACN/água, 8:2, v/v) a uma vazão de 300 nL/min.
    4. Separe peptídeos em uma coluna capilar C18 de fase reversa (75 μm x 250 mm) com um gradiente de 90 min: 3%-8% B (0-5 min), 8%-28% B (5-60 min), 28%-38% B (60-75 min), 38%-100% B (75-80 min) e 100% B (80-90 min). Adquira espectros MS1 sobre m/z 350-1800 com resolução de 120.000 e meta AGC de 4e5. Gerar espectros MS2 por fragmentação de dissociação colisional (HCD) de energia mais alta (energia de colisão = 32%), com uma massa inicial de m/z 110, resolução de 30.000 e meta AGC de 5e4.
  3. Análise de citometria de fluxo
    1. Lave as células 2x com buffer PBS pré-resfriado, seguido de centrifugação a 1.380 x g por 3 minutos após cada lavagem. Ressuspenda o pellet celular obtido após a centrifugação em 500 μL de tampão PBS e pipete suavemente para misturar. Filtre a suspensão celular através de uma gaze estéril de 300 malhas, colete o filtrado em um tubo de citometria de fluxo para minimizar a interferência dos agregados celulares durante a detecção. Analise a amostra preparada usando um citômetro de fluxo com lasers duplos, com excitação a 405 nm e detecção a 488 nm para os sinais de fluorescência correspondentes.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primeiro avaliamos a especificidade de incorporação de Klac em proteínas de E. coli. O gene para a enolase humana 1 (hENO1) foi projetado para conter um códon de parada âmbar no resíduo K89 (hENO1-89TAG), e esse construto foi coexpresso com o KlacRS ortogonal e seu par de tRNAs cognato em E. coli. Na ausência de suplementação de Klac de 1 mM, não foi detectada hENO1 de comprimento completo; em contraste, quando 1 mM de Klac foi adicionado ao meio de crescimento, hENO1 de comprimento total conte...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos uma estratégia para a incorporação específica do local de Klac em proteínas tanto em células procarióticas quanto eucarióticas. Ao introduzir um códon de parada âmbar na posição desejada do gene alvo e co-expressá-lo com o par ortogonal KlacRS/tRNA nas células hospedeiras, a autêntica litina lactil pode ser incorporada com precisão às proteínas das células vivas, fornecendo uma ferramenta poderosa para investigar a biologia específica da lactilação.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Essa pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (22377058), pelo Financiamento Interdisciplinar para Biologia Sintética em Medicina Tradicional Chinesa pela Universidade de Medicina Chinesa de Nanjing, e pelos Programas Nacionais de Apoio Especial de Talento de Alto Nível (Programa 10.000 Talentos) - Jovens Talentos.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
6*his,Sua tag Anticorpo monoclonal recombinanteProteintech84814-1-RRUma classe de imunoglobulinas específicas que têm como alvo o 6× Sua tag (um peptídeo curto composto por seis resíduos consecutivos de histidina, HHHHHH) em proteínas recombinantes.
Sistema UPLC ACQUITYÁguasCromatografia Líquida UltraPerformance
Anti-L-Lactillysine Rabbit mAbPTM BiolabsPTM-1401RMUma classe de imunoglobulinas específicas direcionadas à L-Lactil Lisina (Klac), uma modificação pós-traducional (PTM) de proteínas.
Kit de Clonagem Uma Etapa ClonExpress IIVazyme C112Com base em uma tecnologia simples, rápida e eficiente de clonagem sem interrupção de DNA, fragmentos inseridos podem ser clonados direcionalmente em qualquer local de qualquer vetor.
Citômetro de fluxo CytoFlexBeckmann CoulterCitômetro de fluxo com capacidade de detecção de alta sensibilidade e análise multicolorida
DH10BBiorabbitEC005H-SUm tipo de células competentes para transformação de plasmídeos, clonagem gênica e triagem azul-branco.
DH5 & alfa;Vazyme C502Um tipo de células competentes para transformação de plasmídeos, clonagem gênica e triagem azul-branco.
Sistema EASY-nano LC 1200Thermo Fisher ScientificCromatografia nanolíquida para separar amostras complexas de alta sensibilidade e alta resolução
Espectrômetro de massa Orbitrap Eclipse TribridThermo Fisher Scientificum sistema topo de linha de topo de linha tribrid de alta qualidade para cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS)
Phanta Max Super-Fidelidade DNA PolimeraseVazyme P505Uma única enzima de alta fidelidade que combina amplificação rápida e fidelidade
PolyJetSignaGenSL100688O Reagente de Tranfecção In Vitro de DNA da PolyJet é formulado para ser um potente reagente de transfecção que garante uma transfecção eficaz e reprodutível com menor citotoxicidade.

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  2. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m6A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  3. Pan, L., et al. Demethylzeylasteral targets lactate by inhibiting histone lactylation to suppress the tumorigenicity of liver cancer stem cells. Pharmacol Res. 181, 106270(2022).
  4. Xu, H., et al. Royal jelly acid suppresses hepatocellular carcinoma tumorigenicity by inhibiting H3 histone lactylation at H3K9la and H3K14la sites. Phytomedicine. 118, 154940(2023).
  5. Chai, P., Zhao, F., Jia, R., Zhou, X., Fan, X. Lactate/lactylation in ocular development and diseases. Trends Mol Med. 31 (12), 1073-1076 (2025).
  6. Wang, G., et al. The relationship and clinical significance of lactylation modification in digestive system tumors. Cancer Cell Int. 24 (1), 246(2024).
  7. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  8. Chen, L., et al. Lactate-lactylation hands between metabolic reprogramming and immunosuppression. Int J Mol Sci. 23 (19), 11943(2022).
  9. Sun, X., et al. The diapause-like colorectal cancer cells induced by smc4 attenuation are characterized by low proliferation and chemotherapy insensitivity. Cell Metab. 35 (9), 1563-1579 (2023).
  10. Yang, J., et al. A positive feedback loop between inactive VHL-triggered histone lactylation and PDGFRβ signaling drives clear cell renal cell carcinoma progression. Int J Biol Sci. 18 (8), 3470-3483 (2022).
  11. Li, W., et al. Tumor-derived lactate promotes resistance to bevacizumab treatment by facilitating autophagy enhancer protein Rubcnl expression through histone H3 lysine 18 lactylation (H3K18la) in colorectal cancer. Autophagy. 20 (1), 114-130 (2024).
  12. Jiang, J., et al. Lactate modulates cellular metabolism through histone lactylation-mediated gene expression in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 11, 647559(2021).
  13. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311 (2024).
  14. Li, G., et al. Glycometabolic reprogramming-induced XRCC1 lactylation confers therapeutic resistance in ALDH1A3-overexpressing glioblastoma. Cell Metab. 36 (8), 1696-1710.e10 (2024).
  15. Liberti, M. V., Locasale, J. W. The warburg effect: How does it benefit cancer cells. Trends Biochem Sci. 41 (3), 211-218 (2016).
  16. Varner, E. L., et al. Quantification of lactoyl-CoA (lactyl-CoA) by liquid chromatography mass spectrometry in mammalian cells and tissues. Open Biol. 10 (9), 200187(2020).
  17. Chen, Y., et al. Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation. Cell. 187 (2), 294-311.e21 (2024).
  18. Chen, H., et al. NBS1 lactylation is required for efficient DNA repair and chemotherapy resistance. Nature. 631 (8021), 663-669 (2024).
  19. Zong, Z., et al. Alanyl-trna synthetase, AARS1, is a lactate sensor and lactyltransferase that lactylates p53 and contributes to tumorigenesis. Cell. 187 (10), 2375-2392.e33 (2024).
  20. Ju, J., et al. The alanyl-tRNA synthetase AARS1 moonlights as a lactyltransferase to promote YAP signaling in gastric cancer. J Clin Invest. 134 (10), e174587(2024).
  21. Sun, L., et al. Lactylation of METTl16 promotes cuproptosis via m6A-modification on FDX1 mRNA in gastric cancer. Nat Commun. 14 (1), 6523(2023).
  22. Mao, Y., et al. Hypoxia induces mitochondrial protein lactylation to limit oxidative phosphorylation. Cell Res. 34 (1), 13-30 (2024).
  23. Lv, L., et al. Mitogenic and oncogenic stimulation of K433 acetylation promotes PKM2 protein kinase activity and nuclear localization. Mol Cell. 52 (3), 340-352 (2013).
  24. Okada, A. K., et al. Lysine acetylation regulates the interaction between proteins and membranes. Nat Commun. 12 (1), 6466(2021).
  25. Wan, N., et al. Cyclic immonium ion of lactyllysine reveals widespread lactylation in the human proteome. Nat Methods. 19 (7), 854-864 (2022).
  26. Shao, C., et al. Genetic code expansion reveals site-specific lactylation in living cells reshapes protein functions. Nat Commun. 16 (1), 227(2025).
  27. Sun, Y., et al. Genetic encoding of ε-N-L-lactyllysine for detecting delactylase activity in living cells. Chem Commun (Camb). 58 (61), 8544-8547 (2022).
  28. Ren, C., et al. Expanding the scope of genetically encoded lysine post-translational modifications with lactylation, β-hydroxybutyrylation and lipoylation. Chembiochem. 23 (18), e202200302(2022).
  29. Hu, Y., et al. Engineering unnatural cells with a 21st amino acid as a living epigenetic sensor. Nat Commun. 16 (1), 9388(2025).
  30. Elsasser, S. J., Ernst, R. J., Walker, O. S., Chin, J. W. Genetic code expansion in stable cell lines enables encoded chromatin modification. Nat Methods. 13 (2), 158-164 (2016).
  31. Zhu, W., Fan, C., Hou, Y., Zhang, Y. Lactylation in tumor microenvironment and immunotherapy resistance: New mechanisms and challenges. Cancer Lett. 627, 217835(2025).
  32. Mills, E. M., Barlow, V. L., Jones, A. T., Tsai, Y. H. Development of mammalian cell logic gates controlled by unnatural amino acids. Cell Rep Methods. 1 (6), 100073(2021).
  33. Italia, J. S., et al. Genetically encoded protein sulfation in mammalian cells. Nat Chem Biol. 16 (4), 379-382 (2020).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Lactila o Espec fica do S tioModifica o P s TraducionalEscherichia ColiAminoacil tRNA SintetaseModifica o ProteicaMicroscopia de Fluoresc nciaCitometria de Fluxo

Artigos relacionados