Artigo de método

Modelo de rato canulado com ducto linfático cervical para avaliação do transporte linfático da cabeça e do cérebro

844 vistas

⸱

DOI:

10.3791/70217

⸱

10 de março de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Natural Medicines, School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, 2MOE Joint International Research Laboratory of Target Discovery and New Drug Innovation, China Pharmaceutical University, 3Department of Drug Delivery, Disposition and Dynamics, Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo experimental demonstra um modelo profundo de rato canulado por ducto linfático cervical que permite avaliação direta e quantitativa da drenagem linfática da região da cabeça. O modelo facilita a análise detalhada de solutos derivados do sistema nervoso central (SNC), populações de células imunes e a distribuição e eliminação de terapêuticos voltados para o SNC.

Resumo

A linfa flui do sistema nervoso central (SNC) por meio de uma série de vasos linfáticos (VE) e linfonodos que convergem nos ductos linfáticos cervicais. Além de manter o equilíbrio dos fluidos, esses ductos linfáticos desempenham um papel fundamental no transporte de uma ampla variedade de substâncias, incluindo metabólitos endógenos, moléculas sinalizadoras, células imunes e medicamentos pequenos e macromoleculares. Isso é fundamental para a homeostase fisiológica e a função imunológica tanto nas regiões intracraniana (por exemplo, cérebro) quanto extracraniana (por exemplo, cavidades nasal e oral). A deterioração do drenagem linfática do cérebro tem sido cada vez mais associada a uma série de distúrbios neurológicos e neurodegenerativos. A canulação do ducto linfático cervical permite a coleta de linfa drenando a cabeça e o cérebro, possibilitando a medição da concentração e taxa de transporte de várias substâncias pelo sistema linfático. Mudanças nesses fatores em resposta a diferentes desafios (por exemplo, drogas, estresse, trauma) e doenças (por exemplo, AVC, infecção, doença de Alzheimer) também podem ser determinadas. Aqui, descrevemos um modelo de rato canulado com canal linfático cervical profundo anestesiado, que permite a coleta de linfa por várias horas após a cirurgia. O método pode ser combinado com tecnologias de imagem e multi-ômicas para a medição de uma ampla gama de parâmetros de interesse na linfa. Isso facilita pesquisas fisiológicas e fisiopatológicas fundamentais na região da cabeça e do pescoço, bem como estudos farmacocinéticos/farmacodinâmicos de medicamentos, especialmente para o tratamento de doenças do SNC.

Introdução

O sistema linfático, que está distribuído por todo o corpo, é essencial para manter a homeostase dos fluidos, regular as respostas imunes e facilitar o transporte de nutrientes e moléculassinalizadoras 1. Os linfáticos periféricos começam nos capilares linfáticos, que coletam fluido intersticial e solutos e drenam para vasos linfáticos coletores maiores (VE) que possuem uma camada muscular lisa ao redor; esses vasos então entregam linfa aos linfonodos locais para processamentoimunológico 2,3. A rede linfática que drena a região da cabeça é importante para a homeostase tanto dos órgãos intracranianos (por exemplo, cérebro) quanto extracranianos (por exemplo, cavidades nasal e oral). Acredita-se que a estrutura e a organização da rede linfática extracraniana se assemelhem às das linfáticas periféricas em todo o corpo, enquanto o sistema linfático intracraniano apresenta características anatômicas e funcionais únicas (veja a Figura 1 para uma representação esquemática detalhada em modelos de ratos)4,5. Embora os LVs típicos estejam ausentes no parênquima cerebral, as funções linfáticas são mediadas pelo sistema especializado de transporte linfático dependente da glia (glymphático), que facilita a troca entre o líquido cefalorraquidiano (LCR) e o líquido intersticial (ISF)6. Enquanto o sistema glymphático permite a mistura de ISF dentro do parênquima cerebral com o LCR, os LVs meníngeo, perivascular e nasofaríngeo transportam solutos do LCR para longe da cavidade craniana. Especificamente, a via linfática meníngea direciona o LCR do espaço subaracnoideo para os VE meníngeos, ligando a dinâmica do fluido intracraniano à depuração linfáticaperiférica 7. Paralelamente, vias perineurais permitem o vazamento de LCR e solutos associados ao longo das bainhas dos nervos cranianos e espinais, mais proeminente pelos nervos olfativos até o plexo linfáticonasofaríngeo 5,8. O trabalho simultâneo desses sistemas mantém a homeostase fluida nocérebro 6,7,8. Avanços recentes na compreensão do sistema linfático drenador do SNC trouxeram novos insights sobre fisiologia cerebral e fisiopatologia. Essas descobertas podem oferecer novas vias para intervenção terapêutica nas doenças doSNC 9.

figure-introduction-1
Figura 1: Representação esquemática das vias de limpeza linfática do SNC. Essas vias consistem em (A) a rota glifática via espaços perivasculares; (B) a via linfática nasofaríngea e (C) as VE meníngeas. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

As redes linfáticas que drenam da cabeça e do SNC convergem para os ductos linfáticos cervicais localizados no pescoço, onde a linfa é filtrada pelos linfonodos cervicais antes de entrar na circulação sistêmica. Os linfonodos cervicais são classificados em linfonodos superficiais (SLNs) e linfonodos cervicais profundos (dCLNs) de acordo com suas localizações anatômicas dentro do pescoço. Alterações na composição do líquido linfático nos ductos cervicais são consideradas como refletindo variações fisiopatológicas subjacentes no cérebro, sendo a doença de Alzheimer (DA), doença de Parkinson (DP), lesão cerebral traumática (TCE) e comprometimento cognitivo pós-AVC (PSCI) exemplosrepresentativos 9,10,11,12,13 . Notavelmente, na DA, a drenagem comprometida das proteínas amiloide-β (Aβ) e tau fosforilada (P-tau) através dessas vias linfáticas tem sido implicada como um fator contribuinte para a progressão dadoença 9,10,14. Ao conectar diretamente os ductos linfáticos às veias adjacentes para redirecionar o drenagem linfática, a anastomose venosa linfática (LVA) está sendo investigada tanto em animais quanto em humanos como uma estratégia terapêutica para aumentar o fluxo linfático do SNC, facilitando assim a eliminação de Aβ no cérebro e potencialmente atrasando a progressão da AD6, 15 e 16. A importância dessa via é ainda mais ilustrada por observações em camundongos submetidos à remoção cirúrgica dos linfonodos cervicais (linfadenectomia), resultando em redução da detecção linfática cervical. A depuração comprometida leva ao acúmulo tóxico de Aβ e P-tau, com subsequente ativação das vias patológicas de sinalização quinase. Essas mudanças estão associadas a uma piora progressiva da tauopatia semelhante à Alzheimer e a um risco aumentado de comportamentos semelhantes à ansiedade e depressão14,16. Além disso, estudos baseados em LCR sugerem que tumores do SNC, como linfomas cerebrais, podem obstruir fisicamente a depuração linfática através dos ductos linfáticos cervicais profundos enquanto elevam simultaneamente as concentrações de oncoproteínas noLCR 9,17,18. Evidências de estudos baseados em inflamação do SNC indicam ainda que células originadas nas meninges podem migrar pelos VE meníngeos para os linfonodoscervicais 8,19. Essas células consistem principalmente em linfócitos, com populações menores de células dendríticas, macrófagos e célulasendoteliais 19,20. Durante a inflamação ou após lesão ou cirurgia do SNC, o tráfego de células imunes linfáticas torna-se evidentemente intensificado, acompanhado por níveis elevados de biomarcadores imunológicos como citocinas, quimiocinas e outros mediadoresinflamatórios 21.

Além de seus papéis patofisiológicos, a rede linfática cervical é cada vez mais reconhecida como um importante canal para a disposição de medicamentos. Estudos anteriores em animais demonstraram que várias formulações de medicamentos destinadas à administração do SNC podem sofrer depuração do cérebro via ductos linfáticos cervicais e linfonodos (em diferentes graus), exemplificados por agentes baseados em nanopartículas administrados intracerebralmente (por exemplo, lamotrigina, talazoparib) e biológicos (por exemplo, anticorpos monoclonais, proteínas traçadoras radiomarcadas)22,23,24,25 . Em humanos, estudos de ressonância magnética demonstraram que certas moléculas, como o gadobutol, passam por transporte ativo do sistema linfático para os ductos linfáticoscervicais 26.

Como mencionado anteriormente, os linfonodos cervicais, tanto os SNLCs quanto os nºC dCLNs, drenam linfa de regiões distintas da cabeça; no entanto, as regiões cranianas específicas drenadas por cada nó permanecemincertas 27,28. Áreas de drenagem sobrepostas, variabilidade anatômica entre indivíduos e possíveis diferenças estruturais entre espécies complicam ainda mais a descrição dos padrões de drenagem linfática cervical tanto em animais quantoem humanos 29. Dentro da complexa rede linfática cervical, os ductos linfáticos cervicais profundos foram identificados como principais rotas de saída para o LCR, localizados a jusante dosLVs nasofaríngeo e meníngeo 8. Comparado aos ductos linfáticos cervicais superficiais, que formam redes finas e variáveis no tecido subcutâneo e diferem muito em tamanho e ramificação entre ratos individuais, o ducto linfático cervical profundo oferece uma rota mais acessível e prática para coletar linfa derivada do SNC em modelos animaispequenos 20,30. O protocolo atual, portanto, foca em estabelecer um método confiável para coletar linfa do ducto linfático cervical profundo.

Apenas um número limitado de estudos realizados na última década descreveu a coleta de fluidos linfáticos cervicais para estudar doenças do SNC ou analisar a distribuição de medicamentos. Um estudo anterior descreveu a medição das concentrações de medicamentos na linfa cervical por meio de lavagem ou espremimento de líquido de seções de tecido isoladas (como aquelas adjacentes a uma única dCLN)31. No entanto, protocolos experimentais para a coleta contínua de linfa dos ductos cervicais em pequenos animais de laboratório, especialmente ratos, permanecem subdesenvolvidos. Esse protocolo estabelece um método facilmente acessível e reprodutível para canular o ducto linfático cervical (de rato), permitindo a coleta contínua de linfa e investigando o transporte linfático do SNC, respostas imunes e farmacocinética. Sua principal vantagem está na capacidade de quantificar o fluxo e a composição linfática em intervalos de tempo definidos, permitindo assim a medição quantitativa de medicamentos, lipídios, ácidos graxos e constituintes celulares. Particularmente, este modelo captura processos de transporte linfático que não são adequadamente representados por amostragem ou técnicas de imagem de plasma/LCR, oferecendo novos insights sobre disposição de fármacos no SNC, transporte de lipídios e nutrientes, e sinalizaçãoimune 20.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

O(s) procedimento(s) descrito(s) neste protocolo foram aprovados pelo comitê de ética animal da universidade e realizados de acordo com as diretrizes éticas experimentais da Universidade Farmacêutica da China. Antes de iniciar qualquer procedimento relacionado a animais, obtenha as aprovações necessárias do comitê de ética institucional ou organizacional relevante. Ratos machos Sprague-Dawley (SD), pesando entre 220 e 250 g, são usados como animais experimentais. Os animais são obtidos de fornecedores autorizados de animais experimentais (consulte a Tabela de Materiais) e mantidos em gaiolas dedicadas, com acesso livre a comida e água até o início do experimento. Neste protocolo, a canulação do ducto linfático cervical profundo esquerdo é descrita como um exemplo representativo. Atualmente, há evidências limitadas que descrevam diferenças anatômicas entre os ductos linfáticos profundos cervicais esquerdo e direito. Com base em observações de experimentos previamente concluídos, não foram observadas diferenças significativas entre os dois lados, inclusive nas taxas de fluxo linfático.

1. Precauções e procedimentos de segurança

  1. Realize todos os procedimentos de acordo com as diretrizes institucionais de biossegurança, e todo o pessoal deve receber treinamento adequado em técnicas microcirúrgicas, manuseio experimental de animais e segurança química antes de realizar este protocolo.
  2. Use equipamentos de proteção individual (EPI) adequados, incluindo jaleco, luvas cirúrgicas e óculos de proteção, durante todo o procedimento. Como um anestésico volátil (isoflurano) é utilizado e pode causar depressão do sistema nervoso central e toxicidade cardiovascular em humanos após exposição prolongada, realize o procedimento em um ambiente bem ventilado. Alimentos e bebidas não devem ser trazidos para o laboratório, e certifique-se de que a água corrente esteja sempre acessível.
  3. Manusear todos os itens cortantes, incluindo agulhas de seringa, lâminas de barbear e microtesouras, com cuidado e descartá-los imediatamente após o uso em recipientes específicos para objetos cortantes; Em nenhuma circunstância itens cortantes descartáveis devem ser reutilizados.
  4. Trate todas as amostras biológicas (por exemplo, linfa coletada) e fluidos corporais animais (por exemplo, sangue) como potencialmente perigosos e manuseie todos os equipamentos de coleta com cuidado, mantendo as amostras longe da área cirúrgica. Em caso de lesão acidental por agulha ou contato cutâneo com substâncias perigosas, lave imediatamente a área afetada com sabão e água e relate o incidente de acordo com os protocolos de segurança institucionais.

2. Preparação no dia anterior à cirurgia

  1. Jejue ou alimente os ratos de acordo com os requisitos do experimento específico. Esse protocolo não exige um estado específico de jejum ou alimentação.
  2. Prepare uma solução anticoagulante diluindo heparina ou ácido etilendidiaminático tetraacético (EDTA) até uma concentração final de 10 IU/mL. Pré-carregue essa mistura (aproximadamente 0,7 mL) em uma seringa de insulina estéril de 1 mL equipada com uma agulha de 30 G, para pré-revestir a superfície interna da cânula de polietileno (PE) (usada para canulação dos ductos linfáticos). Armazene essa mistura preparada em condições estéreis até o uso.
  3. Prepare cânulas para coleta de amostras de linfa montando uma cânula de PE em configuração cabeça-cauda, usando tubos externos (OD) de 0,5 mm, 0,3 mm de diâmetro interno (DI) para ambas as seções terminais e tubos de 0,6 mm de diâmetro diagonal e 0,5 mm de diâmetro interior para a seção central.
    1. Corte os segmentos da cânula em comprimentos de 2 cm para a porção proximal que se conecta à agulha da seringa, 40 cm para a seção central e 8 cm para a porção distal destinada à canulação.
    2. Corte e bisele a extremidade distal do conjunto da cânula em um ângulo de aproximadamente 45° para facilitar a inserção suave no ducto linfático cervical. Consulte a Figura 2 para uma ilustração detalhada da montagem da cânula.
      NOTA: Este chanfro facilita a inserção suave no ducto linfático e reduz o risco de obstrução ao aumentar a área da seção transversal eficaz. Após a canulação bem-sucedida, a seção proximal (2 cm) é desconectada e a linfa é coletada diretamente da extremidade proximal exposta da seção central (conforme descrito em detalhes nos Passos 4.9 e 4.10).

figure-protocol-1
Figura 2: Diagrama esquemático da montagem da cânula (não em escala). O diagrama ilustra as dimensões de cada componente do tubo de PE montado usado para construir a cânula. Da esquerda para a direita, a cânula montada será doravante chamada de extremidade proximal, seção central e extremidade distal, respectivamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.  

  1. Prepare o sistema de inalação de anestesia pré-carregando isoflurano líquido no recipiente pressurizado equipado com vaporizador. Antes do uso, realize um teste (priming) do vaporizador para confirmar a estaquidade e garantir um fluxo de gás estável e consistente.
  2. Se necessário, prepare o candidato ao medicamento de teste em um veículo adequado. Realize estudos de estabilidade para confirmar a integridade da formulação durante o armazenamento e durante o período de administração. Inclua agentes adicionais (por exemplo, corantes biológicos como o Evans Blue) quando aplicável.
  3. Prepare os recipientes para a coleta linfática pesando previamente os tubos estéreis da microcentrífuga e registrando seus pesos iniciais. Rotule cada tubo sequencialmente de acordo com os pontos de tempo planejados de coleta (por exemplo, intervalos horários). Adicione heparina concentrada (ou EDTA) a cada tubo e remova o solvente por evaporação por absorção de nitrogênio, deixando de 2 a 5 UI de heparina seca (ou EDTA) por tubo para evitar diluição desigual da linfa coletada.

3.  Preparativos imediatamente antes da cirurgia

  1. Verifique a permeabilidade de cada cânula lavando com a solução anticoagulante preparada. Conecte uma seringa na extremidade proximal da cânula montada e libere suavemente um pequeno volume de solução. Certifique-se de que a solução saia suavemente pela extremidade distal, sem evidências de vazamento. Se for detectado vazamento, como tipicamente indicado pelo fluido escapando no(s) ponto(s) de conexão, descarte todo o conjunto da cânula e reconstrua um novo conforme o Passo 2.3.
    NOTA: Esta etapa simultaneamente pré-cobre a superfície interna da cânula com anticoagulante (essa etapa também pode ser realizada no dia anterior à cirurgia, para que a cânula seja pré-revestida durante a noite).
  2. Comece a administrar isoflurano inalado através de uma máscara de cone nasal aproximadamente 5 minutos antes do início da cirurgia. Mantenha a anestesia durante todo o procedimento com uma taxa de parto de 0,4 a 0,6 L/min sob pressão de 101,3 kPa a 20 °C. Garanta a profundidade da anestesia avaliando a resposta ao beliscão do dedo.
    1. Monitore continuamente a profundidade da anestesia. Eutanasie imediatamente o rato se forem observados sinais de sofrimento ou instabilidade fisiológica.
  3. Posicione o rato deitado em uma almofada cirúrgica aquecida mantida a 37 °C. Incline a cabeça e estenda o pescoço, usando um pequeno suporte (travesseiro) se necessário, para maximizar a exposição da região cervical. Prenda a cabeça dentro da máscara anestésica para garantir a entrega contínua de isoflurano e prenda suavemente os membros anteriores usando elásticos ou fitas cirúrgicas para minimizar o movimento durante o procedimento.
  4. Enxágue o pelo da região cervical com soro fisiológico normal estéril para facilitar a depilação. Raspe cuidadosamente todo o local cirúrgico (usando uma lâmina de barbear de segurança de dois gumes), normalmente a região do pescoço e da clavícula, para garantir a remoção completa do pelo antes da incisão (veja a Figura 3A para um exemplo da área do pescoço raspado).
  5. Limpe toda a área raspada com desinfetantes, como um agente contendo iodo.
  6. Marque o local cirúrgico desenhando uma linha pontilhada de 2,5 cm para confirmar o comprimento da incisão inicial. Posicione a linha um pouco à direita da linha média do corpo do rato. Coloque a extremidade superior da incisão aproximadamente de 1 a 1,5 cm abaixo do lábio inferior (consulte a Figura 3B para um exemplo do local da incisão, com medições auxiliadas por uma régua).

figure-protocol-2
Figura 3: Preparação do local cirúrgico. (A) A região do pescoço é raspada em preparação para a incisão; (B) comprimento e localização aproximados da incisão, indicados pela linha pontilhada de 2,5 cm. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

4. Canulação do ducto linfático cervical

  1. Posicione o rato com a cabeça apontada para o operador. Use um microscópio para essa etapa devido ao diâmetro relativamente pequeno do ducto linfático cervical.
  2. Usando um bisturi estéril, incisa cuidadosamente a camada superficial da musculatura cervical ao longo da marca mencionada de 2,5 cm de comprimento, orientada quase paralela à linha média (veja a Figura 4A para a camada superficial aberta da pele).
  3. Separe suavemente as camadas musculares restantes, principalmente a fáscia cervical superficial, para expor a artéria cervical, que normalmente se distingue por sua coloração vermelha.
  4. Retrair o músculo esternomastoide e a glândula submandibular e incliná-los cuidadosamente para longe do campo cirúrgico para facilitar a identificação do ducto linfático cervical. Use um expansor de tecido para manter a janela cirúrgica e um cotonete para manter temporariamente o tecido muscular à parte enquanto localiza o linfonodo e o ducto linfático associado. Certifique-se de que o expansor de tecido esteja no lugar durante todo o processo de canulação (consulte a Figura 4B para a janela cirúrgica aberta com o expansor de tecido no lugar).
  5. Localize o ducto linfático cervical (preferencialmente sob microscópio): O ducto aparece como um vaso opaco e incolor, com aproximadamente 0,2 a 0,5 mm de diâmetro, correndo imediatamente paralelo à artéria carótida. Uma ou mais dCLNs adjacentes, de cor de pele, podem frequentemente ser observadas ao longo do curso do ducto linfático cervical (veja a Figura 4C para uma visão microscópica do ducto linfático cervical profundo exposto e de uma dCLN adjacente).
    NOTA: Os ductos linfáticos cervicais geralmente têm uma cor muito semelhante aos tecidos ao redor, e sua identificação frequentemente exige inspeção cuidadosa, especialmente em ratos com mais tecido adiposo. Para fins cirúrgicos (mas não para estudos sobre transporte linfático de medicamentos ou substâncias endógenas), o Evans Blue pode ser injetado subcutâneamente sob o pescoço no início da cirurgia, para que o ducto linfático cervical seja melhor visualizado quando o corante drena pelos linfáticos.
  6. Usando uma pinça contundente, passe suavemente pelos tecidos conjuntivos separados e mantenha as pinças na posição para garantir que o ducto linfático cervical permaneça claramente visível dentro do campo cirúrgico.
  7. Isole cuidadosamente o ducto linfático cervical dos tecidos conjuntivos e adiposos ao redor por dissecação romba, tomando especial cuidado para evitar danos, pois o vaso é extremamente frágil.
  8. Use uma microtesoura para criar uma pequena incisão na metade superior do ducto exposto. Não desconecte completamente o duto; As duas metades devem permanecer intactas.
  9. Verifique e certifique-se de que a cânula preparada, pré-revestida com solução anticoagulante (conforme descrito no Passo 2.3), esteja livre de bolhas de ar, realizando uma lavagem suave. Imediatamente antes da inserção, segure cuidadosamente a extremidade distal da cânula com pinças, orientando-a de modo que a face chanfrada fique direcionada para cima. Depois, avance suavemente a cânula aproximadamente 2 mm para dentro do ducto através da incisão, direcionando-a em direção à cabeça (veja a Figura 4D para uma ilustração da canulação bem-sucedida). A profundidade real de inserção pode variar dependendo do rato individual.
    NOTA: Como a inserção da cânula é relativamente rasa neste procedimento, um ponto de fixação adicional na área ao redor pode ser útil. Isso é conseguido criando uma pequena perfuração secundária na pele (furo) aproximadamente 1,5 cm da janela cirúrgica usando tesouras. Essa abertura será ainda mais estabilizada em etapas subsequentes (por exemplo, com sutura ou adesivo). A Figura 4E demonstra essa etapa no contexto do uso de adesivo de tecido. A cânula deve ser passada pelo furo para ajudar a fixar sua posição.
  10. Destace a seringa de insulina junto com o segmento proximal curto (2 cm) da cânula do restante da montagem da cânula. A linfa pode então ser coletada diretamente da extremidade proximal exposta do segmento médio de maior diâmetro. Monitore a ponta distal desse segmento coletor por 1 a 2 minutos. Confirme a canulação bem-sucedida por um fluxo visível, lento e constante de fluido linfático pelo ducto canulado.
  11. Uma vez verificada a canulação como bem-sucedida, fixe a cânula aplicando uma pequena gota de adesivo de tecido cianoacrilato com uma pipeta tanto no local da incisão do ducto linfático quanto no orifício de fixação secundário (veja a Figura 4E para uma demonstração da fixação da cânula). Tome cuidado extra para evitar obstruir o vaso sanguíneo ou prejudicar o fluxo linfático.
  12. Observe o fluxo linfático por vários minutos para confirmar uma saída constante (uma gota visível normalmente se forma na extremidade da cânula dentro de um minuto). Uma vez verificado, remova cuidadosamente o expansor de tecido da janela cirúrgica e reposicione a glândula submandibular para sua localização original.
  13. Anexe um tubo microcentrífuga previamente marcado revestido com anticoagulantes (veja Passo 2.6) na extremidade distal da cânula para coletar a linfa de fluxo livre.

figure-protocol-3
Figura 4: Canulação do ducto linfático cervical. (A) Local da incisão na região do pescoço; (B) janela cirúrgica aberta com um expansor de tecido no lugar e a glândula submandibular retraída para a direita; (C) ducto linfático cervical e um dCLN visualizados ao microscópio. (D) Canulação bem-sucedida, indicada pela linha pontilhada verde (vista microscópica). (E) Adesivo de tecido foi aplicado no local da incisão, e uma punção secundária na pele foi feita usando uma pipeta. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

5. Período pós-cirúrgico e administração de medicamentos

  1. Após a conclusão da canulação do ducto linfático cervical, reposicione todas as camadas musculares para suas posições originais. Em seguida, feche a incisão cutânea com pontos e/ou adesivo de tecido; normalmente, uma incisão de 2,5 cm de comprimento pode ser devidamente fechada com 8 pontos (veja a Figura 5A para uma janela cirúrgica fechada com sutura). Remova o(s) elástico(s) ou fitas cirúrgicas que os restringem nos membros anteriores ao concluir esta etapa.
  2. Administrar medicamentos no LCR por uma via apropriada, como intra-cisterna magna (ICM), intra-cerebroventricular (ICV) ou injeção intratecal lombar (LIT). Usando a administração de ICM como exemplo, identifique o local da injeção na cisterna magna, localizada na base do crânio e visível como a única depressão mole na superfície dorsal. Raspe o pelo ao redor conforme necessário para facilitar a visualização (consulte a Figura 5B para uma área marcada adequada para injeção de ICM).
    NOTA: Para manter a pressão intracraniana (ICP) durante a injeção de ICM, um volume equivalente de LCR é frequentemente retirado antes da administração do medicamento. Recomenda-se usar uma seringa nova, pré-preenchida, para injeção. Dobrar a agulha da seringa pode facilitar a administração (veja a Figura 5C para uma demonstração da injeção ICM usando uma agulha de seringa dobrada).
  3. Mantenha o rato deitado em deitado na almofada cirúrgica aquecida (mantida a 37 °C) para preservar a temperatura corporal após a injeção e durante todo o período de coleta da amostra.

figure-protocol-4
Figura 5: Manejo pós-cirúrgico. (A) Local da incisão fechado usando sutura de seda. (B) Localização aproximada da cisterna magna com o pelo ao redor raspado. (C) Administração de um candidato a medicamento por ICM usando uma seringa de insulina com agulha dobrada. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

6. Coleta de amostras e análise de linfa

  1. Colete linfa continuamente em tubos microcentrífugas revestidos com anticoagulantes, substituindo os tubos em intervalos pré-determinados (tipicamente a cada hora). Armazene as amostras coletadas com bolsas de gelo usando uma caixa térmica. Consulte a Figura 6 para uma amostra de linfa cervical coletada em um tubo de microcentrífuga.
  2. Após a conclusão do processo de coleta de linfa, eutanasie o rato de forma humanitária de acordo com os protocolos apropriados.
  3. Determine a taxa de fluxo linfático medindo o volume de linfa coletado em cada intervalo planejado (a cada hora).
  4. Meça as concentrações de medicamentos (ou substâncias de interesse) na linfa usando métodos analíticos apropriados, incluindo HPLC, HPLC-MS ou kits de ensaio comercialmente disponíveis, para caracterizar sua cinética de eliminação do SNC via o sistema linfático.
  5. Calcule o transporte de massa do fármaco linfático multiplicando as concentrações medidas pelo volume linfático correspondente.

figure-protocol-5
Figura 6: Coleta de amostra linfática. Fotografia de uma amostra coletada (aprox. 100 μL) em um tubo de microcentrífuga. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

7. Manuseio pós-procedimento e descarte de resíduos

  1. Armazene temporariamente ratos eutanasiados em recipientes designados para resíduos médicos dentro de uma área de armazenamento frigorífico dedicada (por exemplo, uma geladeira) até que sejam coletados e descartados por uma equipe profissional de processamento de resíduos médicos.
  2. Recolha todos os itens cortantes descartados em um recipiente designado para objetos cortantes, separado de todos os outros resíduos.
  3. Descarte todos os outros itens não cortantes usados no experimento (por exemplo, cotonetes, elásticos, cânulas de PE) em sacos de resíduos médicos e não os descarte junto com resíduos domésticos ou gerais. Certifique-se de que nenhum objeto cortante seja colocado nessa sacola.
  4. Limpe e desinfete todas as ferramentas reutilizáveis restantes de acordo com os protocolos laboratoriais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Um conjunto de dados representativo das taxas de fluxo linfático horário (mL/h) foi obtido usando o modelo de canulação linfática cervical (consulte a Figura 7 para o gráfico correspondente). Neste experimento envolvendo três (n = 3) ratos de estudo, a linfa foi coletada continuamente em tubos microcentrífugas, que foram substituídos a cada hora ao longo de um período de 6 horas.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Esse protocolo estabelece um método reprodutível para canular o ducto linfático cervical em ratos, permitindo a coleta contínua de linfa por períodos prolongados. Com treinamento microcirúrgico adequado, o procedimento pode ser realizado de forma eficiente e gera amostras linfáticas consistentes sob condições fisiológicas estáveis, mantidas por anestesia contínua, tornando-o adequado para uso experimental rotineiro. Uma vez dominado, o procedimento cirúrgico normalmente leva aproximadame...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores afirmam que não possuem interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Agradecimentos

Os autores agradecem sinceramente ao Sr. Zhenglin Hao e à Sra. Jie Zhao, do Centro Experimental de Animais da Universidade Farmacêutica da China, pelo apoio na realização de experimentos com animais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agulha calibre 30Saúde YushouUsado para conectar a extremidade proximal da cânula (0503) com a seringa de heparina
Dispensador de anestesia com vaporizadorCompanhia de Instrumentos YYUN
Pinça contundenteCiências da Vida RWDF22002-10 
CotonetesBiotecnologia Qingdao ShultzMQ-02Usado para manter o tecido muscular temporariamente no lugar
Almofada cirúrgica aquecidaShanghai Yiheng InstrumentsDimensão 15 e horários; 20 cm
Heparina sódicaTecnologia Bioquímica de Xangai AladdinH123383Diluição necessária antes do uso
Seringa de insulina (1 mL)Saúde YushouU100-1MLUsado apenas para pré-revestimento de heparina
Solução de isoflurano para inalaçãoCiências da Vida RWDR510-22-10Usado para anestesia por vaporização
Canetas marcadorasQualquer marcaN/A
Tubo microcentrífuga (1,5 mL)Equipamento Experimental Hairui de NantongHR10003Usado para coleta de linfa
MicrotesouraCiências da Vida RWDGD234BA0007925
Sutura cirúrgica de náilon  Shanghai Yiheng Instruments4-0 35CM
Pipeta (ajustável em volume, faixa de medição de 50 a 50 e mu; L)Dragon Laboratory Instruments Limited7030301006Usado apenas para medir adesivo de tecido
Pontas de pipeta Biosharp Ciências da VidaBS-10-TUsado apenas para transferir adesivo de tecido, sem volume específico requerido
Cânula de polieileno (PE) 0,5 mm de diâmetro de distância, 0,3 mm de diâmetro interno (0503)AniLab Instrumentos Científicos (Ningbo)PE-0503
Cânula de polieileno (PE) 0,6 mm de diâmetro de distância, 0,5 mm de diâmetro de diâmetro (0605)AniLab Instrumentos Científicos (Ningbo)PE-0605
Lâminas de barbearGillette ShanghaiQ31/0115000301C004Usado apenas para barbear de peles
ElásticoQualquer marcaN/AUsado para conter os membros anteriores de ratos
GovernanteQualquer marcaN/A
Lâminas scapel (#23)Ciências da Vida RWDS31010-01
Solução de cloreto de sódio (0,9%) para infusãoShijiazhuang Nº 4 FarmacêuticaH20066533 (número de aprovação)Usado apenas para enxágue de peles
Ratos Sprague-DawleyTecnologia Animal do Laboratório do Rio Vital de Pequim101Peso de 220 a 250 gramas, sem requisito de idade
Luz cirúrgicaPequim Heo Bio-TechXHA011-1
Microscópio cirúrgicoTecnologia Optoeletrônica Cewei de XangaiSMZ755TMicroscópio dissecador sem palco mecânico pode ser equipado com um suporte retrátil
Cola de tecido3M Vetbond1469SBIngrediente principal cianoacrilato  
Expansor de tecido (Colibri)Ciências da Vida RWDR22029-04Faixa de expansão 20mm/4cm

Referências

  1. Hu, D., et al. Lymphatic system identification, pathophysiology and therapy in the cardiovascular diseases. J Mol Cell Cardiol. 133 (1), 99-111 (2019).
  2. Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Compr Physiol. 9 (1), 207-299 (2018).
  3. Moore, J. E. Jr, Bertram, C. D. Lymphatic system flows. Annu Rev Fluid Mech. 50, 459-482 (2018).
  4. Dupont, G., et al. Our current understanding of the lymphatics of the brain and spinal cord. Clin Anat. 32 (1), 117-121 (2019).
  5. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. J Exp Med. 212 (7), 991-999 (2015).
  6. Xu, J., et al. The lymphatic system: a therapeutic target for central nervous system disorders. Neural Regen Res. 18 (6), 1249-1256 (2023).
  7. Raper, D., Louveau, A., Kipnis, J. How do meningeal lymphatic vessels drain the CNS. Trends Neurosci. 39 (9), 581-586 (2016).
  8. Louveau, A., et al. Understanding the functions and relationships of the glymphatic system and meningeal lymphatics. J Clin Invest. 127 (9), 3210-3219 (2017).
  9. Salvador, A. F. M., Abduljawad, N., Kipnis, J. Meningeal lymphatics in central nervous system diseases. Annu Rev Neurosci. 47 (1), 323-344 (2024).
  10. Guo, X., et al. Emerging roles of meningeal lymphatic vessels in Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 94 (S1), S355-S366 (2023).
  11. Mestre, H., et al. Cerebrospinal fluid influx drives acute ischemic tissue swelling. Science. 367 (6483), eaax7171(2020).
  12. Da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  13. Zou, W., et al. Blocking meningeal lymphatic drainage aggravates Parkinson's disease-like pathology in mice overexpressing mutated α-synuclein. Transl Neurodegener. 8 (1), 7(2019).
  14. Wu, C., et al. Tauopathy after long-term cervical lymphadenectomy. Alzheimers Dement. 21 (4), e70136(2025).
  15. Fang, Y., et al. A new perspective on cerebrospinal fluid dynamics after subarachnoid hemorrhage: from normal physiology to pathophysiological changes. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (4), 543-558 (2022).
  16. Yen, Y. H., Chen, M. W., Lim, J. X., Chew, K. Y. Exploring lymphovenous anastomosis for Alzheimer's disease: addressing brain lymphatic dysfunction, feasibility, and outcome metrics. Plast Reconstr Surg. , (2025).
  17. Rubenstein, J., Ferreri, A. J., Pittaluga, S. Primary lymphoma of the central nervous system: epidemiology, pathology and current approaches to diagnosis, prognosis and treatment. Leuk Lymphoma. 49 (1), 43-51 (2008).
  18. Camilleri-Broët, S., et al. A uniform activated B-cell-like immunophenotype might explain the poor prognosis of primary central nervous system lymphomas: analysis of 83 cases. Blood. 107 (1), 190-196 (2006).
  19. Papadopoulos, Z., Herz, J., Kipnis, J. Meningeal lymphatics: from anatomy to central nervous system immune surveillance. J Immunol. 204 (2), 286-293 (2020).
  20. Hoang, T. A., et al. Development and application of a novel cervical lymph collection method to assess lymphatic transport in rats. Front Pharmacol. 14 (1), 1111617(2023).
  21. Licastro, E., et al. Glymphatic and lymphatic communication with systemic responses during physiological and pathological conditions in the central nervous system. Commun Biol. 7 (1), 229(2024).
  22. Sarker, A., et al. Intrathecal [(64)Cu]Cu-albumin PET reveals age-related decline of lymphatic drainage of cerebrospinal fluid. Sci Rep. 13 (1), (2023).
  23. Khang, M., et al. Intrathecal delivery of nanoparticle PARP inhibitor to the cerebrospinal fluid for the treatment of metastatic medulloblastoma. Sci Transl Med. 15 (720), eadi1617(2023).
  24. Pizzo, M. E., et al. Intrathecal antibody distribution in the rat brain: surface diffusion, perivascular transport and osmotic enhancement of delivery. J Physiol. 596 (3), 445-475 (2018).
  25. Yan, J., et al. Lymphatic clearance is the main drainage route of lamotrigine-loaded micelles following delivery to the brain. J Pharm Pharmacol. 71 (10), 1488-1496 (2019).
  26. Ringstad, G., Eide, P. K. Glymphatic-lymphatic coupling: assessment of the evidence from magnetic resonance imaging of humans. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 131(2024).
  27. Pan, W. R., Suami, H., Taylor, G. I. Lymphatic drainage of the superficial tissues of the head and neck: anatomical study and clinical implications. Plast Reconstr Surg. 121 (5), 1614-1624 (2008).
  28. Bou-Assaly, W. The forgotten lymph nodes: review of the superficial head and neck lymphatic system. Radiol Imaging. 1 (1), 9-13 (2016).
  29. Yağmurlu, K., et al. Anatomical features of the deep cervical lymphatic system and intrajugular lymphatic vessels in humans. Brain Sci. 10 (12), 953(2020).
  30. Suami, H., Scaglioni, M. F. Lymphatic territories (lymphosomes) in the rat: an anatomical study for future lymphatic research. Plast Reconstr Surg. 140 (5), 945-951 (2017).
  31. Zawieja, D. C., et al. Lymphatic cannulation for lymph sampling and molecular delivery. J Immunol. 203 (8), 2339-2350 (2019).
  32. Hoang, T. A., et al. Quantifying the lymphatic transport of model therapeutics from the brain in rats. Mol Pharm. 21 (5), 2473-2483 (2024).
  33. Hoang, T. A., et al. Acute neuroinflammation alters the transport of a model therapeutic protein from the brain into lymph and blood. Mol Pharm. 21 (10), 5138-5149 (2024).
  34. Maloveska, M., et al. Dynamics of Evans blue clearance from cerebrospinal fluid into meningeal lymphatic vessels and deep cervical lymph nodes. Neurol Res. 40 (5), 372-380 (2018).
  35. Trevaskis, N. L., et al. The mesenteric lymph duct cannulated rat model: application to the assessment of intestinal lymphatic drug transport. J Vis Exp. (97), e52389(2015).
  36. Gakuba, C., et al. General anesthesia inhibits the activity of the glymphatic system. Theranostics. 8 (3), 710-722 (2018).
  37. Miao, A., et al. Brain clearance is reduced during sleep and anesthesia. Nat Neurosci. 27 (6), 1046-1050 (2024).
  38. Bachmann, S. B., et al. Differential effects of anaesthesia on the contractility of lymphatic vessels in vivo. J Physiol. 597 (11), 2841-2852 (2019).
  39. Ruscic, K. J., Padera, T. P. Silence of the lymphs: some anaesthetic regimens inhibit lymphatic pumping. J Physiol. 597 (11), 2827-2828 (2019).
  40. Dahan, A., et al. The effect of general anesthesia on the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs: comparison between anesthetized and freely moving conscious rat models. Eur J Pharm Sci. 32 (4), 367-374 (2007).
  41. de Jong, W. H., et al. Long-term cannulation of the vena cava of rats for blood sampling: local and systemic effects observed by histopathology after six weeks of cannulation. Lab Anim. 35 (3), 243-248 (2001).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Linf ticos CerebraisCanula o de RatoColeta de LinfaSistema Nervoso CentralDepura o Linf ticaModelo de Neuroinflama oDepura o de F rmacosMedi o do Fluxo Linf tico

Artigos relacionados