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Artigo de investigação
Este estudo identifica a redução da diversidade da microbiota intestinal e as vias metabólicas alteradas no diabetes tipo 2 (T2DM), destacando o aumento de proteobactérias e a diminuição dos táxons benéficos, sugerindo que a disbiose microbiana está associada ao DT2DM e pode contribuir para sua fisiopatologia.
O aumento global do diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) ressalta a necessidade de compreender melhor seus mecanismos biológicos subjacentes, especialmente aqueles envolvendo interações hospedeiro–microbioma. Este estudo teve como objetivo caracterizar a diversidade microbiana intestinal, a composição taxonômica e as vias metabólicas previstas em pacientes recém-diagnosticados com DT2 em comparação com o grupo pareado com não diabéticos (NM). Amostras frescas de fezes foram analisadas usando sequenciamento de rDNA 16S. Diversidade alfa (índices de Chao, ACE, Shannon e Simpson) e diversidade beta foram calculadas para avaliar a estrutura da comunidade microbiana. As diferenças taxonômicas foram avaliadas usando testes de soma de ranks de Wilcoxon e análise discriminante linear tamanho do efeito (LEfSe). A predição das vias funcionais foi realizada usando investigação filogenética de comunidades por reconstrução de estados não observados (PICRUSt2) com base nas anotações KEGG e MetaCyc. A análise de randomização mendeliana (RM), incluindo ponderação inversa de variância, MR-Egger e métodos de mediana ponderada, foi aplicada para avaliar associações geneticamente previstas entre táxons microbianos e DT2DM. Os resultados mostraram redução da riqueza microbiana, refletida por índices mais baixos de Chao e ACE, e alteração da estrutura de diversidade, refletida por índices de Shannon mais baixos e Simpson mais altos, em pacientes com DT2DM, acompanhados por mudanças composicionais significativas. Foi observado aumento da abundância relativa de Proteobactérias e diminuição da abundância de táxons benéficos como Lachnospiraceae e Blautia. A previsão funcional indicou redução da abundância de vias relacionadas à via não oxidativa do fosfato pentose, à biossíntese de isobutanol e à biossíntese da L-isoleucina. A análise por RM forneceu evidências complementares apoiando associações entre táxons microbianos específicos e suscetibilidade ao DT2DM. Em conclusão, a DT2DM está associada à redução da riqueza microbiana, alteração da estrutura da diversidade e mudanças taxonômicas e funcionais distintas. Esses achados destacam a relevância da microbiota intestinal na DM2 e apoiam a potencial utilidade de biomarcadores baseados em microbioma e estratégias terapêuticas. Estudos adicionais são necessários para validar esses achados e esclarecer os mecanismos subjacentes.
O diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) tornou-se uma das doenças crônicas que mais crescem no mundo, impulsionado pela rápida urbanização, padrões alimentares ocidentalizados e estilos de vida cada vez maissedentários 1,2. É um dos principais contribuintes para a morbidade e mortalidade globais e impõe um ônus substancial de saúdepública 3. Embora a suscetibilidade genética tenha um papel, o rápido aumento da incidência de DM tipo 2 destaca a importância dos determinantes ambientais emetabólicos. Identificar mecanismos biológicos modificáveis é, portanto, essencial para melhorar as estratégias de detecção e prevenção precoce. Avanços recentes identificaram a microbiota intestinal como um regulador chave da homeostasemetabólica 5. O ecossistema microbiano intestinal influencia o metabolismo da glicose, a função imunológica, a integridade da barreira intestinal e a inflamação crônica de baixo grau, todos centrais para a patogênese doDT2DM 6. A disbiose tem sido associada à obesidade, resistência à insulina, endotosemia e alteração do balanço energético, sugerindo uma ligação mecanicista entre alterações microbianas e progressãoda doença 7. Além disso, metabólitos microbianos, incluindo ácidos graxos de cadeia curta, ácidos biliares e aminoácidos de cadeia ramificada, foram implicados na modulação da sensibilidade à insulina e do metabolismo dohospedeiro 8.
Embora a acumulação de evidências apoie o papel do microbioma intestinal no DT2DM, a maioria dos estudos existentes baseia-se em desenhos observacionais, que limitam a inferência causal. Abordagens alternativas, como metagenômica shotgun e metabolômica direcionada, podem fornecer insights funcionais de maior resolução, mas frequentemente são limitadas por custo, complexidade computacional e viabilidade limitada em estudos exploratórios ou em escala piloto. Em contraste, o sequenciamento de rDNA 16S é um método econômico e amplamente adotado para perfilar a composição das comunidades microbianas, embora sua resolução taxonômica seja limitada ao nível da espécie e não possa quantificar diretamente metabólitos funcionais. Portanto, o sequenciamento 16S rDNA foi selecionado para este estudo como uma abordagem escalável e custo-efetiva, adequada para coortes clínicas exploratórias, permitindo a integração com previsão funcional a jusante e estruturas analíticas complementares. Portanto, integrar o perfil microbiano baseado em 16S com a previsão funcional da bioinformática e abordagens complementares, como a randomização mendeliana (MR), pode fornecer uma estrutura equilibrada para explorar tanto relações composicionais quanto potencialmente causais.
Notavelmente, ainda há uma relativa falta de dados focados especificamente em pacientes recém-diagnosticados e com DM T2 sem tratamento. Nessas populações, alterações microbianas têm menos probabilidade de serem confundidas por intervenções farmacológicas, especialmente a metformina, que é conhecida por remodelar significativamente a composição e a função da microbiotaintestinal 9. Isso representa uma lacuna importante na literatura atual, já que muitos estudos existentes incluem populações heterogêneas de pacientes com diferentes exposições ao tratamento e integração limitada do perfil do microbioma com abordagens analíticas geneticamente informadas.
Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar a diversidade da microbiota intestinal, a composição taxonômica e as vias funcionais previstas em pacientes recém-diagnosticados com DT2 em comparação com o grupo NM, utilizando sequenciamento de rDNA 16S e análise bioinformática. Além disso, a randomização mendeliana foi aplicada usando dados de associação genômica amplamente disponíveis publicamente para explorar possíveis associações geneticamente previstas entre táxons microbianos específicos e o risco de DT2DM. Essa estratégia analítica combinada permite insights complementares a partir do perfil de comunidades microbianas e dados genéticos em nível populacional. Especificamente, o sequenciamento de rDNA 16S fornece caracterização direta da composição microbiana na população estudada, enquanto a randomização mendeliana utiliza instrumentos genéticos de coortes independentes para avaliar se as associações observadas são consistentes com relações geneticamente previstas. Essa integração tem como objetivo abordar uma limitação fundamental dos estudos observacionais do microbioma, fornecendo evidências complementares que apoiem a robustez das associações microbiota–T2DM. Portanto, a integração dessas abordagens visa proporcionar validação cruzada, e não redundância, fortalecendo assim a interpretabilidade das associações microbiota–T2DM.
O presente estudo foca em três aspectos. Primeiro, avalia alterações na microbiota intestinal em pacientes recém-diagnosticados e com DMT T2 sem tratamento, para reduzir a confusão causada por intervenções farmacológicas. Segundo, integra o perfilamento taxonômico com vias funcionais previstas para fornecer uma visão em nível sistêmico das mudanças metabólicas associadas à microbiota. Terceiro, incorpora análise de randomização mendeliana para avaliar se as associações observadas são consistentes com relações geneticamente previstas, fornecendo assim triangulação metodológica. Coletivamente, esses aspectos fornecem uma estrutura complementar e reprodutível para a análise do microbioma, em vez de um estudo puramente descritivo, distinguindo este trabalho de estudos anteriores que normalmente dependem de desenhos observacionais de método único e não integram perfilamento microbiano, predição funcional e inferência geneticamente informada dentro de um arcabouço analítico unificado.
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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética do Hospital Chongqing Chenjiaqiao (aprovação nº 20240131). Foi obtido consentimento informado por escrito de todos os participantes antes da coleta da amostra. Todas as amostras de fezes e informações dos participantes foram tratadas usando códigos de estudo desidentificados, conforme listado na Tabela de Materiais.
Triagem e inscrição dos participantes
Pacientes recém-diagnosticados com DM T2 que visitaram o Hospital Chongqing Chenjiaqiao entre junho de 2023 e dezembro de 2023 foram avaliados quanto à elegibilidade. Os participantes foram inscritos no grupo DM se tivessem entre 20 e 65 anos de idade, tivessem um novo diagnóstico de DMT2, concordassem em fornecer uma amostra fresca de fezes e completassem a avaliação do histórico médico e exames clínicos obrigatórios. Voluntários saudáveis recrutados no mesmo período foram incluídos como o grupo pareado para não diabéticos (NM) e foram pareados com o grupo DM o mais próximo possível em relação à idade, sexo e características demográficas gerais. Os participantes foram excluídos se apresentassem distúrbios hematológicos, doenças do sistema nervoso central, doença reumática ativa, doença autoimune, infecção gastrointestinal aguda ou crônica, diarreia crônica, constipação, úlcera gastrointestinal ativa ou em cicatrização, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, tuberculose intestinal, tumores gastrointestinais, outras malignidades, insuficiência cardíaca grave, insuficiência hepática grave, insuficiência renal grave, outros metabólicos graves doenças, desnutrição, imunodeficiência, distúrbios metabólicos congênitos, doenças psiquiátricas, uso de sedativos-hipnóticos ou abuso de drogas. Os participantes também foram excluídos se tivessem recebido antibióticos, agentes supressores de ácido, medicamentos para motilidade gastrointestinal, probióticos, glicocorticoides ou imunossupressores dentro de 1 mês antes da coleta das fezes. Além disso, indivíduos que tiveram diarreia, passaram por cirurgia gastrointestinal ou endoscopia gastrointestinal, ou relataram mudanças súbitas no ambiente de vida ou hábitos alimentares dentro de 1 mês antes da coleta de fezes foram excluídos. Um código único de estudo foi atribuído a cada participante elegível antes da coleta da amostra. Da coorte elegível, 12 participantes recém-diagnosticados com DT2 e 12 NM foram selecionados para sequenciamento posterior do rDNA 16S e análises do microbioma, baseadas na disponibilidade de amostras e nos requisitos de qualidade do sequenciamento.
Coleta e armazenamento de amostras de fezes
Cada participante recebeu um recipiente estéril para coleta de fezes, rotulado apenas com o código de estudo atribuído para garantir a desidentificação. Os participantes foram instruídos a esvaziar a bexiga antes da defecação para minimizar a contaminação da urina e coletar fezes frescas diretamente no recipiente estéril, sem contato com água do vaso, urina, desinfetantes ou outros potenciais contaminantes. Imediatamente após a coleta, aproximadamente 1–2 g de fezes foram transferidos para um tubo criogênico estéril usando uma colher de amostragem descartável estéril. O tubo era bem vedado e imediatamente colocado sobre gelo seco ou em um recipiente de transferência pré-resfriado. Todas as amostras foram transportadas para o laboratório em até 2 horas após a coleta. Ao chegar ao laboratório, o código do estudo foi verificado e cada tubo foi inspecionado quanto a vazamentos ou contaminação visível. Os tempos de coleta e armazenamento foram registrados para todas as amostras. Amostras de fezes eram posteriormente armazenadas a −80 °C até a extração genômica de DNA. As amostras foram consideradas aceitáveis para análise a jusante somente se permanecessem completamente congeladas durante o armazenamento e transporte e não apresentassem evidências de vazamento de tubos ou contaminação externa.
Extração de DNA genômico
Amostras de fezes eram retiradas do armazenamento a −80 °C e colocadas no gelo antes do processamento. Cada amostra foi descongelada apenas até que a homogeneização fosse possível para minimizar a degradação associada a ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. Aproximadamente 200 mg de fezes foram transferidos para um tubo estéril de microcentrífuga, e o tampão de lise fornecido no kit de extração de DNA das fezes foi adicionado conforme as instruções do fabricante listadas na Tabela de Materiais. As amostras foram vórtices vigorosamente por 30 segundos para alcançar a homogeneização completa e depois incubadas em temperatura ambiente por 5–10 minutos para facilitar a lise celular. Após a lise, as amostras foram centrifugadas a 12.000 × g . por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi cuidadosamente transferido para um novo tubo estéril de microcentrífuga sem perturbar o pellet. O DNA genômico foi posteriormente eluído usando o tampão de elução fornecido com o kit ou água sem nuclease, conforme o protocolo do fabricante. O DNA extraído era armazenado a −20 °C para uso de curto prazo ou a −80 °C para preservação a longo prazo. Amostras de DNA consideradas adequadas para análise a jusante pareceram claras e livres de partículas visíveis.
Avaliação da qualidade do DNA
A qualidade do DNA foi avaliada usando eletroforese em gel de agarose e quantificação baseada em fluorescência. Um gel de agarose a 1% foi preparado em tampão de eletroforese, e as amostras de DNA extraídas, misturadas com tampão de carga, foram carregadas nos poços de gel. A eletroforese era realizada até que as bandas de DNA fossem adequadamente separadas, após o que o gel era examinado sob iluminação ultravioleta ou azul. A integridade do DNA foi considerada aceitável quando uma faixa genômica intacta foi observada sem degradação marcada ou borrão excessivo. A concentração de DNA foi posteriormente quantificada usando um sistema de quantificação de DNA baseado em fluorescência. As amostras foram então diluídas até a concentração necessária para amplificação de PCR a jusante. Amostras de DNA de alta qualidade tipicamente apresentavam uma faixa distinta na eletroforese em gel de agarose e eram suficientemente concentradas para procedimentos subsequentes de amplificação.
Amplificação por PCR da região 16S rDNA V3–V4
A região hipervariável V3–V4 do rDNA bacteriano 16S foi amplificada usando primers com código de barras. As sequências de espoletas eram as seguintes: espolvador dianteiro 5′-ACTCCTACGGGGAGAG-3′ e primer reverso 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. Reações de PCR foram preparadas em gelo em um volume final de 20 μL contendo 4 μL de tampão de PCR, 2 μL de mistura de nucleotídeos (2,5 mmol/L), 0,8 μL de espoletas diretas e reversas (5 μmol/L), 0,4 μL de DNA polimerase de alta fidelidade, 10 ng de DNA molde e água sem nuclease até o volume. As misturas de reação eram suavemente misturadas por pipeteamento e brevemente centrifugadas para coletar o líquido no fundo do tubo. A amplificação por PCR foi realizada usando as seguintes condições de ciclo: desnaturação inicial a 95 °C por 5 minutos, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 30 s, com um passo final de extensão a 72 °C por 10 min. Para minimizar o viés de amplificação, cada amostra era amplificada em reações triplicadas, e os produtos de PCR resultantes da mesma amostra eram posteriormente agrupados em um único tubo. A amplificação bem-sucedida foi confirmada pela presença de uma faixa clara de amplicão do tamanho esperado na eletroforese em gel de agarose.
Verificação e purificação de produtos por PCR
Produtos de PCR foram verificados usando eletroforese em gel de agarose a 2%. Os produtos combinados de PCR de cada amostra foram carregados no gel e eletroforizados até que as bandas do amplicão alvo ficassem claramente separadas. As faixas correspondentes ao tamanho esperado do amplicão foram removidas usando uma lâmina estéril limpa e purificadas com um kit de extração em gel, conforme as instruções do fabricante listadas na Tabela de Materiais. Produtos de PCR purificados foram posteriormente eluídos em tampão de elução ou água livre de nuclease. A concentração de cada produto purificado de PCR foi quantificada usando um sistema de quantificação de DNA baseado em fluorescência, e os valores de concentração foram registrados para preparação posterior da biblioteca. Amplificação e purificação bem-sucedidas foram confirmadas por uma única faixa transparente no tamanho esperado do amplicão na eletroforese em gel de agarose.
Preparação e agrupamento de bibliotecas
As bibliotecas de sequenciamento foram preparadas usando um kit de preparação de biblioteca de DNA de acordo com as instruções do fabricante listadas na Tabela de Materiais. Sequências adaptadoras de sequenciamento foram ligadas aos amplicons purificados seguindo o fluxo padrão de preparação de bibliotecas. Produtos ligados por adaptador eram posteriormente purificados usando extração em gel ou um método de purificação baseado em esferas, dependendo do protocolo de preparação da biblioteca selecionado. Produtos purificados da biblioteca foram avaliados usando eletroforese em gel de agarose a 2% para confirmar a distribuição adequada dos fragmentos. As concentrações da biblioteca foram quantificadas usando um sistema de quantificação de DNA baseado em fluorescência. Com base na concentração de DNA e no tamanho dos fragmentos, cada biblioteca foi normalizada para a mesma concentração molar para garantir uma profundidade equilibrada de sequenciamento entre as amostras. Quantidades iguais de molares de bibliotecas individuais foram então agrupadas em uma proporção de 1:1 para gerar o pool final de bibliotecas de sequenciamento. Antes do sequenciamento, a biblioteca agrupada era desnaturada de acordo com o protocolo da plataforma de sequenciamento antes do carregamento da amostra. Bibliotecas consideradas adequadas para sequenciamento apresentaram uma distribuição clara de fragmentos dentro da faixa de tamanho esperada e concentração suficiente para análise de sequenciamento a jusante.
Sequenciamento de extremidades pareadas
A biblioteca final em pool era carregada em uma plataforma de sequenciamento de extremidade pareada de acordo com os procedimentos operacionais padrão do fabricante. O sequenciamento de extremidades pareadas foi realizado usando uma configuração de execução de 2 × 250 pbp ou 2 × 300 pb, garantindo profundidade adequada de sequenciamento para caracterização abrangente da diversidade microbiana em cada amostra. A qualidade do sequenciamento foi monitorada durante toda a execução usando métricas de qualidade geradas pela plataforma. Após a conclusão do sequenciamento, arquivos FASTQ em bruto de ponta pareada foram exportados para cada amostra para análise bioinformática posterior. Conjuntos de dados de sequenciamento foram considerados aceitáveis quando demonstraram profundidade de leitura suficiente por amostra, pontuações de qualidade adequadas no Q30 e atribuição bem-sucedida de códigos de barras.
Processamento de sequências brutas
Arquivos FASTQ brutos de ponta pareada eram importados para uma pipeline de análise de bioinformática do microbioma para processamento posterior. As sequências foram desmultiplexadas com base nos códigos de barras atribuídos a cada amostra. Posteriormente, foi realizada filtragem de qualidade para remover leituras contendo pontuações de baixa qualidade, bases ambíguas ou artefatos de sequenciamento. Bases de baixa qualidade localizadas nas extremidades das leituras foram cortadas com base na distribuição de pontuação de qualidade para melhorar a confiabilidade geral da sequência. Após o controle de qualidade, leituras de extremidades pareadas foram mesclaras entre regiões sobrepostas para reconstruir sequências de comprimento completo. Apenas sequências fundidas de alta qualidade foram mantidas para análises subsequentes do microbioma.
Geração de variantes de sequência de amplicons (ASV) e anotação taxonômica
A redução de ruído de sequência foi realizada usando um algoritmo validado de desruído, incluindo DADA2 ou Deblur, para corrigir erros de sequenciamento e melhorar a precisão da sequência. Sequências quiméricas foram identificadas e removidas durante o processo de redução de ruído. Sequências representativas de ASV e tabelas correspondentes de abundância de ASV foram posteriormente geradas para cada amostra. A atribuição taxonômica das sequências ASV foi realizada usando um classificador Naive Bayes, e a anotação taxonômica foi realizada com base de dados de referência SILVA 138. Tabelas taxonômicas de abundância foram exportadas nos níveis de filo, família e gênero para análise a jusante. O conjunto final de dados ASV incluiu sequências representativas, informações de abundância e anotações taxonômicas correspondentes para cada amostra.
Análise de diversidade alfa e beta
Índices de diversidade alfa, incluindo os índices de Chao, ACE, Shannon, Simpson e Coverage, foram calculados para avaliar a diversidade e riqueza microbiana dentro da amostra. Os índices de diversidade alfa foram expressos como média ± desvio padrão. A normalidade dos dados foi avaliada usando o teste de Shapiro–Wilk. Variáveis normalmente distribuídas foram comparadas entre os grupos DM e NM usando os testes t de Student, enquanto variáveis normalmente distribuídas foram analisadas usando testes de soma de ranks de Wilcoxon. As distâncias de diversidade beta foram posteriormente calculadas usando uma matriz de distâncias adequada para avaliar diferenças na composição das comunidades microbianas entre amostras. A análise de coordenadas principais (PCoA) foi realizada para visualizar diferenças na estrutura da comunidade microbiana entre os grupos. Além disso, foi realizada uma análise de similaridades (ANOSIM) para determinar se diferenças entre grupos excediam a variação intragrupo, e os valores correspondentes de R e p do ANOSIM foram reportados. A análise de diversidade alfa refletiu a diversidade microbiana dentro da amostra, enquanto a análise de diversidade beta avaliou diferenças na composição das comunidades microbianas entre os grupos.
Análise taxonômica diferencial
A composição das comunidades microbianas foi resumida nos níveis de filo, família e gênero. Gráficos de barras empilhadas foram gerados para visualizar a abundância relativa dos táxons dominantes em amostras individuais e grupos de estudo. Curvas Pan/Core e diagramas de Venn foram ainda construídos para comparar ASVs compartilhados e específicos de grupo entre os grupos DM e NM. As diferenças na abundância de táxons entre os grupos foram avaliadas usando testes de soma de ranks de Wilcoxon. Posteriormente, a análise de LEfSe foi realizada para identificar táxons microbianos que contribuíram mais fortemente para a discriminação entre grupos. A análise taxonômica diferencial permitiu a identificação de táxons microbianos enriquecidos tanto no grupo DM quanto no NM.
Previsão funcional
PICRUSt2 ou um pipeline de predição funcional validado equivalente foi usado para inferir vias funcionais microbianas a partir de perfis de sequenciamento 16S rDNA. Os dados de abundância de ASV foram normalizados de acordo com os requisitos do pipeline analítico selecionado, e as funções previstas foram mapeadas para anotações de vias KEGG ou MetaCyc. As abundâncias previstas das vias foram posteriormente comparadas entre os grupos DM e NM. Caminhos significativamente diferentes foram visualizados usando mapas de calor ou outras abordagens gráficas apropriadas. As funções previstas foram interpretadas como potencial metabólico microbiano inferido, em vez de uma abundância metabólica medida diretamente. A análise de predição funcional permitiu a identificação de vias microbianas candidatas que diferiam entre grupos, incluindo vias associadas ao metabolismo de carboidratos e aminoácidos.
Análise de randomização mendeliana
Estatísticas resumidas do estudo de associação genômica ampla (GWAS) para microbiota intestinal foram obtidas a partir de conjuntos de dados públicos10. Dados de associação significativa em todo o genoma para táxons microbianos foram recuperados do Catálogo GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) do NHGRI-EBI usando números de acesso que variam de GCST90032172 a GCST90032644. Dados metagenômicos adicionais foram acessados da coorte FINRISK 2002 por meio do European Genome-Phenome Archive (Research ID: EGAS00001005020). Estatísticas resumidas GWAS para diabetes mellitus tipo 2 também foram obtidas do Catálogo GWAS do NHGRI-EBI (número de acesso: ebi-a-GCST006867). Variantes genéticas associadas a táxons microbianos foram selecionadas como variáveis instrumentais de acordo com limiares estatísticos pré-definidos, e variantes no desequilíbrio de ligação foram excluídas. Os conjuntos de dados de exposição e desfechos foram harmonizados para garantir uma orientação consistente dos alelos. A análise de randomização mendeliana foi posteriormente realizada usando o método ponderado por variância inversa (IVW) como abordagem analítica principal. Análises de sensibilidade foram realizadas usando os métodos de MR-Egger e mediana ponderada. A força do instrumento foi avaliada usando estatística F, enquanto a heterogeneidade entre variáveis instrumentais foi avaliada usando o teste Q de Cochran. A pleiotropia horizontal foi examinada usando o teste de interceptação MR-Egger. A correção de Bonferroni foi aplicada para considerar múltiplas comparações. Os achados da randomização mendeliana foram interpretados como associações geneticamente previstas, em vez de evidências definitivas de causalidade.
Saída de dados e ponto final
Os resultados analíticos finais incluíram tabelas de abundância de ASV, gráficos de composição taxonômica, métricas de diversidade alfa, análises de diversidade beta, resultados taxonômicos diferenciais, perfis de vias funcionais previstos e estimativas de randomização mendeliana. Todos os identificadores amostrais nos conjuntos de dados de sequenciamento foram verificados para garantir consistência com os códigos de estudo desidentificados correspondentes. Arquivos de sequenciamento bruto, tabelas ASV processadas, resultados estatísticos e arquivos fonte de figuras eram arquivados para análise a jusante e gerenciamento de dados. O protocolo foi considerado completo após a geração e verificação com sucesso de dados de sequenciamento de alta qualidade, perfis taxonômicos, métricas de diversidade, análises previstas de vias funcionais e resultados de randomização mendeliana (Mendelian).
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As características demográficas e clínicas de base da coorte clínica inicialmente selecionada são apresentadas na Tabela 1. Um subgrupo representativo composto por 12 participantes recém-diagnosticados com DT2 e 12 NM foi posteriormente selecionado para sequenciamento de 16S rDNA e análises do microbioma a jusante.
Avaliação da profundidade do sequenciamento
O índice de Shannon foi calculado, e a cu...
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Nos últimos anos, o microbioma humano, especialmente o microbiota intestinal, emergiu como um fator complexo e influente no metabolismo do hospedeiro, regulação imune e desenvolvimento de doenças. Em um hospedeiro saudável, a microbiota intestinal contribui para a homeostase imune e para a integridade da barreira intestinal11. A disbiose tem sido associada a uma variedade de condições patológicas, incluindo distúrbios metabólicos, doenças autoimunes e
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Os autores afirmam que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES:
Linrui Xie e Kemiao Chen realizaram a análise de dados e redigiram o manuscrito. Xican Pan participou da coleta de amostras e procedimentos experimentais. Xuemei Zhong e Xiaoyu Li conceberam e desenharam o estudo, supervisionaram o projeto e revisaram criticamente o manuscrito. Todos os autores revisaram e aprovaram o manuscrito final.
Os autores agradecem a todos os participantes e funcionários envolvidos na coleta de amostras e no processamento de dados por suas contribuições a este estudo.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | Primers universais para a região 16S bacteriana |
| Freezer de 80 °C | Haier Biomedical | DW-86L626 | Armazenamento de amostras a longo prazo |
| Sistema de Gel de Agarose (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | Validação do produto PCR |
| AmpliPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Purificação de DNA e seleção de tamanho |
| Tubos de Bead-beating (Lysing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | Lisado mecânico de células microbianas |
| Estação de Trabalho de Bioinformática | Dell | Precision 7920 | Análise de dados usando QIIME2 e R |
| Pipeline DADA2 | Bioconductor | Versão 1.28 | Denoising de sequência e geração de ASV; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Versão 2023.5 | Denoising de sequência e correção de erros; https://docs.qiime2.org |
| Arquivo de Genoma-Fenótipo Europeu | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | Repositório público de conjunto de dados metagenômicos; https://ega-archive.org |
| GWAS Catalog | NHGRI-EBI | Acessos GCST90032172–GCST90032644 | Banco de dados público de estatísticas de associação genômica ampla; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Sistema de Sequenciamento Illumina MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Plataforma de sequenciamento de alto rendimento |
| Banco de dados KEGG | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | Versão 107 | Banco de dados de anotação de via funcional; https://www.genome.jp/kegg |
| Banco de dados MetaCyc | SRI International | Versão 27.1 | Banco de dados de via metabólica; https://metacyc.org |
| Microcentrifuga | Eppendorf | 5424R | Centrífuga de resfriamento para preparação de amostra |
| Kit de Preparação de Biblioteca Nextera XT | Illumina | 20018705 | Preparação de biblioteca para sequenciamento |
| Mistura Master PCR (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | Para PCR de alta fidelidade |
| Termociclador PCR | Bio-Rad | T100 | Instrumento de amplificação PCR |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Development Team | Versão 2.5.2 | Predição de via funcional a partir de dados de sequenciamento 16S rDNA; https://github.com/picrust/picrust2 |
| KIT QIAamp Fast DNA Stool Mini | QIAGEN | 51504 | Extração de DNA de amostras de fezes |
| KIT de Extração de Gel QIAquick | QIAGEN | 28704 | Purificação de DNA de gel de agarose |
| Fluorômetro Qubit | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantificação de DNA |
| Software R | R Foundation for Statistical Computing | Versão 4.3.1 | Análise estatística e análise de randomização mendeliana; https://www.r-project.org |
| Banco de dados SILVA 138 | SILVA ribosomal RNA database project | Versão 138 | Banco de dados de referência para anotação taxonômica; https://www.arb-silva.de |
| Tubo de Coleta de Fezes | Sarstedt | 76.9923.001 | Tubo de coleta de espécime de fezes estéril |
| KIT de DNA de Fezes | Omega | D4015-02 | KIT de extração de DNA |
| Pacote TwoSampleMR | MR-Base | Versão 0.5.7 | Análise de randomização mendeliana em R; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |